Данный протокол представляет собой стандартизированный и воспроизводимый рабочий процесс для оценки пролиферативной способности, а также остеогенной и одонтогенной дифференцировки стволовых клеток зубных тканей человека, культивируемых на наноматериальных скаффолдах, с использованием стандартных анализов (активность ALP, иммунофлуоресценция на RANKL [остеогенная] и иммунофлуоресценция на DMP-1 [одонтогенная]) и стратегий нормализации для обеспечения сопоставимости результатов между различными исследованиями.
Методическая статья
Стандартизированный протокол in vitro для оценки дифференцировки и пролиферации стволовых клеток пульпы зуба человека на наноматериальных скаффолдах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Надежная оценка остеогенной и одонтогенной дифференцировки, а также пролиферации стволовых клеток имеет основополагающее значение для анализа биологической эффективности стратегий регенерации на основе скаффолдов. Однако вариативность экспериментальных протоколов, выбор методов анализа и интерпретация данных часто ограничивают воспроизводимость и возможность сравнения результатов различных исследований. В данной статье описан стандартизированный, воспроизводимый рабочий процесс для оценки in vitro остеогенной и одонтогенной дифференцировки, а также пролиферативной способности стволовых клеток, культивируемых на скаффолдах из биоматериалов. Остеогенная дифференцировка оценивается по ферментативной активности щелочной фосфатазы (ALP) и иммунофлуоресценции лиганда рецептора-активатора ядерного фактора κB (RANKL), в то время как одонтогенная дифференцировка оценивается по иммунофлуоресценции DMP-1 (белка дентинного матрикса-1); количественный анализ обоих белковых маркеров проводится с использованием стандартизированной методики H-score. Подробно описаны критические экспериментальные параметры, включая плотность посева клеток, сроки индукции, условия анализа, стратегии нормализации (включая активность ALP, нормализованную по белку, жизнеспособность по методу 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (MTT), нормализованную по количеству клеток, и H-score иммунофлуоресценции), а также подходы к анализу данных, вместе с рекомендациями по устранению неполадок для минимизации технической вариативности. Данная методология была применена в качестве стандартизированной основы в нескольких экспериментальных исследованиях с использованием скаффолдов, продемонстрировав надежность и воспроизводимость. Предоставляя комплексную валидированную основу, эта статья ставит целью облегчить стандартизированную оценку взаимодействий «стволовая клетка — скаффолд» и улучшить сопоставимость доклинических регенеративных исследований.
Введение
Регенеративная эндодонтия представляет собой смену парадигмы в стоматологии, ориентированную на восстановление жизнеспособности пульпы зуба с использованием стволовых клеток, факторов роста и скаффолдов1,2. Сохранение жизнеспособности пульпы имеет решающее значение для обеспечения сенсорной функции и иммунного ответа, что особенно важно при лечении несформированных зубов с некрозом пульпы для обеспечения дальнейшего развития корня2.
Стволовые клетки пульпы зуба человека (DPSCs) и стволовые клетки апикального сосочка (SCAPs) являются основными кандидатами для данных процедур благодаря их высокому пролиферативному потенциалу, способности к самообновлению, иммуносупрессивным свойствам и возможности дифференцироваться в одонтобластоподобные клетки при соответствующих микроокружающих условиях, что делает их перспективными объектами для будущего применения в регенеративной медицине и клеточной терапии3,4,5.
Несмотря на то, что традиционно формулируемые материалы, такие как цементы на основе силиката кальция, уже были изучены, появляющиеся данные свидетельствуют о том, что модификация наночастицами может существенно влиять на взаимодействие между биоматериалом и клетками6. Наноструктурированные биоматериалы могут создавать более биомиметическую микросреду, потенциально улучшая адгезию стволовых клеток и их дифференцировку по специфическим линиям7. Однако биологическое поведение новых материалов, таких как NeoMTA2 в форме наночастиц, остается недостаточно изученным по сравнению с общепринятыми материалами, например, наногидроксиапатитом8. Данный протокол направлен на создание стандартизированной методологической базы для точной и воспроизводимой оценки этих взаимодействий.
Эта стандартизированная платформа особенно подходит для исследований по оценке новых биоматериалов или наноматериальных каркасов в идентичных биологических условиях, где первостепенное значение имеет сопоставимость результатов между исследованиями. Она обладает преимуществами перед подходами с использованием одного анализа, объединяя скрининг жизнеспособности (MTT), раннюю остеогенную дифференцировку (активность ALP) и дифференцировку на уровне белков (H-score иммунофлуоресценции) в рамках одного рабочего процесса. Исследователям, использующим традиционное окрашивание ализарином красным или анализы в одной временной точке, может быть полезно внедрить эту многопараметрическую платформу для снижения субъективности наблюдателя и повышения количественного разрешения. Однако данный протокол не предназначен для использования в трехмерных культурах органоидов, системах кокультивирования или моделях стволовых клеток животного происхождения без соответствующей адаптации. Исследователям, которым требуется профилирование экспрессии генов (например, RT-qPCR для RUNX2, OCN или DSPP), следует дополнить данный рабочий процесс молекулярными анализами, так как настоящий протокол сосредоточен исключительно на белковых и ферментативных конечных точках.
Для всестороннего анализа способности зубных стволовых клеток к бифункциональной дифференцировке в данном протоколе используются два взаимодополняющих иммунофлуоресцентных маркера, отражающих различные биологические конечные точки. RANKL (лиганд рецептора-активатора ядерного фактора kappa-B) используется в качестве маркера определения остеогенной линии: его экспрессия в остеобластоподобных клетках отражает сигнализацию минерализации, управляемую ионами кальция, и активацию костеобразующих клеток, что соответствует его применению в нескольких исследованиях по оценке SCAPs4,8,9. Параллельно используется DMP-1 (белок дентинного матрикса-1) как специфический маркер одонтогенной/дентиногенной дифференцировки: его усиленная экспрессия в одонтобластоподобных клетках отражает индукцию образования дентинного матрикса и восстановление специфических твердых тканей пульпы, что особенно актуально, когда целевой популяцией клеток являются DPSCs10. Количественное определение как RANKL, так и DMP-1 в рамках одного эксперимента с использованием методики H-score позволяет исследователям различать остеогенную и одонтогенную дифференцировку — два перекрывающихся, но механистически различных результата взаимодействия стволовых клеток со скаффолдом — без необходимости разработки отдельных экспериментов.
Протокол
Данный протокол был одобрен Этическим комитетом стоматологического факультета Университета Айн-Шамс под номером одобрения FDASU-Rec IM112105. Все процедуры с использованием тканей человека проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией. До удаления зубов и забора стволовых клеток от всех участников было получено письменное информированное согласие.
1. Приготовление и характеристика наноматериалов
- Синтезируйте наноматериалы в соответствии со специфическими требованиями10,11. Для Nano-NeoMTA2 измельчите порошок в планетарной шаровой мельнице (см. Таблицу материалов) в течение 10 ч при 350 об/мин с интервалами включения/выключения 3 мин. Используйте массовое соотношение шаров к порошку 10:1 с циркониевыми шарами (диаметром 5 мм) в циркониевом измельчительном стакане. Перед продолжением работы проверьте конечный размер частиц с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) (целевое значение: <200 nm).
