Выделение микробиоты, связанной с семенами томатов, посредством контролируемого прорастания и сравнительного культивирования

Краткое содержание

Этот протокол сочетает стандартизированную стерилизацию поверхности семян с контролируемым прорастанием, обеспечивая воспроизводимую изоляцию микробиоты, связанной с семянными семянами, во время перехода от семян к саженцу. Этот подход способствует восстановлению культивируемых микроорганизмов, которые недостаточно представлены в сухих семенах, и поддерживает сравнительные культурные исследования на ранних этапах развития саженцев.

Аннотация

Поверхностная стерилизация — это критический, но часто недостаточно оптимизированный этап в исследованиях, направленных на изоляцию микроорганизмов, связанных с семенами, поскольку чрезмерно жёсткие методы обработки могут уменьшить или искажать эндогенные микробные популяции. Этот протокол представляет воспроизводимый подход к выделению микробиоты, связанной с культивируемыми семенами томатов, с использованием поверхностной стерилизации, основанной на ранее проверенных методологиях, в сочетании с контролируемым прорастанием семян. Вместо определения универсально оптимальных методов стерилизации, подход применяет стандартизированные условия, которые можно корректировать в соответствии с характеристиками семян при минимализации смещения и сохранении эндогенных микробных популяций.

Для усиления восстановления культивируемых микроорганизмов, связанных с переходом от семян к проростку, протокол включает контролируемый этап прорастания перед микробной изоляцией. В отличие от традиционных методов, основанных на мацерации сухих, непроросших семян, контролируемое прорастание способствует микробной активации при переходе от семени к проростку в стерильных условиях. Сравнительный анализ эквивалентных биологических репликат на основе колониообразующих единиц (CFU), каждый из которых состоит из объединённого материала из 3–5 сухих семян или 3–5 проросших сеянцев, выявил заметный сдвиг в культивируемом сообществе после прорастания. Роды, слабо представленные в сухих семенах, обогащались после прорастания, тогда как другие таксоны, более распространённые в сухих семенах, сократились в относительной репрезентации, что подтверждает исследования ранних взаимодействий растений и микробов во время установления саженцев.

В разных биологических репликах роды, такие как Stutzerimonas, Stenotrophomonas и Priestia , постоянно обогащались среди изолятов, извлечённых из проросших саженцев, тогда как Paenibacillus оставался обильным в разных условиях, но демонстрировал заметные изменения в составе на уровне вида. Интегрируя стандартизированные условия стерилизации с контролируемым прорастанием и сравнительным анализом сухого и прорастающего материала, этот протокол обеспечивает надёжную и воспроизводимую основу для культурной изоляции микробиоты, ассоциированных с семенами, с потенциальной функциональной значимостью в раннем развитии саженцев, и поддерживает исследования ранних взаимодействий растений и микробов во время установления саженцев.

Введение

Семена содержат разнообразные микробные сообщества, состоящие из бактерий и грибов, связанных как с внутренними тканями, так и с внешними^{поверхностями 1,2,3}. Эти микроорганизмы всё больше признаются неотъемлемой частью биологии растений, поскольку могут влиять на их характеристики с самых ранних стадий развития, включая прорастание, формирование сеянцев и реакции на биотический и абиотический^{стресс 1,2,3}. С экологической точки зрения семена функционируют не только как пропагулы для размножения растений, но и как резервуары микробного инокуля, что делает их ключевой точкой входа для понимания того, как микробиомы, связанные с растениями, инициируются и поддерживаются на протяжении всего жизненного цикла ^{растений 1,2,3}.

Микроорганизмы, связанные с семенами, могут стать первым микробным инокулумом, с которым сталкивается новое растение, и, следовательно, способствовать формированию микробиома в процессе перехода от семени к ^{саженцам 1,3,4}. Этот ранний инокулум может влиять на микробные сообщества, которые впоследствии колонизируют корни и другие растительные компартменты, что влияет на установление растений и последующее взаимодействие между растениями^{и микробами 1,4}. Кроме того, часть семенной микробиоты может передаваться вертикально через репродуктивные структуры, такие как цветы, яйцеклетки и пыльца, что позволяет микробным популяциям сохраняться на протяжении поколений^{растений 4,5}. Эта межпоколенческая преемственность говорит о том, что некоторые семенные микроорганизмы могут постоянно вносить вклад в приспособленность и приспособленность растений.

