Панраковый биоинформатический анализ в сочетании с экспериментальной валидацией рака толстой кишки: исследование TMED3 как диагностического и прогностического биомаркера

Краткое содержание

Этот протокол сочетает панраковый биоинформатический анализ с иммуногистохимической валидацией при раке толстой кишки для оценки экспрессии трансмембранного Emp24 Protein Transport Domain 3, прогностической значимости, иммунных ассоциаций и связанных биологических путей с использованием публичных мультиомических баз данных и клинических образцов тканей.

Аннотация

Трансмембранный домен транспорта белков Emp24 3 (TMED3), представитель семейства белков p24, был причастен к пролиферации, инвазии и миграции опухолей. Целью данного исследования было оценить паттерны экспрессии, прогностическую значимость, иммунные ассоциации и потенциальные биологические функции TMED3 при различных типах рака с использованием панракового биоинформатического анализа в сочетании с иммуногистохимической валидацией (IHC) при раке толстой кишки. Были проанализированы мультиомические наборы данных из баз данных The Cancer Genome Atlas, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas и cBioPortal для изучения экспрессии TMED3 и генетических изменений при панраковой инфекции. Иммуногистохимия была проведена для оценки экспрессии белка TMED3 в тканях рака толстой кишки. Для оценки прогностической ценности TMED3 использовались анализ выживаемости Каплана–Мейера и регрессионный анализ Кокса. Был проведён анализ корреляции по методу Спирмана для оценки связей TMED3 с мутационной нагрузкой опухоли, микросателлитной нестабильностью (MSI), инфильтрацией иммунных клеток и иммунными контрольными точками. Анализ обогащения наборов генов был проведён для изучения возможных биологических путей, связанных с TMED3 при раке толстой кишки. Экспрессия TMED3 была повышена у большинства типов опухолей и была связана с неблагоприятной общей выживаемостью и специфической выживаемостью при адренокортикальной карциноме, аденокарциноме толстой кишки и увеальной меланоме. Наибольшая частота генетических изменений TMED3 была выявлена при мезотелиоме, при этом амплификация представляла собой преобладающий тип изменений. Кроме того, экспрессия TMED3 показала значимую корреляцию с мутационной нагрузкой опухолей и микросателлитной нестабильностью при карциноме почек и почечной прозрачной клеточной карциноме, аденокарциноме желудка и эндометриальной карциноме матки. Экспрессия TMED3 также была связана с иммунной инфильтрацией и экспрессией иммунных контрольных точек в нескольких опухоли. Анализ IHC показал повышенную экспрессию TMED3 в тканях рака толстой кишки по сравнению с нормальными тканями толстой кишки и выявил связь со стадией Т. Анализ функционального обогащения выявил пути, связанные с рибосомами, обработкой и презентацией антигенов, окислительным фосфорилированием и пентозофосфатом. Эти результаты указывают на то, что TMED3 может представлять собой перспективный биомаркер для диагностики и прогностической оценки рака толстой кишки, а также других типов опухолей.

Введение

Семейство белков с трансмембранным доменом Emp24 (TMED) состоит из четырёх подсемейств (α, β, γ и δ), которые обычно существуют в виде мономеров, димеров или олигомерных комплексов в эукариотических клетках. Члены семейства TMED участвуют в внутриклеточной транспортировке везикулов и были причастны к различным заболеваниям человека, включая рак, иммунные расстройства, диабет, нейродегенеративные заболевания, неалкогольную жировую болезнь печени, дилатационную кардиомиопатию, болезнь почек муцина 1 (MKD) и синдром Шегрена (SS)¹. Трансмембранный белок emp24 с доменом 3 (TMED3), принадлежащий к семейству белков p24, является высококонсервативным однопроходным трансмембранным белком типа I, кодируемым на хромосоме 15q25.1^{у человека 2,3}. Накопленные данные показали, что TMED3 экспрессируется аномально в нескольких злокачественных опухоках и участвует в инициации, пролиферации, инвазии, метастазах и прогрессировании опухоли. Повышенная экспрессия TMED3 была зарегистрирована при^{остеосаркоме 4}, плоскоклеточной карциноме^{лёгких 5},^{раке молочной железы 6}, эндометриальной^{карциноме 7} и колоректальном^{раке 8}. Экспериментальные исследования показали, что подавление экспрессии TMED3 подавляет пролиферацию опухолевых клеток, метастатическую способность и антиапоптотическую активность, тем самым сдерживая прогрессирование опухоли. При глиоме гиперэкспрессия TMED3 связана с более высокой степенью опухоли и худшим прогнозом, а TMED3 способствует прогрессированию глиобластомы через регуляцию ZBTB7A⁹. Хотя предыдущие исследования изучали биологическую роль TMED3 в конкретных типах опухолей, его экспрессионные паттерны, прогностическая значимость и молекулярные функции в панраковых заболеваниях пока не были систематически охарактеризованы.

Недавние достижения в мультиомических базах данных и биоинформатическом анализе позволили систематически оценивать экспрессию генов, прогноз, иммунные характеристики и молекулярные изменения различных типов опухолей. По сравнению с одиночными когортными исследованиями, интегрированный панраковый анализ с использованием общедоступных баз данных предоставляет более широкий подход к выявлению потенциальных биомаркеров и терапевтических мишеней у разных видов рака. В настоящем исследовании были проведены комплексные биоинформатические анализы для изучения роли TMED3 в различных типах рака с использованием общедоступных мультиомических баз данных, включая Атлас генома рака (TCGA), экспрессию генотипов тканей (GTEx), UALCAN, Атлас человеческого белка и cBioPortal. В исследовании систематически оценивались паттерны экспрессии TMED3, клиникопатологические характеристики, прогностическая значимость, иммунно-связанные ассоциации и потенциальные биологические функции при панраковой инфекции. Кроме того, иммуногистохимический (IHC) анализ был проведён в тканях рака толстой кишки для подтверждения экспрессии белка TMED3 и его связи с клиникопатологическими особенностями. Наш панраковый анализ служит стратегией скрининга для выявления кандидатов на биомаркеры. Затем мы провели экспериментальную валидацию именно при колоректальном раке (CRC). Результаты показывают, что TMED3 является перспективным прогностическим биомаркером при CRC, хотя его значимость для других типов рака требует дальнейших исследований.

Протокол

Все процедуры, связанные с человеческими тканями, проводились в соответствии с институциональными нормами биобезопасности и этическими нормами, а также в сертифицированном биологическом корпусе безопасности. Протокол исследования был утверждён Комитетом по этике исследований Центральной больницы Таншань (No TZYL/K/2023-16), и письменное информированное согласие было получено от всех участников до сбора образца.