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Порошок NeoMTA2 может вызвать раздражение дыхательных путей при вдыхании. Выполняйте все этапы сухого помола в сертифицированном вытяжном шкафу, используя респиратор N95, защитные очки и нитриловые перчатки. - Приготовьте наногидроксиапатит методом мокрого химического осаждения8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Приготовьте 1 L 0.5 M раствора нитрата кальция и 0.6 L 0.3 M раствора фосфата аммония, оба в деионизированной воде. По каплям добавляйте раствор нитрата кальция в раствор фосфата аммония со скоростью примерно 2–3 mL/min при непрерывном перемешивании со скоростью 400 об/мин и нагреве до 70 °C, поддерживая pH 10–12 путем пошагового добавления гидроксида аммония8.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Гидроксид аммония обладает коррозионной активностью и выделяет токсичные пары аммиака. Работайте только в химическом вытяжном шкафу. Используйте кислотостойкие перчатки, защитные очки и лабораторный халат. При попадании на кожу немедленно промывайте водой в течение ≥15 min. - Подвергните полученный осадок апатита гидротермальной обработке в автоклаве при 140 °C и 0.3 MPa в течение 2–3 ч10. Лиофилизируйте очищенный осадок при -50 °C под вакуумом ≤0.05 mbar в течение 48 ч8.
- Приготовьте наночастицы биоактивного стекла 45S5 золь-гель методом следующим образом:
- Приготовьте раствор-предшественник, смешав 40 mL тетраэтилортосиликата (TEOS) с 10 mL 2 M азотной кислоты (HNO₃) в качестве кислотного катализатора в полипропиленовом стакане при непрерывном перемешивании со скоростью 300 об/мин при комнатной температуре.
- Через 30 мин добавьте тетрагидрат нитрата кальция (Ca(NO₃)₂·4H₂O) и нитрат натрия (NaNO₃) для достижения целевого молярного состава: 45 мол% SiO₂, 24.5 мол% CaO, 24.5 мол% Na₂O и 6 мол% P₂O₅. Добавьте триэтилфосфат (TEP) в качестве предшественника фосфора.
- Перемешивайте при комнатной температуре в течение 24 ч. Выдержите гель при 60 °C в течение 24 ч в герметичном контейнере. Высушите при 120 °C в течение 24 ч. Проведите прокаливание в муфельной печи при 650 °C в течение 3 ч (скорость нагрева: 2 °C/min). Измельчите и подтвердите фазовый состав с помощью ПЭМ и рентгеновской дифракции (РД)4,9.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: TEOS и этанол легковоспламеняемы. HNO₃ обладает коррозионной активностью. Проводите все процедуры в вытяжном шкафу вдали от источников возгорания.
- Проведите характеризацию всех приготовленных наночастиц с помощью ПЭМ высокого разрешения и РД для подтверждения размера частиц и кристалличности8. Зафиксируйте средний размер частиц, индекс полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал с помощью метода динамического рассеяния света (DLS) для подтверждения коллоидной стабильности. Допускайте партии со средним размером частиц <200 nm и дзета-потенциалом <−15 mV или >+15 mV.
2. Сбор и культивирование стволовых клеток
- Выделите DPSC или SCAP из свежеэкстрагированных ретинированных нижних третьих моляров после получения письменного информированного согласия10. Обработайте экстрагированные зубы в течение 2 ч после удаления и транспортируйте в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии отбора доноров включают системно здоровых взрослых в возрасте 18–35 лет, некурящих, без применения антибиотиков в течение предшествующих 3 месяцев, без заболеваний пародонта и без рентгенологических признаков периапикальной патологии. - Изолируйте клетки методом ферментативного переваривания9. Измельчите зубную ткань на фрагменты размером 1–2 мм и переварите в растворе коллагеназы I типа в концентрации 3 mg/mL в безсывороточной модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) в течение 1 ч при 37 °C при постоянном перемешивании со скоростью 60 rpm на качалке8. Нейтрализуйте полной культуральной средой и профильтруйте через клеточный фильтр с размером пор 70 µm.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Коллагеназа I типа может содержать эндотоксины. Используйте только коллагеназу степени чистоты для культур тканей, протестированную на содержание эндотоксинов. Работайте в перчатках и избегайте вдыхания вещества. - Высейте суспензию одиночных клеток в флаконы объемом 75 cm2 с начальной плотностью 1 × 104 клеток/cm2 в полной культуральной среде, состоящей из DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (Таблица материалов)8.
- Инкубируйте флаконы при 37 °C в атмосфере 5% CO₂8. Ежедневно контролируйте рост и отсутствие контаминации с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа10. Заменяйте культуральную среду каждые 48–72 ч. Утилизируйте любые флаконы с признаками контаминации (помутнение, изменение цвета, атипичная морфология клеток).
- Соберите клетки после третьего пассажа при достижении конфлюэнтности примерно 70–80%8. Для пассирования удалите среду аспиратором, промойте PBS и отделите клетки, используя 0,25% раствор трипсина-ЭДТА при 37 °C в течение 3–5 мин. Нейтрализуйте полной культуральной средой, центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин и пересейте с плотностью 1 × 104 клеток/cm2. Для поддержания фенотипической стабильности используйте только клетки от 3-го по 6-й пассаж.
3. Характеристика стволовых клеток
- Оцените иммунофенотип изолированных клеток с помощью проточной цитометрии8,10. Характеристику клеток проведите на третьем пассаже. Включите неокрашенный отрицательный контроль и контроли компенсации с одиночным окрашиванием для каждого используемого флуорохрома.
- Доведите концентрацию клеток до 106/mL в PBS. Центрифугируйте при 800 x g в течение 10 min и дважды промойте осадок PBS8,10.
- Окрасьте клетки антителами к человеческим антигенам для мезенхимальных маркеров (CD44, CD73) и гемопоэтических маркеров (CD45) в разведениях, рекомендованных производителем (обычно 1:100 в PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Таблица материалов)8,10. Инкубируйте при 4 °C в течение 45 min в темноте. Дважды промойте PBS и ресуспендируйте в 300 µL PBS для сбора данных.
- Проанализируйте клетки с помощью программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии (Таблица материалов) для оценки иммунофенотипа (экспрессия CD44 и CD73 при использовании CD45 в качестве маркера исключения гемопоэтических клеток). Примените последовательный гейтинг: (а) гейтинг по рассеянию (FSC-A против SSC-A); (б) исключение дуплетов (FSC-H против FSC-A); (в) специфические для флуорохромов гейты, установленные относительно неокрашенных контролей. Укажите процент положительных клеток для каждого маркера вместе со стратегией гейтинга.
4. Определение безопасной концентрации материала (полумаксимальная эффективная концентрация, EC₅₀)
- Определите EC₅₀ с помощью программного обеспечения для статистического анализа (GraphPad Prism 9). Аппроксимируйте данные зависимости «доза-эффект» нелинейной регрессионной сигмоидальной кривой (четырехпараметрическая логистическая модель: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). Укажите значение EC₅₀ в µg/mL с 95% доверительным интервалом8.
- Приготовьте серийные разведения наноматериалов (50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 и 1.56 µg/mL) в 1 mL PBS. Перемешайте исходную суспензию на вортексе в течение 30 s, затем подвергните ультразвуковой обработке (ультразвуковой гомогенизатор, 40 W, 30 s включено/10 s выключено в течение 3 циклов при 4 °C) для обеспечения гомогенности суспензии. Стерилизуйте в боксе биологической безопасности под воздействием УФ-излучения в течение 30 min.