Функционально микроорганизмы, связанные с семенами, могут влиять на работу хозяина через несколько механизмов, включая выработку фитогормонов, антимикробных соединений и других биоактивных метаболитов, которые модулируют развитие растений или подавляют конкурентов и ^{патогенов 5,6,7.} Микробные популяции, передающиеся семянными, также, по-видимому, сосуществуют благодаря разному использованию ресурсов и экологическому разделению, что говорит о том, что семена представляют собой селективную среду обитания, а не пассивный контейнер микробного^{разнообразия 7}. В совокупности эти результаты подтверждают идею, что семена содержат микробные популяции, которые могут влиять на раннее развитие растений и представляют собой кандидатов для последующего функционального^{характера} 2,3,5,7.

Для изучения микроорганизмов, связанных с семенами, функционально информативным и экспериментально управляемым способом, необходимо восстановить жизнеспособные микробные популяции из семянного материала. В этом контексте микробная изоляция обеспечивает доступ к живым микроорганизмам, которые впоследствии могут быть охарактеризованы экспериментально и оценены в дальнейших анализах, релевантных для взаимодействия растений и микробов. Это особенно важно в системах с семенами, где микроорганизмы, связанные с семенами, могут способствовать раннему закреплению растений и представлять себя кандидатами для функционального скрининга и будущего применения.

Восстановление микроорганизмов, связанных с семенами, очень чувствительно к процедурам подготовки образцов, особенно к поверхностной стерилизации, обработке тканей и стадии развития отобранных образцов. Эта чувствительность особенно важна в системах семян, поскольку микробная биомасса часто бывает низкой, а небольшие процедурные различия могут сильно влиять как на количество колониообразующих единиц, так и на состав изолятов. Среди этих переменных стерилизация поверхности является одной из самых критических и трудных для оптимизации. Стерилизация необходима для снижения эпифитного загрязнения до микробной изоляции, однако чрезмерное воздействие стерилистов может снизить жизнеспособность или культивируемость эндогенных микроорганизмов, тогда как недостаточная стерилизация может позволить поверхностным таксонам доминировать в последующих^{культурах 8,9,10}. Соответственно, цель стерилизации — не максимизация химического воздействия, а применение самой мягкой обработки, которая эффективно подавляет поверхностное загрязнение при сохранении восстанавливаемых внутренних^{микроорганизмов 5,11}.

Поскольку эффективность стерилизации зависит от вида растений, структуры тканей, свойств оболочки семян и сопутствующего микробного сообщества, протоколы следует выбирать из ранее проверенных методологий и затем аккуратно адаптировать к исследуемой^{системе 8,12,13}. В материалах с низкой биомассой, таких как семена томатов, этот баланс особенно важен: чрезмерная стерилизация может резко снизить восстановление микробов, тогда как недостаточная стерилизация увеличивает вероятность того, что быстрорастущие поверхностные загрязнители будут доминировать над полученными изолятами. По этой причине эффективность стерилизации следует проверять регулярно, а не предполагать. Покрытие последней промывкой обеспечивает практический контроль остаточного внешнего загрязнения, но этот контроль всегда следует интерпретировать вместе с микробным восстановлением из гомогенатов семян или проростков. Протокол, обеспечивающий стерильное промывка, но практически не восстанавливаемый внутренний микробиот, может быть неподходящим, если цель — сравнительная микробная изоляция, а не максимальная^{дезактивация} 6,8,10,14.

Значимые сравнения, таким образом, требуют строгой процедурной стандартизации. В образцах с низкой биомассой несоответствия в промывке, переносе, гомогенизации, разбавлении, покрытии или инкубации могут влиять как на полное восстановление микробов, так и на видимое представление отдельных таксонов. Это особенно важно при сравнении сухого и проросшего материала, где методологические вариации легко могут быть приняты за биологические изменения.

Одним из основных ограничений многих протоколов микробиологии семян является то, что они полностью опираются на сухие, непроросшие семена в качестве исходного материала. Хотя это даёт полезную базу для микробной фракции, присутствующей до активации семян, оно может недооценивать микроорганизмы, находящиеся в состоянии покоя, метаболически неактивные, испытывающие стресс или изначально присутствующие при низкой относительной^{численности 2,15}.

В сухом состоянии семена представляют собой физиологически спокойную среду, в которой как ткани хозяина, так и связанные с ними микроорганизмы могут оставаться относительно неактивными. Следовательно, микробные популяции, полученные непосредственно из сухих семян, могут не полностью отражать те, которые становятся более легко восстанавливаемыми после начала прорастания.

Во время прорастания семена проходят через поглощение воды, метаболическую реактивацию, мобилизацию питательных веществ и реорганизацию тканей, что изменяет местную среду, доступную ассоциированным^{микроорганизмам 11,16}. Эти изменения могут способствовать росту микробов, изменять относительную представленность микробных популяций и способствовать обнаружению или восстановлению таксонов, которые ранее были редкими или плохо востребованы в сухих семенах. Кроме того, появление радикулы создаёт новый растительный компартмент, который может поддерживать пролиферацию и перераспределение микробов, делая переход от семени к саженцам особенно информативным этапом для микробиологического^{анализа 1,17}.