Сбор данных
Данные профиля экспрессии TMED3 из различных опухолевых и неспаренных нормальных тканей были получены из баз данных TCGA^{и GTEx 10,11} (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; дата обращения: 1 июля 2025 года). Для анализа дифференциальной экспрессии TMED3 между опухолями и непарными нормальными тканями проводились тесты с ранговой суммой Уилкоксона. Для последующих анализов использовались нормализованные матрицы секвенирования РНК с нормой транскрипта на миллион (TPM), загруженные из UCSC Xena. Значения выражения были гармонизированы с помощью преобразования log₂ (TPM + 1) до проведения статистического анализа. Данные экспрессии TMED3 для 33 типов опухолей и соответствующих нормальных тканей впоследствии были скачаны из базы данных TCGA. Для оценки дифференциальной экспрессии TMED3 между опухолями и соответствующими нормальными тканями использовались тесты Уилкоксона с подписью. Дифференциальная экспрессия белков TMED3 между опухолями и нормальными тканями была получена из базы данных^{UALCAN 12} (http://ualcan.path.uab.edu; доступ 1 июля 2025 года). Был использован модуль анализа протеомики, и для анализа была выбрана опция «Панраковое представление». Анализ экспрессии белков проводился с использованием наборов данных CPTAC, доступных через модуль UALCAN «Pan-cancer» с настройками платформы по умолчанию и без дополнительной фильтрации образцов.

Анализ клиникопатологических признаков
Была собрана клиникакопатологическая информация из 33 типов опухолей в базе данных TCGA для изучения связи между экспрессией TMED3 и патологической стадией. Стадии опухоли были классифицированы на ранние стадии (стадия I–II) и продвинутую стадию (стадии III–IV). Различия в экспрессии TMED3 между группами стадей оценивались с помощью тестов Wilcoxon с суммой ранга для различных типов рака.

Прогностический анализ
Для прогностического анализа были получены данные о времени выживаемости и статусе выживаемости из 33 типов опухолей. Обычные случаи и случаи без клинической информации были исключены. Отсутствующие значения обрабатывались в зависимости от отсутству каждой переменной. Экспрессия TMED3 была разделена на группы с высокой и низкой экспрессией в зависимости от медианного значения экспрессии. Пакет выживания (версия 3.2-7) в программном обеспечении статистического анализа R (версия 4.2.1) использовался для проведения регрессионного анализа пропорциональных рисков Кокса. Результаты визуализировались с помощью пакетов survminer и ggplot2. Общая выживаемость (ОС) определялась как интервал от диагноза до смерти по любой причине, тогда как выживаемость, специфичная для заболевания (ДСС) — как интервал от диагноза до смерти, обусловленный конкретным раком, при этом смерти, не связанные с злокачественным опухольем, рассматривались как цензурированные события. Впоследствии были проведены анализы выживаемости Каплана–Мейера для оценки взаимосвязи между экспрессией TMED3 и OS и DSS при аденокарциноме толстой кишки (COAD).

Анализ мутаций
База данных cBioPortal (www.cbioportal.org; доступ 5 июля 2025 года) использовалась для анализа частоты генетических изменений TMED3 в 33 видах рака^{типа 13}. Был открыт сайт cBioPortal, и в строку быстрого поиска была введена функция «TMED3» для анализа профиля мутаций TMED3 по нескольким типам рака. Генетические изменения TMED3 в основном включали мутации, амплификацию, глубокую делецию и множественные изменения. Стандартные панраковые исследования и настройки запросов, доступные в cBioPortal, использовались для анализа мутаций без дополнительной фильтрации.

Корреляционный анализ метилирования ДНК
Анализ метилирования ДНК был проведён для оценки статуса метилирования промоторов TMED3 в опухолях и нормальных тканях с использованием базы данных UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/; доступ 5 июля 2025 года). Статус метилирования ДНК в области промотора TMED3 был проанализирован с использованием данных уровня 3 метилирования, полученных с платформы Illumina Infinium HumanMethylation450K в TCGA. Уровни метилирования выражались в β значениях, рассчитываемых как β = интенсивность метилированного зонда / (интенсивность метилированного зонда + неметилированная интенсивность), при этом значения варьировались от 0 (неметилированный) до 1 (полностью метилированный). Для оценки статуса метилирования промотора были проанализированы зонды CpG, расположенные в пределах 1500 п.п. выше точки начала транскрипции (TSS), включая TSS200 и TSS1500 области, определённые UALCAN. UALCAN автоматически извлекал все доступные CpG-зонды в промоторной области целевого гена без дополнительной фильтрации. Были получены значения метилирования β из панраковых и нормальных тканей, а также проведены непарные двухобразные тестостеронные тесты для сравнения различий между группами. Был использован порог значимости α = 0,05, а P < 0,05 считался статистически значимым.

Анализ взаимосвязи между TMED3, мутационной нагрузкой опухолей и микросателлитной нестабильностью
Были проанализированы мутационное бремя опухолей (TMB) и микросателлитная нестабильность (MSI) для изучения их связи с экспрессией TMED3 у различных типов рака. Равномерно обработанные панраковые наборы данных были скачаны из базы данных UCSC Xena (https://xenabrowser.net/; доступ 5 июля 2025 года), а для последующих анализов были извлечены профили экспрессии TMED3. Данные о вариации простых нуклеотидов уровня 4 для образцов TCGA, полученные с помощью MuTect2, были получены из базы данных Genomic Data Commons (GDC) (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴. Данные выражений TMED3 интегрировались с наборами данных TMB, а значения выражений нормализовались с помощью преобразования log₂(x + 1) до проведения статистического анализа. Результаты MSI для отдельных типов опухолей были собраны из ранее опубликованных^{исследований 15} и впоследствии объединены с данными экспрессии TMED3 после той же процедуры нормализации. Связи между экспрессией TMED3 и TMB/MSI оценивались с помощью корреляционного анализа Спирмана в панраковых наборах^{данных 16,17}.

Анализ иммунных характеристик TMED3
Алгоритм ESTIMATE применялся для расчёта стромальных оценок, иммунных и ESTIMATE для нескольких типов опухолей. Показатели инфильтрации строма и иммунной инфильтрации в панраковых наборах данных были получены с помощью оценочного пакета (версия 1.0.13) в программном обеспечении для статистического анализа. Различия в стромальном, иммунном балле и ESTIMATE между группами с высокой и низкой экспрессией TMED3 оценивались с помощью тестов с суммой ранга Уилкоксона. Кроме того, были проведены анализы, связанные с иммунными контрольными точками, для изучения взаимосвязи между экспрессией TMED3 и молекулами иммунных контрольных точек, включая программируемый белок клеточной смерти 1 (PD-1), программированный лиганд смерти 1 (PD-L1) и цитотоксический T-лимфоцитарно-ассоциированный белок 4 (CTLA4), при различных типах рака. Данные о экспрессии STAR-count и соответствующая клиническая информация для COAD были скачаны из базы данных TCGA. Матрицы экспрессии в формате TPM были извлечены и нормализованы с помощью преобразования log₂ (TPM + 1). Профили экспрессии восьми генов, связанных с иммунными контрольными точками, были получены из образцов COAD, а корреляции между экспрессией TMED3 и маркерами иммунных контрольных точек были проанализированы с помощью корреляционного анализа Спирмана.