- Культивируйте стволовые клетки с плотностью 1 × 104 клеток/лунку в 96-луночных планшетах в течение 72 h с различными концентрациями и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего, чтобы рассчитать EC₅₀, используя четырехпараметрическую логистическую модель, описанную в пункте 4.1.
- Проводите эксперименты в трех повторностях (n = 3 независимые лунки на одну концентрацию) с использованием как минимум трех биологических повторностей. Представьте значения EC₅₀ как среднее ± SD и рассчитайте коэффициент вариации (CV%) между повторностями (допустимый CV <15%).
5. Оценка остеогенной и одонтогенной дифференцировки
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе оцениваются два взаимодополняющих пути дифференцировки с помощью параллельных анализов иммунофлуоресценции из одного и того же клеточного препарата. RANKL (шаг 5.5) служит остеогенным маркером; DMP-1 (шаг 5.6) служит одонтогенным маркером. Оба количественно определяются с помощью одной и той же методологии H-score (шаг 5.8). Проводите оба анализа на отдельных покровных стеклах, подготовленных одновременно.
- Рассейте стволовые клетки в шестилуночные планшеты с плотностью 4,5 × 105 клеток/лунку. Перед началом дифференцировки дайте клеткам прикрепиться в течение 24 ч в полной культуральной среде.
- Разделите образцы на четыре группы: отрицательный контроль (только DMEM), положительный контроль (среда для остеогенной/одонтогенной дифференцировки) и экспериментальные группы (наноматериалы при EC₅₀—производные безопасные концентрации).
- Приготовьте среду для остеогенной дифференцировки, дополнив DMEM 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 10 мМ β-глицерофосфат, 50 µg/mL аскорбиновую кислоту (L-аскорбат-2-фосфат) и 100 нМ дексаметазона. Заменяйте среду каждые 48 ч. Инкубируйте в течение 72 ч при 37 °C и 5% CO2₂.
- Измерение активности ЩФ
- Рассейте клетки в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку и инкубировать при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2₂ в течение 72 ч.
- Отоспирируйте культуральную среду, промойте лунки PBS и проведите лизис клеток, добавив 200 µL буфера для лизиса на лунку (0,1% Triton X-100 в PBS) и инкубирования при 4 °C в течение 10 мин при осторожном покачивании.
- Соберите лизат и центрифугируйте при 500 x г в течение 5 мин при 4 °C; используйте супернатант для всех последующих измерений активности ЩФ. Перенесите 50 µL каждого исследуемого образца и 100 µL стандартов п-нитрофенола в 96-луночный микротитрационный планшет. Добавьте буфер с субстратом АМФ (Таблица материалов) для запуска каталитической реакции.
- После повторной инкубации в течение 30 мин при 37 °C, остановите реакцию, добавив 50 µL по 0,5 М NaOH в каждую лунку. Немедленно измерьте оптическую плотность при 405 нм с помощью микропланшетного ридера (Таблица материалов).
- Постройте стандартный график зависимости абсорбции от концентрации п-нитрофенола и рассчитайте активность ЩФ в Ед/л.
- Определите общее содержание белка в том же клеточном лизате с помощью метода Брэдфорда или BCA-анализа. Нормализуйте активность ЩФ по общему содержанию белка и представьте конечные результаты в Ед/мг белка.
- Остеогенный маркер (RANKL)
- Оцените экспрессию белка RANKL с помощью иммунофлуоресценции. Сначала подготовьте изотипический контроль и контроль только с вторичными антителами: (а) в одних лунках замените первичные антитела изотипическим кроличьим IgG в той же концентрации, и (б) в других лунках полностью исключите первичные антитела.
- Фиксируйте клетки свежеприготовленным 4% раствором формальдегида в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Промойте трижды в PBS (по 5 минут каждый раз).
- Проведите пермеабилизацию с использованием 0,1% раствора Triton X-100 в PBS в течение 10 мин, затем выполните блокировку 5% нормальной сывороткой козы в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре для снижения неспецифического связывания. Без промывки непосредственно добавьте первичные антитела Rabbit Anti-RANKL в разведении 1:200 в блокирующем буфере (Таблица материалов) и инкубировать в течение ночи при 4 °C.
- Промойте трижды фосфатно-солевым буфером (PBS), затем инкубируйте с козьими антителами вторичными против IgG кролика, конъюгированными с флуорофором, в разведении 1:500 в блокирующем буфере (Список материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте8После инкубации со вторичными антителами трижды промойте образец буфером PBS (по 5 мин каждое) и переходите непосредственно к шагу 5.7 для заключения препарата.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Формальдегид (4% раствор) является токсичным фиксатором и вероятным канцерогеном. Приготовление и использование следует проводить только в сертифицированном вытяжном шкафу. Используйте нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Утилизируйте отходы в соответствии с правилами вашего учреждения.
ПРИМЕЧАНИЕ. Идентификация клеток подтверждается с помощью фазово-контрастной микроскопии и морфологических критериев перед проведением оценки иммунофлуоресценции (см. шаг 5.10).
- Одонтогенный маркер (DMP-1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно с этапом 5.5 проведите оценку экспрессии белка DMP-1 (белка дентинного матрикса-1) методом иммунофлуоресценции для анализа одонтогенной дифференцировки.- Используя отдельный набор покровных стекол из той же клеточной подготовки, повторите все этапы фиксации, пермеабилизации и блокировки, описанные в шаге 5.5, включая контроли с изотипическими антителами и контроли только с вторичными антителами.
- Без промывки после блокирования непосредственно добавьте первичные антитела к DMP-1 (см. Таблица материалов) в разведении 1:200 в блокирующем буфере и инкубировать в течение ночи при 4 °CТрижды промойте раствором PBS, затем инкубируйте с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором (используйте флуорохром, спектрально отличающийся от того, который использовался для RANKL; см. Таблица материалов) в разведении 1:500 в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре в темном месте.
- Получите флуоресцентные изображения при 10-кратном увеличении для оценки экспрессии DMP-1 в качестве индикатора дифференцировки в одонтобластоподобные клетки10После инкубации со вторичными антителами трижды промойте образец в PBS (по 5 мин каждый раз) и переходите непосредственно к этапу 5.7 для заключения препарата.
- Закрепите стекла, используя антифейдинговый агент для заключения препаратов (см. Таблица материалов) и оставить на ночь при комнатной температуре. Закрыть стекла с окрашиванием на RANKL и DMP-1 отдельно и четко промаркировать (например, "Группа RANKL 1" и "DMP-1, группа 1") перед визуализацией.
- Немедленно исследуйте препараты с помощью флуоресцентной микроскопии или храните при 4 °C в защищенном от света месте. Количественно определите экспрессию белка, оценив интенсивность окрашивания по стандартизированной четырехбалльной шкале: 0 (окрашивание отсутствует), 1+ (слабое), 2+ (умеренное) и 3+ (сильное).
- Получите изображения, используя идентичные настройки микроскопа (время экспозиции, мощность лазера и усиление) для всех экспериментальных групп. Применяйте одинаковые настройки независимо для каждого маркера (RANKL и DMP-1), чтобы обеспечить согласованность данных по каждому маркеру между группами.