По этой причине параллельная обработка сухих семян и прорастающих сеянцев обеспечивает более информативный экспериментальный проект, чем анализ сухих семян сам по себе. Сухие семена создают базу для культивируемых популяций, присутствующих до активации, тогда как прорастающий материал позволяет сравнительно оценивать таксоны, которые становятся более восстанавливыми на ранних этапах развития. Этот подход особенно полезен, когда цель заключается не только в каталогизации восстанавливаемых микроорганизмов, но и в выявлении таксонов, связанных с переходом от семян к проростку, и приоритизации изолятов для дальнейшей характеристики (см. рисунок 1).

Рисунок 1: Концептуальный и процедурный обзор процесса сравнительной изоляции. (A) Концептуальное представление состояния сухих семян томатов до прорастания. (B) Концептуальное представление условий проросшего семян томатов в период перехода от семени к сеянству. (C) Схематический рабочий процесс протокола, включая стерилизацию поверхности семян, оценку с контролем промывания, прямую обработку сухих семян или контролируемое прорастание, гомогенизацию объединённых биологических репликатов, серийное разбавление и покрытие, количественную оценку на основе CFU, восстановление изолятов, таксономическую идентификацию и сравнительный анализ сухого и прорастающего материала. Ключевые контрольные пункты, выделенные в рабочем процессе, включают эффективность стерилизации, эквивалентные биологические репликаты, а также согласованный анализ покрытия и CFU. Панели A и B были подготовлены в виде концептуальных иллюстраций с помощью искусственного интеллекта только для визуального представления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Поскольку протокол предназначен для сравнения микробного восстановления из сухого и прорастающего материала, необходима строгая методологическая последовательность. Все сравнения должны проводиться с использованием одной партии семян, идентичных условий стерилизации, одинаковых культурных сред и эквивалентных процедур разбавления, покрытия и инкубации. Без такого уровня стандартизации очевидные различия между сухими и проросшими образцами могут отражать техническую вариативность, а не биологически значимое обогащение. Это особенно важно в процессах изоляции, где извлеченная фракция формируется как биологическим образцом, так и селективным эффектом самой экспериментальной^{процедуры 4,15}.

Биологическая репликация также необходима. Таксоны с низкой численностью могут различаться в разных партиях семян, а восстановление микроорганизмами из образцов с низкой биомассой по своей природе является стохастическим даже при тщательно контролируемых условиях. Для надёжного сравнения рекомендуется как минимум пять независимых биологических реплик на каждое состояние. В этом процессе каждая биологическая реплика состоит из объединённого материала из 3–5 сухих семян или 3–5 проросших сеянцев, обработанных как один образец. Кроме того, все манипуляции после стерилизации должны выполняться в асептических условиях для минимизации вторичного загрязнения и сохранения интерпретации получающегося изолятного набора

Длительность прорастания также следует тщательно выбирать. Он должен быть достаточно длинным, чтобы обеспечить появление радикулы и раннее развитие саженцев, но не настолько длительным, чтобы поздний рост растений ввёл дополнительную экологическую сложность, не связанную с непосредственным переходом от семян к саженцу. Для помидора период прорастания до 5 дней в стерильных условиях обеспечивает практическое окно, в течение которого саженец остаётся тесно связанным с семенной средой, в то время как ранняя микробная активация и перераспределение уже могут происходить. Согласованное время между экспериментами крайне важно, поскольку различия в стадии развития могут сами по себе влиять на паттерны восстановления микробов. Такой рабочий процесс наиболее подходит для сравнительного восстановления культивируемой микробиоты из систем с низкой биомассой, когда целью является оценка сдвигов, связанных с прорастанием, в стандартизированных условиях. Он менее подходит для прямой оценки общего разнообразия микробиома семян или для экспериментальных систем, в которых требуются культурно-независимые подходы для охвачения более широкого микробного сообщества.

Цель этого протокола — предоставить воспроизводимую основу для выделения микробиоты, ассоциируемой с семенами томатов, путём интеграции стандартизированной поверхностной стерилизации с контролируемым прорастанием семян. Метод позволяет проводить сравнительный анализ сухих и проросших сеянцев с использованием эквивалентных биологических репликат, каждая из которых состоит из сгруппированного материала из 3–5 сухих семян или 3–5 проросших сеянцев, чтобы оценить зависящие от прорастания сдвиги в восстановлении колониообразующих единиц (CFU) и таксономическом составе. Минимизируя смещённость в стерилизации и способствуя восстановлению микроорганизмов в переходе от семян к проростку, этот подход облегчает выделение микроорганизмов, имеющих потенциальную функциональную значимость в раннем развитии саженцев, и поддерживает дальнейшие исследования ранних взаимодействий растений и микробов.