Анализ чувствительности к лекарствам
Анализ чувствительности лекарств проводился с использованием платформы GSCALite для изучения связи между экспрессией TMED3 и противораковой реакцией на лекарства при различных типах рака¹⁸. Данные секвенирования РНК уровня 3 и соответствующая клиническая информация для образцов COAD были получены из набора данных TCGA. Прогнозируемые ответы на химиотерапию для каждого образца были получены на основе данных базы данных Genomics of Medicinal Sensitivity in Cancer (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/). Прогнозирование реакции на лекарства проводилось с использованием пакета pRRophetic в программном обеспечении для статистического анализа. Оценочные значения полумаксимальной ингибиторной концентрации (IC₅₀) рассчитывались с использованием гребневой регрессии с настройками по умолчанию, включая коррекцию эффекта пакетов с помощью боевого алгоритма и анализ корректировки по тканям. Измерения экспрессии реплицированных генов были усреднены перед следующим анализом.

Экспрессия и прогноз TMED3 при раке толстой кишки
Профили экспрессии TMED3 и соответствующие клиникопатологические данные по аденокарциноме толстой кишки были получены из базы данных TCGA. Дифференциальная экспрессия TMED3 между тканями рака толстой кишки и несоответствующими нормальными тканями оценивалась с помощью тестов с ранговой суммой Уилкоксона, а связи между экспрессией TMED3 и клиникопатологическими характеристиками анализировались с помощью тестов хи-квадрата. Пациентов стратифицировали на группы с высокой и низкой экспрессией согласно медианному уровню экспрессии TMED3. Впоследствии был проведён анализ выживаемости Каплана–Майера для сравнения прогностических различий между двумя группами. Для оценки прогностической значимости экспрессии TMED3 при раке толстой кишки были проведены одномерные и многомерные регрессионные анализы рисков Кокса. Кроме того, был проведен анализ кривой приёмника, зависящего от времени (ROC) для оценки предсказательной эффективности экспрессии TMED3 для 1-, 3- и 5-летних операционных систем. Анализ ROC проводился с использованием пакета timeROC в программном обеспечении для статистического анализа, а графическая визуализация была создана с помощью пакета ggplot2.

Анализ иммуногистохимии
Всего случайным образом были отобраны 60 образцов тканей рака толстой кишки и 20 нераковых тканей из Центральной больницы Таншань. Исследование было одобрено местным институциональным экспертным советом (No TZYL/K/2023-16), а письменное информированное согласие было получено от всех пациентов до операции. Все образцы тканей были взяты у пациентов, которым была проведена хирургическая резекция без предварительной химиотерапии или иммунотерапии. В когорту входили 39 мужчин и 21 женщина в возрасте от 20 до 87 лет. Согласно критериям стадирования Дьюка, 33 пациента были классифицированы как стадии I+II, а 27 — как стадии III+IV. Распределение стадий когорты может привести к потенциальному смещению отбора в сторону поздних стадий заболевания; Поэтому результаты, связанные с выживаемостью, следует интерпретировать осторожно.

Образцы ткани, вложенные в парафин, были разделены на срезы размером 4 мкм, после чего следовали депарафинизация и регидратация. Эндогенная пероксидазная активность была заглушена с помощью 4% H_2O2, а неспецифическое связывание впоследствии блокировалось козьей сывороткой. Затем срезы инкубировали ночью при 4°C с первичным антителом TMED3 при разбавлении 1:100. На следующий день был нанесен полимер IgG (PV-6000) против кроликов (PV-6000) в течение 30 минут при комнатной температуре. Иммунореактивность визуализировалась с помощью окрашивания диаминобензидина, а срезы монтировались нейтральной смолой. Гистологическое окрашивание изучалось под оптическим микроскопом с большим увеличением. Интенсивность иммунного окрашивания оценивалась как 0 (отрицательная), 1 (слабая), 2 (умеренная) и 3 (сильная), тогда как доля положительных опухолевых клеток оценивалась как 1 (1%–25%), 2 (26%–50%), 3 (51%–75%) или 4 (76%–100%). Итоговые иммуногистохимические показатели рассчитывались путём умножения интенсивности окрашивания на процентный балл положительных опухолевых клеток. Уровни экспрессии TMED3 классифицировались как отрицательные/низкие экспрессии (балл ≤ 6) или сверхэкспрессию (балл > 6)¹⁹.

Анализ генного обогащения TMED3 при раке толстой кишки
Анализ обогащения генов был проведён для оценки потенциальных биологических функций и сигнальных путей, связанных с экспрессией TMED3 при раке толстой кишки. Дифференциально экспрессированные гены между группами с высокой и низкой экспрессией TMED3 были скринингованы с помощью пакета DESeq2 в программном обеспечении для статистического анализа. Исходные данные подсчёта, полученные из TCGA, были нормализованы с помощью метода нормализации медианных отношений, реализованного в DESeq2. Гены с низкой экспрессией и численностью <10 в более чем 50% образцов были исключены до анализа. Дифференциально экспрессированные гены были идентифицированы с помощью порогов |log₂ (FC)| ≥ 1 и скорректированный P < 0,05 после коррекции множественного тестирования Бенджамини–Хохберга (BH). Все аналитические параметры были фиксированы для обеспечения воспроизводимости анализа.

Впоследствии был проведён анализ обогащения множества генов (GSEA) с использованием пакета clusterProfiler в R, основанном на наборах генов Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (версия 7.5.1), полученных из базы данных молекулярных подписей (MSigDB). Был сформирован предварительно ранжированный список генов согласно значениям логафордного изменения между группами с высокой и низкой экспрессией TMED3. Анализ обогащения был проведён с использованием 1000 перестановок фенотипов, включая наборы генов, содержащие 15–500 генов. Пути с нормализованными абсолютными значениями >1, скорректированным P < 0,05 и коэффициентом ложного обнаружения (FDR) < 0,25 считались значительно обогащёнными. Обогащение пути болезни Паркинсона сохранялось, поскольку этот путь тесно связан с дисфункцией митохондрий и биологическими процессами, связанными с окислительным фосфорилированием, которые также участвуют в метаболическом перепрограммировании опухолей и прогрессировании рака.