- Оцените не менее пяти случайно выбранных полей зрения при большом увеличении (объектив x20) в каждой лунке. Оценку должны проводить два независимых слепых наблюдателя; укажите коэффициент каппа Коэна (приемлемое значение каппа ≥ 0,7).
- Вычислите H-балл по формуле: H-балл = Σ(i × Pi), где i = интенсивность окрашивания (1, 2 или 3), а Pi = процент клеток (0–100%) при каждом уровне интенсивности.
ПРИМЕЧАНИЕ: H-score варьируется от 0 до 30010. - Нормализуйте данные H-score по общему количеству клеток в поле зрения, определенному путем ручного подсчета всех видимых клеток в каждом поле при помощи фазово-контрастной микроскопии перед иммунофлуоресцентной визуализацией, чтобы учесть различия в плотности клеток между лунками.
- Рассчитайте и представьте отдельно H-баллы (H-scores) для RANKL (остеогенная конечная точка) и DMP-1 (одонтогенная конечная точка), чтобы обеспечить возможность прямого сравнения двух путей дифференцировки.
6. Оценка пролиферации и жизнеспособности
- Выполните подсчет клеток с использованием гемоцитометра и окрашивания трипановым синим для дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных клеток. Рассчитайте общее количество жизнеспособных клеток на 1 mL культуры. Для обеспечения статистической достоверности подсчитайте не менее 100 клеток в каждом образце.
- Проведите МТТ-тест для измерения митохондриальной метаболической активности8,10.
- Добавьте раствор МТТ до конечной концентрации 0,5 mg/mL (Таблица материалов) к клеткам и инкубируйте в течение 4 ч при 37 °C. Удалите раствор, добавьте солюбилизирующий агент (например, SDS-HCl; см. Таблицу материалов) и измерьте оптическую плотность при 570 nm с помощью спектрофотометра (референсная длина волны: 630–650 nm).
- Рассчитайте жизнеспособность клеток по формуле: Жизнеспособность (%) = (Оптическая плотность обработанных клеток / Оптическая плотность необработанных контрольных клеток) × 100. Значения >100% указывают на пролиферативную стимуляцию относительно отрицательного контроля. Используйте контрольную лунку без клеток (blank) для коррекции фона.
- Нормализуйте результаты по количеству клеток, используя параллельный подсчет с трипановым синим. Выполняйте все анализы в трех повторностях (n = 3 лунки/группа, ≥3 биологических повторов).
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Буфер для солюбилизации SDS-HCl является коррозийно-активным веществом. Работайте с ним, используя соответствующие СИЗ. Утилизируйте отходы, содержащие формазан, в соответствии с правилами вашего учреждения.
Результаты
Все представленные здесь результаты адаптированы из сопутствующих исследований4,8,9,10, проведенных той же исследовательской группой в соответствии с единым этическим одобрением учреждения (FDASU-Rec IM112105).
Характеристика наноматериалов и выделение стволовых клеток
Стандартизированный рабочий процесс на начальном этапе позволяет количественно подтвердить свойства скаффолда и фенотипы стволовых клеток. После синтеза подготовленные наноматериалы проверяют с помощью ПЭМ высокого разрешения и XRD для подтверждения размера частиц и кристалличности (Рисунок 1A,B). Параллельно с этим DPSCs или SCAPs, выделенные путем ферментативного переваривания, демонстрируют активную адгезию и пролиферацию в полной культурной среде. Анализ методом проточной цитометрии подтверждает иммунофенотип собранных клеток на 3-м пассаже, выявляя высокую экспрессию мезенхимальных маркеров (CD44, CD43) и подтверждая их негемопоэтическое происхождение по отсутствию CD45 (Рисунок 1C).
Определение безопасной концентрации материала и пролиферации
При культивировании стволовых клеток в последовательных разведениях наноматериалов (50–1.56 µg/mL) в течение 72 ч четырехпараметрическая логистическая регрессия количества жизнеспособных клеток позволяет получить надежное значение EC₅₀ (нелинейная сигмовидная модель «доза-ответ», как описано в шаге 4.1). Значения жизнеспособности по MTT, превышающие 100%, указывают на стимуляцию пролиферации относительно необработанного контроля, так как значения нормируются по группе отрицательного контроля (необработанные клетки приняты за 100%). Например, значение ~196% для Nano-NeoMTA2 отражает биоактивную стимуляцию митохондриальной активности, а не абсолютную выживаемость клеток >100%9.
В нескольких исследованиях с применением данного стандартизированного протокола были установлены значения EC₅₀, равные 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 и 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10, с использованием четырехпараметрической логистической модели (шаг 4.1), что подтверждает безопасные рабочие концентрации для использования в анализах на дифференцировку, описанных в данном протоколе. Эти значения внесены в Таблицу 1 в качестве репрезентативных показателей валидации.
Количественная оценка остеогенной и одонтогенной дифференцировки (оценка по двум маркерам)
Метод двойной иммунофлуоресценции позволяет получить два различных взаимодополняющих показателя результата из одного и того же препарата клеток. Для остеогенной оценки H-баллы RANKL статистически значимо различали все четыре группы: клетки, культивированные с Nano-NeoMTA2, демонстрировали существенно более высокую экспрессию RANKL, чем отрицательный контроль, что согласуется с усиленной активацией остеобластоподобных клеток (Рисунок 2A, Таблица 1)8,9. При одонтогенной оценке H-баллы DMP-1 выявили выраженную одонтобластоподобную дифференцировку в DPSC, культивируемых с Nano-NeoMTA2, при этом H-баллы были значимо выше, чем в группах с наногидроксиапатитом и отрицательным контролем, что подтверждает преимущественную направленность дентиногенеза (Рисунок 3A, Таблица 1)10. Идентичность клеток была подтверждена с помощью фазово-контрастной микроскопии и по характерным морфологическим критериям (веретеновидная или полигональная морфология) перед проведением оценки.
Активность ЩФ была спектрофотометрически определена для всех групп при 405 нм, служа ранним ферментативным маркером как остеогенной, так и одонтогенной дифференцировки (Таблица 1). Спектрофотометрический МТТ-анализ подтвердил, что все наноматериалы в безопасных концентрациях, рассчитанных на основе EC₅₀, обеспечивали высокую жизнеспособность клеток по сравнению с отрицательным контролем, что согласуется с представленными репрезентативными значениями (Таблица 1).
Неоптимальные и неудачные результаты экспериментов
Неоптимальные результаты обобщены в таблице 2. Низкая жизнеспособность клеток при MTT-анализе обычно указывает на то, что концентрация наноматериала превышает порог EC₅₀ или что УФ-стерилизации было недостаточно. Непостоянное поглощение при определении ALP (CV > 20%) обычно свидетельствует о неравномерной плотности посева или неполной гомогенизации лизирующего буфера. Слабый или отсутствующий сигнал иммунофлуоресценции для RANKL или DMP-1 чаще всего является результатом инактивации антител, недостаточной пермеабилизации или чрезмерной фиксации; решение этих проблем заключается в использовании свежего 4% формальдегида и одноразовых аликвот антител. Перекрестная реактивность между каналами RANKL и DMP-1 должна быть исключена путем анализа изображений контрольных образцов только со вторичными антителами перед проведением подсчета.