Протокол

1. Подготовка реагентов, сред и стерильных материалов

1. Приготовьте 70% (v:v) раствор этанола с использованием стерильной дистиллированной воды.
2. Приготовьте рабочий раствор с 20% (v:v) из коммерческого отбеливателя, содержащего 5% доступного гипохлорита натрия, разбавляя 20 мл отбеливателя в 80 мл стерильной дистиллированной воды.
3. Подготовьте стерильную дистиллированную воду для этапов мытья.
4. Подготовьте стерильный NaCl 0,45% для гомогенизации и последовательного разбавления, и используйте этот раствор последовательно на протяжении всего рабочего процесса.
5. Приготовьте среду для агарной культуры Luria Bertani (LB) (на литр: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl и 15 г агара) и заранее залить тарелки в стерильных условиях.
6. Стерилизуйте все инструменты, которые будут соприкасаться с семенами или всходами после стерилизации, включая щипцы, пестики, разбрасыватели, ножницы и трубочные стойки, путём автоклава или валидированной асептической обработки.
7. Перед началом обработки семян разместите стерильные чашки Петри, трубки, наконечники пипеток и культивные тарелки внутри ламинарного вытяжки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку микробная биомасса, связанная с семенами, может быть низкой, важно минимизировать ненужное время обработки и подготовить все материалы до начала стерилизации. Задержки между химическими обработками, промывкой, покрытием или установкой прорастания могут привести к вариативности в восстановлении. Альтернативные стерильные буферы могут использоваться в других экспериментальных системах, но один буфер должен поддерживаться на протяжении каждого сравнительного эксперимента. Дополнительные носители, такие как Reasoner's 2A (R2A) или селективные носители, могут быть включены в расширенные культурные рабочие процессы, но LB агар использовался в качестве стандартной среды для сравнительного протокола, описанного здесь.

2. Отбор и распределение семян

1. Используйте семена из одной партии семян томатов для каждого эксперимента, когда это возможно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном здесь репрезентативном рабочем процессе семена томатов из одной партии семян CV. Money Maker использовались на протяжении каждого эксперимента.
2. Визуально осмотрите семена и избавьтесь от повреждённых, видимо сломанных или деформированных семян.
3. Разделите семена на экспериментальные группы, необходимые для исследования. Минимум выделяйте семена на: изоляцию сухих семян после стерилизации и прорастание, а затем выделение сеянцев.
4. Если необходимо проверять более одного состояния стерилизации, семена распределяйте случайным образом между процедурами стерилизации, чтобы избежать смещения обработки, вызванной размером или состоянием семян.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие сравнения сильнее, если основаны на одной и той же партии семян, обработанной параллельно. Рабочий процесс может быть адаптирован к другим генотипам или сортам томатов, но любое сравнение в эксперименте должно проводиться с использованием одного партии семян, обрабатываемого параллельно.

3. Поверхностная стерилизация семян томатов

1. Переместите 3–5 семян в каждую стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 2 мл внутри ламинарного вытяжки.
2. Добавьте 1 мл этанола 70% (v:v) в каждую трубку, чтобы полностью погрузить семена.
3. Инкубировать трубки в течение 5 минут с аккуратным смешиванием ротатором трубки при 25 об/мин.
4. Полностью удалите этанол с помощью стерильной пипетки.
5. Сразу же добавьте 1 мл рабочего раствора гипохлорита натрия 20% (v:v) в каждую трубку, чтобы полностью погрузить семена.
6. Инкубировать трубки в течение 10 минут с лёгким перемешиванием вращающим трубкой при 25 об/мин.
7. Полностью удалите раствор гипохлорита натрия с помощью стерильной пипетки.
8. Промывайте семена три раза 1 мл стерильной дистиллированной воды за одну промывку.
   1. Для каждого мытья добавьте стерильную воду, аккуратно перемешайте 30 секунд, дайте семенам осесть 30 секунд, если нужно, и полностью удалите раствор перед добавлением свежей стерильной воды.
9. Оставьте финальную воду для промывания из каждой трубки для контроля эффективности стерилизации.
10. Переложите стерилизованные семена в стерильные чашки Петри или стерильные трубки, в зависимости от того, будут ли они сразу обработаны как сухие семена или использоваться для контролируемого прорастания.
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с гипохлоритом натрия с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и выполняйте все действия в соответствии с институциональными стандартами химической безопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность этанола-натрия гипохлорита, используемая здесь, была выбрана в качестве стандартизированного рабочего условия для семян томатов на основе ранее проверенных методов стерилизации. Используйте одинаковые условия стерилизации для всех образцов, включённых в сравнительный эксперимент. Если оценивается более одного режима стерилизации, обрабатывайте каждое лечение параллельно и оценивайте эффективность стерилизации независимо для каждого состояния. Минимизировать время между финальной промывкой и последующей обработкой, чтобы уменьшить вариабельность в восстановлении микроорганизмов.