Статистический анализ
Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Дифференциальная экспрессия между группами оценивалась с помощью двухсторонних тестов с суммой ранга Уилкоксона для непарных образцов и тестов Уилкоксона со знакомым рангом для парных образцов. Связи между экспрессией TMED3 и клиникопатологическими переменными оценивались с помощью тестов хи-квадрата. Анализ выживаемости проводился с использованием пакета выживания (версия 3.3-1), а кривые выживания Каплана–Мейера были сгенерированы с помощью пакета survminer. Различия в результатах выживаемости между группами сравнивались с помощью логарифмического теста. Модели регрессии пропорциональных рисков Кокса применялись для выявления прогностических факторов, связанных с ОС. Пациенты были классифицированы на группы с высоким и низким уровнем экспрессии в зависимости от медианного уровня экспрессии TMED3. Анализы ROC, зависящие от времени, проводились с помощью пакета timeROC, а цифры генерировались с помощью пакета ggplot2. Если не указано иное, статистическая значимость определялась как двустороннее значение P < 0,05.

Был проведён анализ корреляции Спирмана для оценки корреляций между экспрессией TMED3 и иммунными характеристиками, TMB и MSI. Для всех корреляционных анализов использовались нормализованные количественные данные экспрессии, полученные из соответствующих публичных баз данных. Для данных секвенирования РНК TCGA значения экспрессии в формате TPM преобразовывались с помощью нормализации log₂ (TPM + 1) перед анализом, где это было применимо. Образцы с отсутствующими клиническими или молекулярными данными были исключены до статистического анализа. Корреляционные анализы Спирмана проводились в виде двухсторонних непараметрических тестов. Для анализов с ограниченными сравнениями, включая тесты Уилкоксона, корреляционные анализы Спирмана и анализы выживаемости, использовались сырые значения P. Для крупномасштабных высокопроизводительных биоинформатических анализов, включая дифференциальный анализ экспрессии генов, анализ обогащения KEGG и GSEA, коррекция многократных испытаний проводилась с использованием метода BH FDR. Скорректированные значения FDR в <0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Экспрессионный анализ TMED3 при панраковой инфекции
Анализ наборов данных TCGA и GTEx показал, что экспрессия ТМЭД3 мессенджерной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) была значительно повышена в большинстве опухолевых тканей по сравнению с соответствующими нормальными тканями, включая адренокортикальную карциному (ACC), уротелиальную карциному мочевого пузыря (BLCA), инвазивную карциному молочной железы (BRCA), цервикальную плоскоклеточную карциному и эндоцервикальную аденокарциному (CESC), холангиокарциному (CHOL), аденокарциному толстой кишки (COAD), диффузную крупно-B-клеточную лимфому (DLBC), пищеводная карцинома (ESCA), глиобластома мультиформная (GBM), почечная прозрачная карцинома почек (KIRC), почечно-папиллярноклеточная карцинома (KIRP), глиома низкой степени мозга (LGG), печёночная гепатоцеллюлярная карцинома (LIHC), аденокарцинома лёгких (LUAD), плоскоклеточный рак лёгких (LUSC), серозная цистаденокарцинома яичников (OV), аденокарцинома поджелудочной железы (PAAD), феохромоцитома и параганглиома (PCPG), аденокарцинома предстательной железы (PRAD), аденокарцинома прямой кишки (READ), кожная меланома (SKCM), аденокарцинома желудка (STAD), опухоли зародышевых клеток яичек (TGCT), карцинома щитовидной железы (THCA), тимома (THYM), рак эндометрия матки (UCEC) и канцеросаркома матки (UCS), тогда как снижение экспрессии наблюдалось при плоскоклеточных карциномах головы и шеи (HNSC) и остром миелоидном лейкозе (LAML) (рисунок 1A). Сопоставленные соседние нормальные ткани служили контролем для парного анализа экспрессии. Парный анализ TCGA также подтвердил значительное повышение экспрессии TMED3 в тканях BLCA, BRCA, CHOL, COAD, почечных хромофобов (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD и UCEC по сравнению с парными нормальными тканями (рисунок 1B). Кроме того, анализ экспрессии белков с использованием базы данных UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) показал повышение уровня белка TMED3 в тканях опухолей BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV и UCEC, тогда как в PAAD наблюдалась сниженная экспрессия белка по сравнению с нормальными тканями (см. рисунок 1C). Однако экспрессия белка TMED3 в PAAD была ниже, чем в нормальных тканях. Это различие между паттернами экспрессии мРНК и белков может отражать посттранскрипционные или посттрансляционные регуляторные механизмы. Эти результаты свидетельствуют о том, что TMED3 аномально повышается при нескольких видах рака и может быть связан с диагностическими и прогностическими характеристиками у разных видов рака.

Рисунок 1. Профили экспрессии TMED3 у человеческих видов рака . (A) Дифференциальная экспрессия мРНК TMED3 между опухолями и нормальными тканями по нескольким типам рака на основе наборов данных TCGA и GTEx. Уровни экспрессии представлены в виде логарифма₂ (TPM + 1). (B) Парный анализ экспрессии мРНК TMED3 между тканями опухоли и сопоставленными смежными нормальными тканями из наборов данных TCGA. (C) Дифференциальная экспрессия белка TMED3 между нормальными тканями и первичными опухолями в наборах данных CPTAC/UALCAN, включая инвазивную карциному молочной железы (BRCA), аденокарциному толстой кишки (COAD), мультиформную глиобластому (GBM), карциному прозрачных клеток почек (KIRC), печёночную гепатоцеллюлярную карциному (LIHC), аденокарциному лёгких (LUAD), плоскоклеточный карцином лёгких (LUSC), серозную цистаденокарциному яичников (OV), аденокарциному поджелудочной железы (PAAD) и эндометриальной карциноме матки (UCEC). Данные представлены в виде коробочных графиков. Статистическая значимость анализировалась с использованием тестов с суммой рангов Уилкоксона или тестов с знакомым рангом Уилкоксона, в зависимости от необходимости. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; NS, не значительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ клиникопатологических признаков
Клинический анализ показал, что экспрессия TMED3 была значительно выше у опухолей на поздней стадии (стадии III–IV) по сравнению с ранними опухолями (стадии I–II) при ACC, KIRC, KIRP и LUAD (см. рисунок 2). В отличие от этого, экспрессия TMED3 была значительно снижена в тканях на поздней стадии UCEC. Эти данные свидетельствуют о повышении экспрессии TMED3 с прогрессированием опухоли у нескольких типов рака.