Рисунок 1: Стандартизированная характеристика наноматериалов и валидация фенотипа стволовых клеток. (A) Спектры XRD, подтверждающие кристаллическую фазу и структурную целостность наночастиц. (B) Репрезентативные ПЭМ-изображения, демонстрирующие наноразмер частиц, морфологию и гомогенную дисперсию синтезированных биоматериалов; сравнение NeoMTA2 и гидроксиапатита. Изображения с малым увеличением представлены для (a) NeoMTA2 и (b) гидроксиапатита, а изображения с большим увеличением приведены для (c) NeoMTA2 и (d) гидроксиапатита. Масштабные отрезки показаны в левом нижнем углу. (C) Протокол гейтирования при проточной цитометрии для характеристики стволовых клеток. Репрезентативные многопараметрические диаграммы рассеяния (dot plots) показывают клетки, окрашенные на CD44, CD73 (помечено как CD43 PE на исходных графиках) и CD45. Субпопуляции CD44+ и CD73+ были выделены (гейтированы) в соответствии с экспрессией CD45. Панели A и C адаптированы из работы Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) , а панель B адаптирована из работы Habib et al.10 (CC BY-NC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2Количественная и полуколичественная оценка остеогенной дифференцировки методом иммунофлуоресцентного окрашивания на RANKL. (A) Репрезентативные микрофотографии высокого разрешения, полученные методом иммунофлуоресценции, демонстрирующие экспрессию критического остеогенного белкового маркера RANKL в микроокружении 2D-скаффолда: (a) клетки отрицательного контроля образуют небольшие колонии со слабой мембранной экспрессией RANKL, тогда как (b) клетки положительного контроля демонстрируют увеличение количества остеобластоподобных колоний с плотной гомогенной экспрессией. Стволовые клетки, обработанные (c) NHAP, (d) NHAP/хитозаном и (e) наночастицами биоактивного стекла, проявляют признаки глубокой дифференцировки, характеризующейся образованием крупных слившихся остеобластоподобных колоний с интенсивной гомогенной локализацией RANKL как в мембране, так и в ядре; адаптировано из: Эльшахат и соавт.4. (B) Столбчатые диаграммы, представляющие количественную оценку экспрессии RANKL по H-score в различных исследованиях. Применение методики H-score для нормализации данных иммунофлуоресценции. Путем математического интегрирования интенсивности визуального окрашивания (по шкале от 0 до 3) с процентом положительно окрашенных клеток H-score преобразует качественную микроскопию в надежный полуколичественный показатель, значительно снижая субъективную предвзятость наблюдателя. (а) Сравнение Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) и наночастиц биоактивного стекла (NBG; 500 µg/mL) по сравнению с положительным контролем в остеогенной среде (OM-PC) и отрицательным контролем в среде DMEM (DMEM-NC). NBG вызвал наиболее высокий профиль экспрессии (p &p < 0,001). Адаптировано из Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Оценка наногидроксиапатита (NHAP; 10µg/mL), композит NHAP/хитозан (10 µg/mL), и NBG (500 µg/mL) по сравнению с контрольными группами, при этом для NHAP/хитозана наблюдались максимальные значения H-score. Адаптировано из Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Оценка Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) по сравнению с NHAP (10 µg/mL) и контрольных групп, что демонстрирует значительно повышенную экспрессию RANKL в Nano-NeoMT; адаптировано из: Zaki et al.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения иммунофлуоресценции и анализ H-показателя. (A) Оценка экспрессии белка дентинного матрикса (DMP-1) методом иммунофлуоресцентной микроскопии в экспериментальных группах; зеленая флуоресценция указывает на положительное окрашивание поликлональными антителами к DMP-1. (a) Отрицательный контроль: стволовые клетки пульпы зуба человека (hDPSCs) в недифференцирующей среде (UM) демонстрируют небольшие клеточные агрегаты со слабой, равномерной экспрессией DMP-1 (+). (b) Положительный контроль: hDPSCs в одонтогенной среде (OM) демонстрируют расширение колоний, характеризующихся плотными, гомогенными сигналами DMP-1 (++). (c) Наногидроксиапатит (10 μg/mL) и (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): дифференцированные hDPSCs образуют крупные, сливающиеся колонии одонтобластоподобных клеток, демонстрирующих выраженную гомогенную экспрессию DMP-1, локализованную в мембранах и ядрах. Увеличение: ×10. Желтые круги указывают на одонтобластоподобные колонии; желтые стрелки обозначают интенсивную экспрессию DMP-1. (B) Столбчатая диаграмма, представляющая количественную оценку H-показателя экспрессии белка дентинного матрикса в исследуемых группах. Между оцениваемыми группами наблюдалось высокозначимое различие, при этом самый высокий H-показатель был отмечен в когорте Nano-NeoMTA2 (169.33 ± 4.04), за которой следовал наногидроксиапатит (140.33 ± 2.52) и отрицательный контроль (15.33 ± 1.53). Панели A и B адаптированы из Habib et al.10 (CC BY-NC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Анализ / Параметр | Наноматериал / тип клеток | Репрезентативное значение (среднее ± СО) | Нормализация | Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. |
| Жизнеспособность клеток (МТТ-тест) | ||||
| Жизнеспособность по МТТ | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAP-белки | ~196% (OD = 1,56 ± 0.24) | Нормализовано относительно необработанного контроля (DMEM-NC = 100%) | Абдельазиз и др.⁹ |
| Жизнеспособность по МТТ | Хитозан-нГК (10 µg/mL) / SCAPs (синаптические белки, ассоциированные с белками-помощниками) | ~99.97% | Нормализовано относительно необработанного контроля (DMEM-NC = 100%) | Эль-Шахат и др.⁴ |
| Жизнеспособность по методу МТТ — положительный контроль | ОМ-ПК / SCAPs | 113.46% (OD = 0,93 ± 0.03) | Нормировано относительно необработанного контроля (DMEM-NC = 100%) | Абдельазиз и др.⁹ |
| Определение жизнеспособности методом МТТ — отрицательный контроль | DMEM-NC / SCAPs | 100% (ОП = 0,82 ± 0.02) — Контрольный базовый уровень | DMEM-NC, принятый за 100% контроль для всех групп | Абдельазиз и др.⁹ |
| Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) | ||||
| Активность ЩФ | Биоактивные стеклянные наночастицы (500 µg/mL) / SCAPs (специфические антигены цитоплазмы сперматозоидов) | 69.86 ± 0,98 Ед/л | Нормализовано по общему содержанию белка (Ед/мг белка, метод Брэдфорд/BCA-анализ) | Абдельазиз и др.⁹ |
| Активность ЩФ — положительный контроль | ОМ-ПК / SCAPs | 77.68 ± 1,28 Ед/л | Нормализовано по общему содержанию белка (Ед/мг белка, метод Брэдфорда/BCA-анализ) | Абдельазиз и др.⁹ |
| Активность ЩФ — отрицательный контроль | DMEM-NC / SCAPs | 55.81 ± 1,6 Ед/л | Нормализовано по общему содержанию белка (ед./мг белка, метод Брэдфорда/BCA) | Абдельазиз и др.⁹ |
| Безопасная концентрация материала (EC₅₀) | ||||
| Электропроводность₅₀ (SCAP — специфические белки, активирующие синусоидальные капилляры) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | Четырехпараметрическая логистическая модель (нелинейная сигмоидальная зависимость «доза-эффект), GraphPad Prism 9) | Заки и др.⁸ |
| Электропроводность₅₀ (ДСКп) | Nano-NeoMTA2 / стволовые клетки пульпы глубокого слоя (СКПГС) | 9.92 µg/mL | Четырехпараметрическая логистическая модель (нелинейная сигмоидальная зависимость «доза — ответ», GraphPad Prism 9) | Хабиб и др.10 |
| H-Score — экспрессия белка RANKL (остеогенный маркер) | ||||
| H-показатель (RANKL) Остеогенный маркер | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs (специфические для цитоплазмы белки-активаторы) | 164 ± 4 (шкала 0–300) | Общее количество видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Заки и др.⁸ |