4. Проверка эффективности стерилизации

1. Подготовьте 10-кратное последовательное разбавление окончательной промывки в стерильном удержании 0,45% NaCl, переливая 100 мкл промывки в 900 мкл разбавления и повторяя тот же шаг последовательно до ^10-4 мг. Пластина по 100 мкл каждого разбавления на LB агар с использованием того же метода, что и для гомогенов сухих и прорастающих саженцев.
2. Инкубировать пластины при 28 °C в течение 24–48 часов.
3. Осмотрите пластины на предмет роста колонии после инкубации.
4. Фиксируйте наличие или отсутствие колоний для каждого разбавления. Если колонии присутствуют, запишите уровень разбавления, приблизительное количество колоний и видимую морфологию колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одинаковый объём и формат покрытия на протяжении всего эксперимента для прямого сравнения контроля промывания и биологических образцов. Если в неразбавленных или минимально разбавленных пластинах с контролем промывания не обнаружено колоний, зафиксируйте образец как не имеющий заметного роста при используемых условиях культуры.

5. Обработка сухих (непроросших) семян

1. Переместить объединённые наборы из 3–5 стерилизованных сухих семян, соответствующих одной биологической реплики, в стерильные микроцентрифугные трубки объемом 2 мл с 1 мл стерильного содержимого 0,45% NaCl.
2. Гомогенизуйте семена с помощью стерильного одноразового пестика, пока ткани семян не будут заметно повреждены и не останутся целостные структуры семян.
3. Вихрь гомогенации в течение 30 секунд, чтобы равномерно суспензировать микробные клетки.
4. Подготовьте 10-кратное серийное разбавление гомогената в стерильном 0,45% NaCl, передав 100 мкл гомогената в 900 мкл разбавления для первого разбавления и повторяя то же соотношение последовательно до ^10-6.
5. Пластина 100 мкл выбранных разбавлений на LB агар с помощью разметки.
6. Инкубировать тарелки при 28 °C в течение 24–72 часа.
7. Выберите пластины, соответствующие диапазону разбавления, которые дают изолированные и счётные колонии для оценки CFU и восстановления изолированного участка.
8. Зафиксируйте общее количество колоний, видимые морфотипы колоний и любые различия в паттернах роста среди репликатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите обработку сухих семян параллельно с образцами прорастающих сеянцев, используя одну и ту же среду, схему разбавления, объём покрывания и условия инкубации. LB агар использовался как стандартная среда для сравнительного рабочего процесса, описанного здесь. Дополнительные носители могут быть включены в расширенные процессы изоляции, когда требуется более широкое восстановление медленнорастущих таксонов.

6. Аксиновое прорастание стерилизованных семян

1. Поместите стерилизованные семена на стерильную поддержку для прорастания, такие как агаровые пластины Murashige и Skoog (MS).
2. Равномерно размещайте семена, чтобы избежать контакта между появляющимися всходами.
3. Герметизируйте пластины лабораторной герметизационной пленкой или аналогичным материалом, который снижает внешние загрязнения и позволяет нормально прорастать.
4. Инкубировать пластины горизонтально при температуре 25 °C в темноте.
5. Дайте семенам прорасти в стерильных условиях до раннего установления корнича; В репрезентативном эксперименте это соответствовало 5 дням инкубации.
6. Регулярно проверяйте пластины на наличие признаков загрязнения, аномального прорастания или чрезмерной конденсации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия прорастания должны оставаться постоянными среди репликат. Вариации длительности прорастания или стадии всхода могут влиять на восстановление микроорганизмов независимо от изучаемого эффекта. В адаптированных рабочих процессах могут использоваться другие средства для прорастания стерильных прорастаний, включая пластины Phytoagar или стерильную влажную фильтрующую бумагу, при условии, что поддержка остаётся постоянной в каждом эксперименте. Для инкубации могут использоваться альтернативные ориентации пластин, в зависимости от контейнера для прорастания, но ориентация должна оставаться постоянной внутри эксперимента. (Точка паузы) Проросшие саженцы могут недолго удерживаться при 4 °C перед обработкой, если это необходимо, но при необходимости предпочтительнее немедленное обрабатывание.