Рисунок 2. Связь между экспрессией TMED3 и патологической стадией при нескольких видах рака . Графики скрипки, показывающие уровни экспрессии мРНК TMED3 у ранних стадий опухолей (стадии I–II) и поздних стадий (стадии III–IV) при адренокортикальной карциноме (ACC), карциноме прозрачных клеток почек почек (KIRC), почечной папиллярноклеточной карциноме (KIRP), аденокарциноме лёгких (LUAD) и эндометриальной карциноме матки (UCEC). Уровни экспрессии представлены в виде логарифма₂ (TPM + 1). Статистическая значимость оценивалась с помощью тестов с суммой рангов Уилкоксона. *P < 0.05, ***P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Прогностический анализ
Регрессионный анализ Кокса и анализ выживаемости показали, что высокая экспрессия TMED3 была связана с более слабой ОС в ACC, COAD, LUAD и UVM (рисунок 3A). Анализ DSS также показал, что повышенная экспрессия TMED3 была существенно связана с неблагоприятным DSS в ACC, COAD, GBM, KIRP и UVM (рисунок 3B). Примечательно, что ACC, COAD и UVM стабильно показывали плохой прогноз как для ОС, так и для DSS у пациентов с высокой экспрессией TMED3. Прогностические ассоциации на уровне тенденции также наблюдались у отдельных типов опухолей, включая LUAD, KIRC и LGG. Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия TMED3 может иметь прогностическую значимость при множественных злокачественных опухолях.

Рисунок 3. Прогностическая значимость экспрессии TMED3 в панраковом анализе. (A) Лесной график, показывающий связь между экспрессией TMED3 и общей выживаемостью (OS) при нескольких типах рака. (B) Лесной график, показывающий связь между экспрессией TMED3 и выживаемостью, специфичной для заболевания (DSS) у нескольких типов рака. Коэффициенты риска (HR) и 95% доверительные интервалы (95% CI) рассчитывались с помощью пропорционального регрессионного анализа опасностей Кокса. HR > 1 указывает на плохой прогноз, связанный с высокой экспрессией TMED3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ мутаций
Анализ генетических изменений с использованием базы данных cBioPortal показал, что изменения TMED3 у рака в основном включали мутации, амплификации, глубокие делеции и множественные изменения (см. рисунок 4). Самая высокая частота изменений TMED3 наблюдалась при мезотелиоме (МЕЗО), главным образом за счёт амплификации генов (2,3%). ESCA показали смешанные типы изменений, включая мутацию (0,55%), амплификацию (1,1%) и глубокую делецию (0,55%). В отличие от этого, в наборах данных LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT и GBM не выявлено обнаруживаемых генетических изменений TMED3. Эти данные свидетельствуют о том, что геномные изменения TMED3 происходят специфическим для опухолей и могут способствовать гетерогенности рака.

Рисунок 4. Ландшафт генетических изменений TMED3 у видов рака . Частота и типы генетических изменений TMED3 в панраковых наборах данных, полученные из базы данных cBioPortal. Категории изменений включали мутации, амплификацию, глубокую делецию и множественные изменения. Ось y указывает на частоту изменений (%) между типами рака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ метилирования ДНК
Анализ базы данных UALCAN показал, что уровень метилирования промоторов TMED3 значительно повышался в тканях опухоли BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD и PRAD по сравнению с соответствующими нормальными тканями (см. рисунок 5). В отличие от этого, в тканях BLCA, TGGT и UCEC наблюдалось снижение уровня метилирования промоторов TMED3 по сравнению с нормальными контролями. Эти результаты свидетельствуют о том, что аномалированное метилирование промотора TMED3 может способствовать специфической для опухоли регуляции экспрессии TMED3.

Рисунок 5. Уровни метилирования промоторов TMED3 у видов рака . Сравнение уровней метилирования промоторов TMED3 между тканями опухоли и соответствующими нормальными тканями при уротелиальной карциноме мочевого пузыря (BLCA), инвазивной карциноме молочной железы (BRCA), аденокарциноме толстой кишки (COAD), карциноме пищевода (ESCA), плоскоклетичной карциноме головы и шеи (HNSC), карциноме прозрачной клеточной клетки почек (KIRC), карциноме почек почек (KIRP), печёночной печёночной карциноме (LIHC), аденокарциноме легких (LUAD), аденокарциноме поджелудочной железы (PAAD), наборы данных по аденокарциноме предстательной железы (PRAD), опухолям яичек (TGCT) и эндометриальной карциноме матки (UCEC), полученным из UALCAN. Данные представлены в виде β значений в коробчатых диаграммах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ корреляций TMED3, TMB и MSI
Анализ корреляции Спирмана показал, что экспрессия TMED3 положительно коррелировала с TMB в ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM и UCEC, тогда как отрицательные корреляции наблюдались в CESC, LUAD и TGCT (рисунок 6A). Кроме того, экспрессия TMED3 положительно ассоциировала с MSI в DLBC, KIRC, SKCM, STAD и UCEC (рисунок 6B). В частности, экспрессия TMED3 показала положительную корреляцию как с TMB, так и с MSI в KIRC, STAD и UCEC, что может указывать на возможные связи с иммуногенностью опухолей в этих видах рака.

Рисунок 6. Корреляция экспрессии TMED3 с мутационной нагрузкой опухоли и микросателлитной нестабильностью в панраковом анализе. (A) Радарный график, показывающий корреляцию между экспрессией TMED3 и мутационной нагрузкой опухолей (TMB) у всех видов рака. (B) Радарный график, показывающий корреляцию между экспрессией TMED3 и микросателлитной нестабильностью (MSI) у раковых видов. Коэффициенты корреляции рассчитывались с помощью корреляционного анализа Спирмана. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ иммунных характеристик
Анализ ESTIMATE показал, что экспрессия TMED3 была отрицательно коррелирована со стромальной оценкой, иммунной оценкой и оценкой ОЦЕНКИ в BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA и UCEC (рисунок 7A). В отличие от этого, положительные корреляции между экспрессией TMED3 и этими иммунно-связанными баллами наблюдались в LGG, LIHC и PCPG. Значимые корреляции не выявлены в ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV и UCS. Эти результаты свидетельствуют о том, что TMED3 может влиять на микроокружение опухолей и инфильтрацию иммунных клеток в зависимости от типа рака. Анализ корреляции иммунных контрольных точек дополнительно показал, что экспрессия TMED3 была негативно связана с генами, связанными с иммунными контрольными точками: CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) и CTLA4 в BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM и THCA (рисунок 7B). Положительные корреляции между экспрессией TMED3 и генами иммунных контрольных точек были выявлены в LIHC и UVM, тогда как значимые ассоциации не наблюдались в GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ и TGCT. Эти результаты указывают на то, что TMED3 может быть связан с иммунной регуляцией опухолей и иммунной контрольной точкой сигнализации в отдельных видах рака.