| H-балл (RANKL) Остеогенный маркер | нГА (10 µg/mL) / SCAP (цитоплазматические белки, активируемые стрессом) | 68 ± 3 (шкала 0–300) | Общее количество видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Заки и др.⁸ |
| H-балл (RANKL) Положительный контроль | ОМ-ПК / SCAPs | 84 ± 1 (шкала 0–300) | Общее количество видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Заки и др.⁸ |
| H-показатель (RANKL) Отрицательный контроль | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (шкала 0–300) | Общее количество видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Заки и соавт.⁸ |
| H-score — экспрессия белка DMP-1 (одонтогенный маркер) | ||||
| H-Score (DMP-1) Одонтогенный маркер | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / ДСК (дентальные стволовые клетки) | 169.33 ± 4.04 (шкала 0–300) | Общее количество видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Хабиб и др.10 |
| H-Score (DMP-1) Одонтогенный маркер | нГА (10 µg/mL) / ДПСК (дентальные стволовые клетки пульпы) | 140.33 ± 2.52 (шкала 0–300) | Общее число видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Habib и соавт.10 |
| H-Score (DMP-1) Отрицательный контроль | DMEM-NC / ДСК (зубные пульпальные стволовые клетки) | 15.33 ± 1.53 (шкала 0–300) | Общее количество видимых клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Хабиб и др.10 |
| H-балл (DMP-1) Одонтогенный маркер [Положительный контроль -OM-PC] | ОМ-ПК / ДПСК | ~103 индекс H (H-score) (шкала 0–300) | Общее количество клеток в поле зрения (фазово-контрастная микроскопия) | Хабиб и др. Eur Endod J, 202610 |
| H-показатель = Σ(i × Pi): i = интенсивность окрашивания (1, 2 или 3); Pi = процент клеток на каждом уровне интенсивности (0–100%); диапазон 0–300. Жизнеспособность по МТТ, выраженная относительно группы DMEM-NC, принятой за 100% (контрольный образец). Активность ЩФ, выраженная в Ед/л на основании ферментативного дефосфорилирования п-нитрофенилфосфата; далее нормализованная по общему содержанию белка (Ед/мг белка). OM-PC = остеогенно/одонтогенная индукционная среда (положительный контроль). DMEM-NC = модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (отрицательный контроль). | ||||
Таблица 1: Репрезентативные результаты стандартизированного рабочего процесса оценки in vitro. Репрезентативные количественные результаты из ранее опубликованных исследований, демонстрирующие пролиферацию клеток, активность щелочной фосфатазы и иммунофлуоресцентный анализ, выполненные с использованием стандартизированного протокола.
| Наблюдаемая проблема | Потенциальная причина | Рекомендуемое решение |
| Низкая жизнеспособность клеток в МТТ-тесте (OD < необработанного контроля) | Концентрация наноматериала превышает EC₅₀, недостаточная УФ-стерилизация или неадекватная дисперсия наночастиц. | Повторно определить EC₅₀ (Раздел 4). Увеличить время УФ-стерилизации до 30 min. Проверить однородность суспензии наночастиц с помощью зондового ультразвукового воздействия (40 W, 30 s вкл/выкл, 3 цикла при 4 °C) непосредственно перед использованием. |
| CV жизнеспособности в МТТ-тесте >15% между повторами | Ошибка пипетирования, неравномерный посев клеток или варьирование времени/температуры инкубации с МТТ. | Использовать калиброванный многоканальный дозатор для всех добавлений. Подтвердить плотность посева с помощью гемоцитометра перед высевом на планшет. Соблюдать строгий режим инкубации в течение 4 h при 37 °C в увлажненном CO₂-инкубаторе. Использовать «холостую» лунку для коррекции фона. |
| Противоречивые значения абсорбции ALP (CV >20% между лунками) | Неравномерная плотность посева клеток, неполный лизис клеток или нестабильность пипетирования при добавлении субстрата. | Строго придерживаться плотности 1 × 10⁴ клеток/лунка в 24-луночных планшетах. Тщательно перемешивать буфер для лизиса на вортексе перед использованием. Соблюдать одинаковое время инкубации при лизисе (10 min, 4 °C, осторожное покачивание). Проверить фоновую абсорбцию в «холостой» лунке без клеток. |
| Слабый или отсутствующий сигнал иммунофлуоресценции RANKL (шаг 5.4a) | Инактивация антител из-за неправильного хранения, избыточная фиксация, снижающая доступность эпитопа, или недостаточная пермеабилизация. | Готовить свежий 4% формальдегид непосредственно перед использованием. Добавить 0.1% Triton X-100 для пермеабилизации (10 min, RT) перед блокировкой. Титровать разведение первичных антител (начать с 1:200). Использовать срез ткани в качестве положительного контроля. Разливать сток антител по аликвотам, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. |
| Слабый или отсутствующий сигнал иммунофлуоресценции DMP-1 (шаг 5.4b) | Инактивация антител в результате циклов замораживания-оттаивания, неоптимальное разведение первичных антител или несовместимость видов животных, в которых были получены первичные и вторичные антитела. | Разлить антитела anti-DMP-1 по аликвотам, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания. Титровать разведение, начиная с 1:200. Подтвердить совместимость видов между первичными (DMP-1) и вторичными антителами. Использовать срез ткани дентина в качестве положительного контроля для DMP-1. |
| Перекрестная реактивность между каналами флуоресценции RANKL и DMP-1 | Спектральное перекрывание эмиссионных спектров при использовании одного и того же флуорохрома для обоих вторичных антител или недостаточный разнос каналов на флуоресцентном микроскопе. | Использовать спектрально различающиеся флуорохромы вторичных антител для RANKL и DMP-1 (например, Alexa Fluor 488 для одного маркера и Alexa Fluor 594 для другого). Перед оценкой независимо изучить изображения контроля только с вторичными антителами для каждого канала. Получать изображения RANKL и DMP-1 по отдельности, используя режим последовательного сбора данных. |
| Высокий неспецифический фон при иммунофлуоресцентном окрашивании | Недостаточная блокировка белков, слишком высокая концентрация вторичных антител или неадекватные этапы промывки между инкубациями. | Увеличить время блокировки до 2 h при RT. Увеличить разведение вторичных антител до 1:1000. Подтвердить специфичность с помощью контроля только с вторичными антителами (без первичных). Убедиться в полноте всех промывок в PBS (3 × 5 min каждая). |
| Межэкспертная вариабельность H-score (каппа Коэна <0.7, шаг 5.6) | Непоследовательное применение четырехступенчатой шкалы интенсивности окрашивания (0, 1+, 2+, 3+) разными наблюдателями или недостаточная калибровка перед сессиями оценки. | Провести совместную калибровку с использованием репрезентативных тренировочных изображений перед формальной оценкой. Использовать идентичные настройки отображения изображений (яркость, контрастность) для всех наблюдателей. Оценивать минимум пять полей зрения при большом увеличении на лунку и рассчитывать каппу через каждые 10 полей для мониторинга дрейфа. |
| Кривая EC₅₀ не сходится или плохое соответствие модели (шаг 4.1) | Недостаточное количество точек данных, узкий диапазон концентраций или недостижение однородности суспензии перед посевом. | Расширить диапазон серийных разведений, включив как минимум 6 концентраций в пределах 50–1.56 µg/mL. Убедиться, что зонковая соникация проводится непосредственно перед каждым этапом разведения. Повторить опыт минимум с 3 независимыми биологическими повторами. Подтвердить, что CV <15% между повторами. |
Таблица 2: Критические параметры и руководство по поиску и устранению неисправностей. Распространенные технические проблемы, возникающие при выполнении протокола, их потенциальные причины и рекомендуемые решения для повышения воспроизводимости экспериментов и качества данных. Сокращения: CV = коэффициент вариации; RT = комнатная температура.