7. Выделение микроорганизмов из проросших сеянцев

1. Собирайте проросшие рассады с помощью стерильных щипцов внутри ламинарного капюшона.
2. Переместить собранный материал из 3–5 проросших сеянцев, соответствующих одной биологической реплике, в стерильные трубки микроцентрифуг объемом 2 мл.
3. Добавьте 1 мл стерильного раствора 0,45% NaCl в каждую трубку.
4. Тщательно гомогенизуйте собранный материал саженцев с помощью стерильного одноразового пестика, обеспечивая включение как выходящего корня, так и соответствующей с ним остаточной ткани семени, пока ткани не будут заметно повреждены.
5. Вихрь в течение 30 секунд, чтобы равномерно высвобождать и повторно суспензировать микробные клетки.
6. Подготовьте 10-кратное последовательное разбавление гомогената в стерильном 0,45% NaCl, передав 100 мкл гомогената в 900 мкл разбавления для первого разбавления и повторяя то же соотношение последовательно до ^10-4.
7. Пластина 100 мкл выбранных разбавлений на LB-агар с помощью сектора, капляя пластины.
8. Инкубировать тарелки при 28 °C в течение 24–72 часа. Записывайте общее количество колоний, видимые морфотипы колоний и различия относительно образцов сухих семян.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите одну биологическую реплику как объединённый материал из 3–5 проросших сеянцев и обработайте все реплицированные растения параллельно, используя одну и ту же схему разбавления, объём посыватки, среду культуры и условия инкубации. Включайте как остаточную ткань семян, так и выходящий корень в гомогенат, чтобы сохранить консистенцию между проросшими образцами прорастающих сеянцев.

8. Подсчёт колоний и восстановление изолятов

1. После инкубации выберите плиты разбавления, которые дают счётные и хорошо разделённые колонии. Используйте пластины с 30–300 колониями для оценки CFU.
2. Посчитайте колонии на выбранных пластинах и вычислите CFU на биологическую реплику по следующей формуле:
   CFU на реплику = (количество колоний × коэффициент разбавления)/объём покрытия (миллилитр)
   1. Если используется более одной пластины одного разбавления, вычислите среднее количество колоний для этого разбавления перед применением формулы.
3. Фиксируйте морфологию колонии с помощью стандартизированных дескрипторов, включая размер, форму, цвет, ребра, высоту и непрозрачность.
4. Выбирайте колонии для нижней изоляции, чтобы минимизировать смещение выборки. Выбирайте все различимые морфотипы при низком количестве колоний или случайным образом выбирайте несколько колоний на пластинах, когда численность колоний высока.
5. Пересадите выбранные колонии на свежие пластины ЛБ агар, чтобы получить чистые культуры.
6. Повторяйте повторное расследование, пока каждый изолят не покажет равномерную морфологию колонии на пластине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четко сообщайте, экспрессируются ли значения CFU за биологическую репликацию, на единицу биомассы или с использованием другого подхода нормализации. Если применяются дополнительные подходы к нормализации, включая нормализацию на основе биомассы, опишите метод расчёта прямо в разделе анализа данных.

9. Сохранение очищенных изолятов

1. Инокулируйте чистые колонии в жидкую культурную среду LB и инкубировать до достижения видимого роста.
2. Смешивайте культуру (1:1, v:v) со стерильным содержанием 80% глицерила согласно стандартной микробиологической практике.
3. Храните криосток при -80 °C.
4. Ведите цифровую запись для каждого изолята, включая происхождение образца, номер репликации, состояние (сухие семена или проросшие сеянцы), стерилизацию, дату выделения, пластинчатую среду, морфологию колонии и статус идентификации в следующем сегменте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точные метаданные об изоляте необходимы, если паттерны обогащения должны быть связаны со стадией семени, обработкой или биологической репликацией.