Рисунок 7. Связи между экспрессией TMED3 и иммунными характеристиками опухоли. (A) Тепловая карта, показывающая корреляцию между экспрессией TMED3 и шкалой стромы, иммунным баллом и баллом ESTIMATE у онкологических заболеваний, рассчитанная с использованием алгоритма ESTIMATE. (B) Тепловая карта, показывающая корреляции между экспрессией TMED3 и генами, связанными с иммунными контрольными точками, включая CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) и CTLA4. Коэффициенты корреляции определялись с помощью корреляционного анализа Спирмана. Цветовая шкала указывает на силу корреляции. *P < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ чувствительности к лекарствам
Анализ чувствительности к лекарствам с использованием платформы GSCALite на основе наборов данных GDSC показал, что экспрессия TMED3 была отрицательно коррелирована со значениями полумаксимальной ингибиторной концентрации (IC₅₀) 17-AAG, лапатиниба, PD-0325901, RDEA119 и траметиниба (рисунок 8). Эти результаты свидетельствуют о том, что опухоли с повышенной экспрессией TMED3 могут проявлять повышенную чувствительность к этим противораковым препаратам, что указывает на возможные связи между экспрессией TMED3 и терапевтической чувствительностью.

Рисунок 8. Корреляция между экспрессией TMED3 и чувствительностью к противораковым препаратам. Пузырьковый график, показывающий корреляцию между экспрессией мРНК TMED3 и чувствительностью к противораковым препаратам, полученным из наборов данных Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) через платформу GSCALite. Размер пузыря представляет собой статистическую значимость, основанную на частоте ложного обнаружения (FDR), а цвет — значения коэффициентов корреляции. Отрицательные корреляции указывают на повышенную чувствительность к препаратам, связанную с высокой экспрессией TMED3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Экспрессия и прогноз TMED3 при раке толстой кишки
Анализ экспрессии TMED3 показал значительное повышение уровня мРНК TMED3 в тканях рака толстой кишки по сравнению с нормальными тканями толстой кишки в наборах данных TCGA (рисунок 9A). Парный анализ с использованием сопоставленных соседних нормальных тканей в контроле дополнительно подтвердил повышенную экспрессию TMED3 в тканях рака толстой кишки (рисунок 9B). В соответствии с транскриптомическими данными, анализ экспрессии белков с использованием наборов данных UALCAN/CPTAC и иммуногистохимического окрашивания показал повышенную экспрессию белка TMED3 в тканях рака толстой кишки по сравнению с нормальными тканями толстой кишки (рисунок 9C–9E). Анализ кривой ROC показал площадь под кривой (AUC) значения 0,869, что свидетельствует о благоприятной диагностической эффективности TMED3 для различия тканей рака толстой кишки от нормальных (рисунок 9F). Клиникопатологический анализ дополнительно показал, что экспрессия TMED3 была существенно связана со стадией T, тогда как значимых связей с возрастом, полом, стадием N или стадией TNM не наблюдалось (Таблица 1). Эти результаты подтверждают потенциальную диагностическую значимость TMED3 при раке толстой кишки.

Рисунок 9. Экспрессия, диагностическая ценность и иммуногистохимическая валидация TMED3 при раке толстой кишки. (A) Дифференциальная экспрессия мРНК TMED3 между тканями рака толстой кишки и нормальными тканями толстой кишки на основе наборов данных TCGA. (B) Парный анализ экспрессии мРНК TMED3 в тканях рака толстой кишки и сопоставления соседних нормальных тканей. (C) экспрессия белка TMED3 в раке толстой кишки и нормальных тканях, полученных из наборов данных CPTAC/UALCAN. (D) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание TMED3 в нормальной ткани толстой кишки. (E) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание TMED3 в тканях рака толстой кишки, показывающее повышенную экспрессию TMED3. (F) Кривая операционной характеристики приёмника (ROC), оценивающая диагностическую ценность TMED3 при раке толстой кишки. Шкала = 100 мкм. Область под кривой (AUC) составила 0,869 с 95% доверительным интервалом (CI) 0,813–0,924. Статистическая значимость анализировалась с использованием тестов с суммой рангов Уилкоксона или тестов с знакомым рангом Уилкоксона, в зависимости от необходимости. P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Тип		TMED3		Значение p	χ2
		Низкая экспрессия	Высокая экспрессия
Возраст
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
Пол
Женский	21	10	11	0.94	0.007
Мужской	39	19	20
Стадия Т
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
N Stage
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
Этап TNM
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

Таблица 1: Связь между экспрессией TMED3 и клиникопатологическими характеристиками при раке толстой кишки. Клиникопатологические характеристики пациентов с раком толстой кишки сравнивались между группами с низкой и высокой экспрессией TMED3. Связи между экспрессией TMED3 и клиникопатологическими переменными, включая возраст, пол, стадию T, стадию N и стадию TNM, были проанализированы с помощью тестов на хи-квадрат (χ²). Данные представлены в виде количества пациентов в каждой подгруппе. Статистическая значимость была определена как P < 0,05.

Анализ выживаемости KM показал, что пациенты с высокой экспрессией TMED3 демонстрировали значительно более слабые показатели OS (P = 0,031) и DSS (P = 0,020) по сравнению с пациентами с низкой экспрессией TMED3 (рисунок 10A и 10B). Анализ ROC, зависящий от времени, показал, что прогностическая эффективность экспрессии TMED3 для ОС дала значения AUC 0,620, 0,564 и 0,575 через 1, 3 и 5 лет соответственно (рисунок 10C). Кроме того, одномерные и многомерные регрессионные анализы Кокса выявили T-стадию, M-стадию, патологическую стадию и экспрессию TMED3 как прогностические факторы, связанные с общей выживаемостью при раке толстой кишки (Таблица 2). Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия TMED3 связана с плохим прогнозом при раке толстой кишки, хотя анализ, зависящий от времени ROC, показал лишь умеренную прогностическую эффективность.

Рисунок 10. Прогностическое значение экспрессии TMED3 при раке толстой кишки. (A) Кривые общей выживаемости Каплана–Мейера (КМ), сравнивающие пациентов с высокой и низкой экспрессией TMED3 при раке толстой кишки. (B) Кривые выживаемости Каплана–Мейера, специфичных для болезни (DSS), сравнивающие пациентов с высокой и низкой экспрессией TMED3. (C) Временно-зависимые операционные характеристики приёмника (ROC), оценивающие предсказательную эффективность экспрессии TMED3 для 1-, 3- и 5-летних операционных систем. Различия в выживаемости анализировались с помощью логарифм-рангового теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Характеристики	Одномерный анализ		Многомерный анализ
	Коэффициент опасности (95% ДИ)	Значение p	Коэффициент опасности (95% ДИ)	Значение p
Пол	1.101(0.746–1.625)	0.627
Стадия Т	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
Этап N	2.592(1.743–3.855)	<0.001	0.587(0.223–1.584)	0.28
Стадия М	4.193(2.683–6.554)	<0.001	2.272(1.314–3.930)	0.003
Патологическая стадия	2.947(1.942–4.471)	<0.001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

Таблица 2: Одномерный и многомерный регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса по прогностическим факторам, связанным с общей выживаемостью при раке толстой кишки. Для оценки прогностической значимости клиникопатологических характеристик и экспрессии TMED3 у пациентов с раком толстой кишки проводились одномерные и многомерные регрессионные анализы пропорциональных рисков Кокса. Коэффициенты опасности (HR) представлены с 95% доверительными интервалами (95% CI). Переменные включали пол, стадию тестостерона, стадию N, стадию M, патологическую стадию и экспрессию TMED3. Статистическая значимость была определена как P < 0,05.