Обсуждение
Критически важные этапы данного протокола включают точное определение EC₅₀, получение гомогенной суспензии наноматериалов и нормализацию результатов биологического анализа. Расчет EC₅₀ методом нелинейной регрессии (четырехпараметрическая логистическая модель) обеспечивает более строгую оценку зависимости «доза-эффект», чем линейная интерполяция, и следует отдавать ему предпочтение при наличии достаточного количества точек данных13,14. Обеспечение гомогенности суспензии наночастиц с помощью ультразвуковой обработки зондовым соникатором непосредственно перед воздействием на клетки имеет решающее значение; плохо диспергированные суспензии приводят к получению недостоверных кривых «доза-эффект» и искажают значения EC₅₀. Для новых материалов, таких как NeoMTA2, измельчение до наноразмеров является необходимым первым этапом, поскольку размер частиц в макромасштабе существенно изменяет поверхностную реакционную способность и последующую биоактивность13,14. Если при концентрациях, которые должны быть безопасными, наблюдается низкая жизнеспособность клеток, исследователям следует проверить протокол УФ-стерилизации и повторно изучить процедуры измельчения и диспергирования перед повторным проведением анализа EC₅₀10.
Основой данного протокола является использование двух комплементарных маркеров иммунофлуоресценции, которые отражают различные, но частично перекрывающиеся пути дифференцировки. Повышение экспрессии RANKL в остеобластоподобных клетках отражает остеогенную сигнализацию, стимулируемую ионами кальция, и пропорционально количеству остеогенных клеток8,9, в то время как экспрессия DMP-1 служит специфическим индикатором одонтобластоподобной дифференцировки и дентиногенной активности, что особенно актуально, когда целевой популяцией клеток являются DPSCs10. Путем количественного определения обоих маркеров с использованием методики H-score данный протокол позволяет исследователям различать остеогенную и одонтогенную линии дифференцировки в рамках единой стандартизированной системы анализа, что является преимуществом по сравнению с методами с одним маркером, которые не позволяют разграничить формирование костной и дентиновой тканей. Для обеспечения сопоставимости результатов в различных исследованиях во всех публикациях с использованием данного протокола следует приводить значения H-score для RANKL и DMP-1. Чтобы избежать перекрытия каналов, исследователям следует использовать спектрально различающиеся флуорохромы для двух вторичных антител; перед началом подсчета необходимо проанализировать изображения контрольных образцов, содержащих только вторичные антитела.
При адаптации данного протокола к другим биоматериалам или клеточным моделям могут потребоваться некоторые методологические модификации. Для высокоопаковых или окрашенных скаффолдов интерференция с абсорбцией MTT при 570 nm может потребовать использования альтернативного теста на жизнеспособность, такого как CellTiter-Glo (люминесценция) или PrestoBlue (восстановление резазурина), которые менее подвержены оптическим помехам со стороны материалов скаффолда. Исследователям, использующим SCAPs вместо DPSCs, следует учесть, что SCAPs склонны проявлять более сильную экспрессию RANKL, что отражает их более выраженный остеогенный потенциал, в то время как DPSCs демонстрируют более выраженную экспрессию DMP-1, что свидетельствует об их более сильной предрасположенности к одонтогенному/дентиногенному направлению дифференцировки. Номер пассажа является критической переменной: следует избегать использования клеток после 6 пассажа, так как они могут проявлять сниженную способность к дифференцировке и измененную экспрессию поверхностных маркеров.
Ограничения данной методологической базы включают короткий период оценки (72 ч), который может не охватить события минерализации на поздних стадиях, обычно требующие от 14 до 21 дня. Отсутствие валидации in vivo представляет собой значительный трансляционный пробел. Использование H-score вносит вероятность вариабельности оценок; показатели межэкспертной надежности (каппа Коэна), представленные в разделе 5.10, должны быть включены во все публикуемые результаты.
Данный подход обладает несколькими преимуществами по сравнению с существующими методами анализа по одной конечной точке. Традиционные тесты на остеогенную дифференцировку часто опираются исключительно на окрашивание ализарином красным или определение активности ALP в одной временной точке. Интеграция скрининга жизнеспособности с помощью MTT-теста, количественного определения активности ALP и иммунофлуоресцентного H-скоринга RANKL + DMP-1 в рамках единого рабочего процесса обеспечивает многопараметрический результат, позволяющий проводить прямое статистическое сравнение различных типов скаффолдов в идентичных экспериментальных условиях. Описанные стратегии нормализации — выражение активности ALP на mg белка, представление результатов MTT в процентах от необработанного контроля и нормализация H-скора по общему количеству клеток в поле зрения — позволяют устранить влияние межлуночной вариабельности4,8.