10. Молекулярная идентификация изолятов

1. Извлекать геномную ДНК из очищенных бактериальных культур с помощью набора для экстракции бактериальной ДНК согласно инструкциям производителя.
2. Амплифицировать бактериальный ген рРНК 16S, используя либо гипервариабельную область V5-V8, либо почти полноразмерный ген 16S рРНК.
   1. Для усиления области V5–V8 (~700 bp) используйте праймеры 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) и 1392R (5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′).
   2. Для амплификации почти полноразмерного гена 16S рРНК (~1500 bp) используйте праймеры 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) и 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).
   3. Подготовьте каждую реакцию полимеразной цепной реакции (ПЦР) в конечном объёме 25 мкл, используя мастер-смесь ПЦР, 0,4 мкм каждого праймера и 1 мкл шаблонной ДНК.
   4. Работа в тепловом циклере при следующих условиях: начальная денатурация при 95 °C в течение 2 минут; 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 3 секунд, отжиг при 45 °C в течение 30 с и расширение при 72 °C в течение 2 минут; затем следовало финальное удлинение при 72 °C на 7 минут. Включайте контроль без шаблонов в каждом запуске PCR.
3. Проверьте продукты ПЦР с помощью электрофореза на 1% агарозном геле и визуализируйте ампликоны с помощью гелевого электрофореза и системы визуализации.
4. Очистите продукты ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР согласно инструкциям производителя и отправьте очищенные ампликоны для секвенирования Сэнгера.
5. Проверяйте качество, обрезайте и собирайте полученные последовательности по необходимости.
   1. Сравните каждую последовательность с базой данных нуклеотидов Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с помощью BLASTn (настройки Megablast для очень похожих последовательностей).
   2. Используйте наиболее поддерживаемый хит для назначения таксономии. Присваивать изоляты на уровне рода, когда наилучшее попадание показывает достаточное покрытие выравнивания и не менее 94,5% идентичности последовательности.
   3. Используйте предварительное распределение на уровне вида только тогда, когда лучший результат показывает не менее 98,7% идентичности последовательностей, высокий охват запросов и отсутствие противоречивых совпадений между близкими видами.
   4. Если повторное усиление не удаётся или качество последовательностей недостаточное, запишите изолят как неидентифицированный. Поскольку сходство 16S рРНК само по себе может не определить близкородственные виды бактерий, рассматривайте все присвоения на уровне вида как предварительные и при необходимости подтверждайте их филогенетическим или геномным анализом.
6. Сообщайте о идентичности изолятора при максимальном поддерживаемом таксономическом разрешении. Используйте эти идентификации для проверки морфологического группирования и для приоритизации репрезентативных изолятов для геномных и функциональных анализов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап молекулярной идентификации предназначен для поддержки классификации изолятов и отбора представительного штамма. Его не следует использовать для выводов о структуре сообществ или количественных моделей численности в разных методах лечения.

11. Анализ данных

1. Проведите эксперимент с минимум пятью биологическими репликами на каждое условие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом процессе каждая биологическая реплика состоит из объединённого материала из 3–5 сухих семян или 3–5 проросших сеянцев, обработанных в виде одного образца.
2. Для каждого состояния измерят: (i) общее восстановление КФУ, (ii) количество видимых морфотипов колоний, (iii) количество очищенных изолятов и (iv) таксономический состав восстановленной культивируемой микробиоты на уровне рода и, при необходимости, на уровне вида.
3. Сравните образцы сухих семян и прорастающих сеянцев, чтобы оценить зависимые от прорастания изменения общего восстановления и таксономического состава.
4. Вычислите относительное представление каждого таксона как процент от общего числа восстановленных КФУ по каждому условию. Рассчитывайте изменения складок с использованием абсолютных значений CFU.
5. Анализировать количественные данные с помощью соответствующего программного обеспечения для статистического анализа (например, GraphPad Prism [v11.0.2]). Отчёт данных как среднее ± стандартное отклонение (SD).
   1. Для парного сравнения образцов сухих и прорастающих сеянцев используйте двухсторонний t-тест Стьюдента, когда данные соответствуют предположениям нормальности.
   2. Если эти предположения не выполняются, используйте тест Манна–Уитни U. Рассмотрим статистически значимые различия при p < 0,05.
6. Четко сообщайте, соответствует ли каждое показанное значение абсолютным CFU, относительным процентам, полученным из CFU, или изменениям fold, рассчитанным на основе абсолютных значений CFU.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одни и те же критерии расчёта на протяжении всего исследования для прямого сравнения образцов сухих семян и проросших сеянцев. При представлении таксономического состава чётко указывайте, отображаются ли значения на уровне рода или на уровне вида.

12. Критические точки контроля качества и устранение неполадок

1. Стерильное окончательное промывка само по себе не доказывает, что выбранный режим стерилизации оптимальн для экспериментальной цели. Ограничить внешнее загрязнение, сохраняя при этом восстановление культивируемых микроорганизмов из внутренней или плотно связанной с семенами фракции. Интерпретировать результаты контроля промывания вместе с микробным восстановлением из гомогенатов сухих и прорастающих саженцев.
2. Низкое восстановление как из сухих, так и из прорастающих образцов может указывать на чрезмерную стерилизацию, чрезмерно жёсткую гомогенизацию, неправильные условия культуры или задержку обработки образцов. В таких случаях убедитесь, что сроки стерилизации применялись последовательно, убедитесь, что нарушение тканей было достаточным, но не чрезмерным, а также убедитесь, что разбавление, покрытие и инкубация были проведены немедленно и при одинаковых условиях на всех образцах.
3. Высокое загрязнение при контроле полосканий или быстрый чрезмерный рост небольшим числом колоний может указывать на недостаточную стерилизацию или загрязнение, введённое в процессе обработки после стерилизации. В таких случаях изучите время стерилизации, этапы промывки, асептическую обработку и организацию материалов внутри ламинарного вытяжки перед повторением эксперимента.
4. Биологически интерпретировать различия между сухими и проросшими образцами только тогда, когда стадия прорастания, биологическая репликационная структура, среда культуры, схема разбавления, объём покрытия и условия инкубации были стандартизированы по всему эксперименту.
5. При работе с материалом семян с низкой биомассой очевидное отсутствие определённых таксонов в одном из условий также может отражать недовыборку, а не истинное отсутствие. По этой причине выполняйте последовательную обработку реплицирования и идентификацию на уровне изолятов, чтобы надёжно интерпретировать сдвиги, связанные с прорастанием.