Анализ чувствительности к лекарствам показал, что пациенты в группе с высокой экспрессией TMED3 демонстрировали более низкие оценочные значения IC₅₀ по 5-фторурацилу, лапатинибу и траметинибу по сравнению с группой с низкой экспрессией TMED3 (рисунок 11). Эти результаты свидетельствуют о том, что пациенты с раком кишки с повышенной экспрессией TMED3 могут проявлять повышенную чувствительность к этим химиотерапевтическим и таргетным терапевтическим препаратам, что указывает на возможные связи между экспрессией TMED3 и терапевтическим ответом.

Рисунок 11. Корреляция между экспрессией TMED3 и чувствительностью к химиотерапевтическим препаратам при раке толстой кишки. Коробочные графики, показывающие оценочные значения полумаксимальной ингибиторной концентрации (IC₅₀) для 5-фторурацила, лапатиниба и траметиниба между группами с низкой экспрессией TMED3 (G1) и высокой экспрессией TMED3 (G2). Более низкие значения IC₅₀ указывают на повышенную чувствительность к лекарствам. Статистическая значимость анализировалась с помощью тестов на сумму ранга Уилкоксона. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ обогащения генов
GSEA с использованием наборов данных KEGG из базы MSigDB показало, что гены, связанные с TMED3 при раке толстой кишки, были значительно обогащены путями, связанными с рибосомами, обработкой и презентацией антигенов, окислительным фосфорилированием и пентозофосфатным путём (рисунок 12). Эти данные свидетельствуют о том, что TMED3 может участвовать в прогрессировании опухоли через вышеуказанные пути при раке толстой кишки.

Рисунок 12. Анализ обогащения множества генов (GSEA) генов, связанных с TMED3, при раке толстой кишки. Графики GSEA показывают обогащение генов, связанных с TMED3, в путях, связанных с обработкой и презентацией антигенов, рибосомами, окислительным фосфорилированием и пентозофосфатным путём при раке толстой кишки. В каждой панели указаны значения нормализованного обогащения (NES), номинального значения P и коэффициента ложного обнаружения (FDR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Это исследование показало, что TMED3 экспрессируется аберрантно в нескольких видах рака и связан с прогрессированием опухоли, прогнозом, иммунными характеристиками, TMB, MSI и чувствительностью к лекарствам. При раке толстой кишки гиперэкспрессия TMED3 была связана с неблагоприятными результатами выживаемости и повышением диагностической ценности. Анализ функционального обогащения также показал, что TMED3 может участвовать в метаболических и сигнальных путях, связанных с раком. В совокупности эти результаты способствуют дальнейшему изучению TMED3 как потенциального диагностического и прогностического биомаркера при панканкуле, особенно при раке толстой кишки.

Доступность данных:
Анализируемые в этом исследовании наборы данных были получены из общедоступных баз данных, включая The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; доступ 1 июля 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; доступ 1 июля 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; доступ 5 июля 2025) и платформу Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) через GSCA (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; доступ 5 июля 2025). Все обработанные данные, полученные в ходе этого исследования, включены в статью.

Обсуждение

TMED белки — это высококонсервативные белки, содержащие домен emp24, которые существуют в виде мономеров или димеров внутри эукариотических^{клеток 20}. Члены семейства TMED — это трансмембранные белки типа I, которые участвуют в везикуло-опосредованном транспорте белков и внутриклеточном^{транспорте 20}. Семейство белков p24 включает 10 членов TMED, включая TMED3. Всё больше доказательств показывают, что TMED3 аномально экспрессируется при ряде злокачественных опухолей, таких как эндометриальная карцинома, остеосаркома, прозрачноклеточная карцинома, гепатоцеллюлярная карцинома, рак простаты и рак молочной^железы 4,6,21,22,23. Повышенная экспрессия TMED3 также связана с неблагоприятным прогнозом при нескольких опухолях 3,5,17,18,19. При плоскоклеточной карциноме лёгких TMED3 способствует прогрессированию опухоли через регуляцию эзрина, тогда как подавление TMED3 подавляет пролиферацию клеток, образование колоний, миграцию и дисрегуляцию белка, связанную с^{апоптозом 5}. В совокупности эти исследования показывают, что TMED3 тесно участвует в развитии и прогрессировании рака; Однако его биологические функции и молекулярные механизмы при панканкулевом синдроме всё ещё предстоит полностью прояснить.

В настоящем исследовании было интегрировано несколько публичных баз данных для всесторонней оценки паттернов экспрессии, прогностической значимости, иммунных характеристик и потенциальных биологических функций TMED3 в различных видах рака. Экспрессия TMED3 была заметно повышена в 26 типах опухолей, и эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью анализов парных опухолей и смежных нормальных тканей в нескольких видах рака. Постоянно данные CPTAC показывали повышенную экспрессию белка TMED3 у BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV и UCEC. Интересно, что хотя экспрессия мРНК TMED3 была повышена в тканях PAAD, в базе данных UALCAN наблюдалась сниженная экспрессия белка, что указывает на то, что посттранскрипционная регуляция, деградация белка или посттрансляционные модификации могут способствовать этому несоответствию. Предыдущие исследования показали, что гиперэкспрессия TMED3 в клетках рака молочной железы способствует накоплению β-катенина и аксина-2 как в цитоплазме, так и в ядре клеток MCF-7, а также усиливает экспрессию Wnt/β-катенин в нижней части целей, включая c-myc, MMP7 и TCF4, тем самым способствуя пролиферации, миграции и инвазии опухолевых^{клеток 24}. Аналогично, сообщается, что TMED3 повышается при немелкоклеточном раке лёгких, а подавление TMED3 подавляет пролиферацию опухолевых клеток^{и их инвазивную способность.} В данном исследовании клиникопатологические анализы показали, что экспрессия TMED3 была повышена в продвинутых стадиях ACC, KIRC, KIRP и LUAD, тогда как снижение экспрессии наблюдалось на поздних стадиях UCEC, что указывает на возможные специфические для опухоли биологические роли TMED3 в прогрессировании рака. Анализ выживаемости дополнительно показал значимую связь между высокой экспрессией TMED3 и неблагоприятным OS и DSS при ACC, COAD и UVM, что подтверждает потенциальную прогностическую ценность TMED3 при множественных злокачественных опухолях. Кроме того, анализ метилирования промоторов выявил повышение уровня метилирования TMED3 в BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD и PRAD, а также снижение уровня метилирования в BLCA, TGGT и UCEC. Эти результаты указывают на то, что аберрантное метилирование промоторов может способствовать дисрегуляции экспрессии TMED3 в зависимости от опухоли и участвовать в развитии рака.