В будущих исследованиях данную методологию можно будет применить для оценки влияния биоматериалов на маркеры воспаления, ангиогенный ответ или при использовании альтернативных моделей стволовых клеток. Последовательность анализа также может быть адаптирована для форматов 3D-скаффолдов. В конечном итоге внедрение этого стандартизированного подхода в различных независимых лабораториях будет способствовать проведению значимых метааналитических сравнений эффективности скаффолдов в доклинических исследованиях в области регенеративной стоматологии15.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Нет данных
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| культуральные планшеты на 24 лунки | Corning | 3527 | Используется для анализа ЩФ |
| 96-луночные планшеты | Corning | 3596 | Используется для измерения абсорбции ЩФ и проведения МТТ-тестов |
| набор для анализа АЛФ | Abcam | ab83369 (или эквивалент) | Используется для измерения активности щелочной фосфатазы |
| Буфер для субстрата ЩФ (2-амино-2-метил-1-пропанол) | Sigma-Aldrich | Нет данных | Используется для инициации каталитической реакции ЩФ |
| Гидроксид аммония (NH₄OH)4ОН) | Данные отсутствуют | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Используется для регулировки pH при синтезе наногидроксиапатита. КОРРОЗИОННО АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО |
| Первичные антитела к DMP-1 | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. Я готов выполнить перевод в соответствии с вашими профессиональными требованиями к научному стилю, терминологии и точности для контента JoVE. | Одонтогенный маркер; разведение 1:200 в блокирующем буфере; в течение ночи при 4 °C |
| Антитела к CD44 человека (CD44-FITC) | Beckman Coulter | Нет данных | Используется для проточной цитометрии; позитивный маркер мезенхимальных стволовых клеток |
| Антитело к CD45 человека (CD45-PC5) | Beckman Coulter | Данные отсутствуют | Используется для проточной цитометрии; негативный маркер гемопоэтического ряда |
| Антитела к CD73 человека (CD73-PE) | Beckman Coulter | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте контент, который необходимо перевести. Я готов приступить к профессиональному переводу ваших материалов JoVE на русский язык, соблюдая все указанные требования к научной терминологии, академическому стилю и точности технических протоколов. | Используется для проточной цитометрии; положительный маркер мезенхимальных стволовых клеток |
| Автоклав (гидротермальный реактор) | Tuttnauer | Поскольку исходный текст не был предоставлен (N/A), пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести. Я готов приступить к переводу вашего научно-образовательного контента JoVE на русский язык, соблюдая все указанные требования к терминологии, академическому стилю и точности протоколов. | Используется для гидротермальной обработки наногидроксиапатита при 140 °C, 0,3 МПа |
| Набор для определения концентрации белка методом БКА (BCA Protein Assay Kit) | Thermo Fisher Scientific | 23225 (или эквивалент) | Используется для определения общей концентрации белка с целью нормализации активности щелочной фосфатазы (ЩФ) |
| CO2 инкубатор | Thermo Fisher Scientific | Поскольку исходный текст не был предоставлен, я не могу выполнить перевод. Пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести на русский язык. | Установить на 37 °C и 5% CO22 для всех этапов культивирования клеток |
| Коллагеназа I типа | Sigma-Aldrich | C0130 | Используется для ферментативного переваривания тканей зуба при выделении стволовых клеток |
| DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Базальная питательная среда; также используется в качестве группы отрицательного контроля |
| Фетальная бычья сыворотка (ФБС) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Добавка для полной питательной среды; FBS, сертифицированная для использования с МСК, применяется в среде для дифференцировки |
| Проточный цитометр (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Используется для иммунофенотипирования стволовых клеток |
| Программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии (Navios) | Beckman Coulter | Поскольку исходный текст не был предоставлен, я не могу выполнить перевод. Пожалуйста, вставьте текст, который необходимо перевести на русский язык. | Используется для гейтирования и анализа данных панелей проточной цитометрии |
| Флуоресцентный микроскоп | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Используется для иммунофлуоресцентной визуализации и расчета H-score |
| Лиофилизатор (сублимационная сушилка) | Labconco | Данный раздел пуст. | Используется для высушивания осадков наноматериалов при −50 °C |
| Вторичное антитело: козьи антитела к IgG кролика (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Флуоресцентное вторичное антитело; разведение 1:500; 1 ч при комнатной температуре |
| Вторичные антитела: козьи антитела к IgG кролика (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (или эквивалент) | A-11012 (или эквивалент) | Спектрально различающиеся вторичные антитела, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания DMP-1 при проведении мультиплексного окрашивания |
| программное обеспечение GraphPad Prism | Программное обеспечение GraphPad | Версия 9 | Используется для ЭКГ50 расчеты и статистический анализ |
| Гемоцитометр | Нойбауэра | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Используется для ручного подсчета клеток и определения общего количества клеток для нормализации H-показателя (H-score) |
| Инвертированный фазово-контрастный микроскоп | Olympus | Нет данных | Используется для ежедневного мониторинга роста и морфологии клеток |
| Среда для заключения препаратов с антифейдинговым эффектом (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Используется для заключения препаратов на предметные стекла после иммунофлуоресцентного окрашивания |
| реагент МТТ | Invitrogen | M6494 | Используется для оценки метаболической активности клеток; 0,5 мг/мл, 4 ч при 37 °C |
| Наногидроксиапатит (НГАП) | Nanogate, Каир, Египет | Поскольку исходный текст не был предоставлен, я готов приступить к переводу, как только вы пришлете контент. Пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести на русский язык. | Синтезированы методом осаждения из раствора или приобретены в коммерческих источниках; используются в концентрации 10 µg/mL |
| порошок NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте контент, который необходимо перевести. Я готов приступить к профессиональному переводу ваших материалов JoVE на русский язык в соответствии со всеми указанными требованиями к научной терминологии, стилю и точности. | Исходный материал для приготовления Nano-NeoMTA2 с помощью планетарной шаровой мельницы |
| Нормальная сыворотка козы | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Поскольку исходный текст не был предоставлен, я не могу выполнить перевод. Пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести на русский язык. | Используется для блокировки (5% в PBS) перед нанесением первичных антител |
| Среда для остеогенной/одонтогенной дифференцировки | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Нет данных | Среда положительного контроля; содержит DMEM, FBS, аскорбат, бета-глицерофосфат и дексаметазон |
| Параформальдегид (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | Используется для фиксации клеток перед иммунофлуоресцентным анализом. ТОКСИЧНО — использовать в вытяжном шкафу |
| ФСБ (фосфатно-солевой буфер, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Используется для промывки клеток, разведения антител и суспендирования наноматериалов |
| Раствор пенициллина и стрептомицина | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Антибиотиковая добавка; используется в концентрации 1% в полной питательной среде |
| Планетарная шаровая мельница | Retsch (или эквивалент) | PM 400 | Используется для измельчения порошка NeoMTA2 до наноразмеров; 350 об/мин, 10 ч |
| Стандарты п-нитрофенола | Sigma-Aldrich | Нет данных | Используется для построения стандартной кривой активности щелочной фосфатазы (ЩФ) |
| Первичные антитела к RANKL кролика | Abcam | ab9957 | Остеогенный маркер; разведение 1:200; в течение ночи при 4 °C |
| Изотипический контрольный антитело IgG кролика | Данные отсутствуют | Отрицательный контроль для иммунофлуоресценции; эквивалентная концентрация первичных антител | |
| раствор для солюбилизации SDS-HCl | Sigma-Aldrich | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Используется для растворения кристаллов формазана МТТ. КОРРОЗИЙНО ОПАСНО |
| Плетятки для культивирования тканей на шесть лунок | Corning | 3516 | Используется для анализов на дифференцировку |
| Гидроксид натрия (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (или эквивалент) | Данные отсутствуют | Используется для остановки реакции ЩФ перед измерением оптической плотности; КОРРОЗИЙНОЕ ВЕЩЕСТВО |
| Соникатор (зондальный / ультразвуковая ванна) | Branson Ultrasonics | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. Я готов приступить к профессиональному переводу вашего научно-образовательного контента JoVE на русский язык, соблюдая все ваши требования к терминологии, стилю и академическому регистру. | Используется для диспергирования наночастиц перед проведением биологических анализов |
| культуральные флаконы T-75 | Corning | 430641 | Используется для экспансии стволовых клеток |
| ТЭОС (тетраэтилортосиликат) | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Прекурсор кремния для золь-гель синтеза биоактивного стекла 45S5. ЛЕГКОВОСПЛАМЕНЯЮЩЕЕ ВЕЩЕСТВО |
| Просвечивающий электронный микроскоп | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Используется для характеристики размера и морфологии наноматериалов |
| Triton X-100 (0,1% в PBS) | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Используется для пермеабилизации клеток перед иммунофлуоресцентным окрашиванием |
| Раствор трипанового синего (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | Используется для оценки жизнеспособности клеток |
| Рентгеновский дифрактометр (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Используется для кристаллографического анализа наночастиц |
Ссылки
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.