MSI представляет собой особый молекулярный подтип рака, который часто ассоциируется с улучшением реакции на иммунотерапию, поскольку эти опухоли обычно демонстрируют повышенную мутационную нагрузку и повышенную экспрессию PD-L1^26,27. Опухоли с высоким уровнем TMB могут вырабатывать множество неоантигенов, произтичающих от соматических мутаций, тем самым усиливая Т-клеточную иммунную активность и потенциально повышая чувствительность к блокаде иммунных контрольных^{точек 28,29}. В настоящем исследовании экспрессия TMED3 показала положительную корреляцию как с TMB, так и с MSI в KIRC, STAD и UCEC, что указывает на то, что TMED3 может быть связан с иммуногенностью опухолей и иммунотерапевтической реакцией при этих типах рака. Всё больше данных показывает, что микросреда опухоли, особенно иммунные и стромальные компоненты, играет критическую роль в прогрессировании рака, терапевтическом ответе, рецидиве и прогнозе пациентов. Алгоритм ESTIMATE рассчитывает стромальные, иммунные и ESTIMATE показатели в соответствии с иммунно-связанными паттернами экспрессии генов, и предыдущие исследования отмечали значимые связи между этими показателями и клиническими результатами при раке простаты, глиобластоме и раке толстой^кишки 30,31,32. Наши анализы показали, что экспрессия TMED3 была по-разному связана со стромальной, иммунной оценкой и оценкой ESTIMATE у разных типов опухолей, что свидетельствует о том, что TMED3 может способствовать прогрессированию опухоли через модуляцию микросреды опухоли. Кроме того, экспрессия TMED3 коррелировала с несколькими генами, связанными с иммунными контрольными точками, включая CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) и CTLA4, хотя направление и степень этих ассоциаций различались в зависимости от типа опухолей. Значимые положительные корреляции между TMED3 и маркерами иммунных контрольных точек были выявлены в ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM и UVM, что свидетельствует о том, что опухоли с повышенной экспрессией TMED3 у этих видов рака могут проявлять повышенную чувствительность к иммунотерапии. Анализ чувствительности к лекарствам также выявил связь между экспрессией TMED3 и отзывчивостью на 17-AAG, лапатиниб, PD-0325901, RDEA119 и траметиниб, что указывает на потенциальную связь между экспрессией TMED3 и терапевтической эффективностью.

Рак толстой кишки был выбран для иммуногистохимической валидации, и результаты подтвердили, что экспрессия TMED3 в тканях рака толстой кишки значительно повышена по сравнению с нормальными тканями толстой кишки, что соответствует предыдущим данным⁷. Клиникопатологические анализы также выявили значимую связь между экспрессией TMED3 и стадией Т при раке толстой кишки. Кроме того, TMED3 продемонстрировал потенциальную диагностическую ценность, в то время как повышение экспрессии TMED3 было связано с ухудшением прогноза у пациентов. Однако временно-зависимые анализы ROC показали, что значения AUC для прогнозирования 1-, 3- и 5-летней ОС были лишь незначительно выше 0,5, что указывает на ограниченную точность прогнозирования, несмотря на статистическую значимость. Эти результаты свидетельствуют о том, что TMED3 в настоящее время имеет большую ценность как исследовательский прогностический биомаркер, а не как надёжный предиктор для рутинного клинического применения. Одномерный и многомерный регрессионный анализ Кокса дополнительно выявил Т, М, патологическую стадию и экспрессию TMED3 как независимые прогностические факторы, связанные с ОС при раке толстой кишки. Анализ чувствительности к лекарствам показал, что пациенты с повышенной экспрессией TMED3 могут быть более чувствительны к широко используемым терапевтическим препаратам, включая 5-фторурацил, лапатиниб и траметиниб. Кроме того, анализ функционального обогащения показал, что гены, связанные с TMED3 при раке толстой кишки, в основном обогащаются путями, связанными с рибосомами, обработкой и презентацией антигенов, окислительным фосфорилированием и пентозофосфатным путём.

В этом исследовании систематически оценивались профили экспрессии, прогностическая ценность и иммунно-связанные характеристики TMED3 у различных типов рака. Тем не менее, следует учитывать ряд ограничений. Большинство результатов были получены на основе биоинформатики и мультиомических анализов на основе публичных наборов данных, а экспериментальная валидация ограничивалась иммуногистохимическим анализом в тканях рака толстой кишки. Кроме того, функциональные эксперименты не проводились для изучения точных молекулярных механизмов, лежащих в основе роли TMED3 в прогрессировании опухоли. Поэтому необходимы дополнительные исследования in vitro и in vivo для дальнейшего уточнения биологических функций и потенциальной терапевтической значимости TMED3 при различных злокачественных опухошах.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.5% раствор аммиака	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% кислый спирт	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% нейтральный буферный формалин	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% этанол	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% этанол	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% этанол	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% этанол	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Альциановое синее окрашивание	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Цитратный буфер для реставрации антигена	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
пакет clusterProfiler	Bioconductor	N/A	SCR_016884
пакет DESeq2	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Тетрагидрохлорид диаминобензидина	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
пакет ESTIMATE	R package	Версия 1.0.13	N/A
платформа GSCALite	GSCALite	N/A	N/A
база данных GTEx	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Гематоксилин	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Перекись водорода	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Анализ выживаемости Kaplan–Meier	пакет survival R	Версия 3.2-7	SCR_021137
Наборы генов KEGG	MSigDB	Версия 7.5.1	SCR_016863
Светлопольный микроскоп	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Парафиновое встраивающее средство	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Полимерная система обнаружения	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
статистическое программное обеспечение R	R Foundation for Statistical Computing	Версия 4.2.1	SCR_001905
Вторичное кроличье антитело к мыши IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
база данных TCGA	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
Первичное антитело TMED3	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Трис-буферный раствор соли (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
база данных UALCAN	UALCAN	N/A	SCR_015827
Статистический анализ Вилкоксона	пакет stats R	N/A	SCR_003005
Ксилол	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A