13. Сохранение образцов для других подходов

1. После проверки эффективности стерилизации и перед покрытием дополнительно 200 мкл аликвота каждого гомогената сухих семян или проросшего саженца в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
2. Маркируйте каждую пробирку типом образца, номером биологической реплики, условием обработки и датой сбора.
3. Немедленно заморозьте аликвоты и храните их при -80 °C до использования в дальнейшем анализе.
4. Используйте хранящийся гомогенный материал для комплементарных подходов, таких как анализы на основе ДНК, микроскопические анализы или подтверждающие эксперименты, требующие одинаковой биологической репликации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните аликвоты до последовательного разведения и нанесения пластины, чтобы сохранить исходный состав гомогена. Избегайте повторяющихся циклов заморазания–оттаивания, подготовив отдельные аликвоты при планировании нескольких дальнейших анализов.

Результаты

Эффективность поверхностной стерилизации и контроля внешнего загрязнения
Стерилизация поверхности с использованием стандартизированных условий, основанных на ранее проверенных методологиях, привела к эффективному снижению внешнего микробного загрязнения при сохранении восстановления культивируемых микроорганизмов из материала, полученного из семян. Покрытие последней промывкой не показало заметного роста колоний, что свидетельствует об эффективном удалении микрооргани...

Обсуждение

Представленные здесь результаты показывают, что интеграция стандартизированной поверхностной стерилизации с контролируемым прорастанием семян обеспечивает надёжную основу для культурной изоляции микробиоты, ассоциированных с семенами. Ключевым результатом этого протокола является способность балансировать между эффективным удалением внешних загрязнителей и сохранением эндогенных микробных популяций. Этот баланс критически важен в культурных исследованиях, где чрезмерно строгая стерилизац...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агар	Sigma-Aldrich	01916-500G	Компонент среды LB агар; 15 г/л.
Автоклав	Lab1st	SV120H	Используется для стерилизации инструментов/материалов или для валидации асептической обработки.
Комплект для извлечения ДНК бактерий	Promocell	PK-MB708-206-100	Извлечение ДНК
Набор для подсчета/регистрации колоний	OCS	B079Y5W57N	Необходим для регистрации КФЕ, морфотипов и различий на пластинах; в рукописи не указан счетчик/модель.
Криохранилища	Sigma-Aldrich	Z359033	Подразумевается для хранения глицериновых запасов при -80 °C; не указано прямо, но необходимо для шага сохранения.
Цифровая система регистрации изолятов	Не указано в рукописи	Не применимо	Используется для регистрации метаданных изолята: происхождение, реплика, условия, стерилизующая обработка, дата изоляции, среда пластины, морфология, статус идентификации.
Этанол	VWR	83813440	Используется для приготовления 70% об/об раствора этанола для стерилизации поверхности семян.
Фильтровальная бумага	Fisher Scientific	11718772	Опциональная альтернативная поддержка прорастания.
Пинцет/Щипцы	Sigma-Aldrich	930229	Используется для переноса семян и сбора проросших саженцев.
Комплект для извлечения геномной ДНК	PromoCell	PK-MB708-206-100	Используется для извлечения геномной ДНК из очищенных бактериальных культур; точный комплект/метод не указан.
Глицерин, стерильный 80%	VWR	24388364	Смешивается 1:1 об/об с жидкой культурой для приготовления криохранилища.
Шафа ламинарного потока Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Необходим для асептической обработки семян, стерилизующих переносов и приготовления стерильных материалов.
Среда LB агар	VWR	846495000	Стандартная среда, используемая для сравнительного культивирования; на литр: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 15 г агара.
Микроцентрифужные пробирки	Ratiolab	RATI5615000	Используется для стерилизации семян и обработки образцов.
Среда MS	Sigma	M0404-10L	Упоминается как стерильная поддержка прорастания для аксенного прорастания.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	PCR-микс для амплификации
Парафильм	Parafilm/Merck	HS234526A	Используется для пломбирования пластин для прорастания с уменьшением загрязнения.
Петришки	Labbox	PDIP-E9N-500	Используются для настройки прорастания, посева и обработки стерилизованных семян.
Фитоагар	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Упоминается как опциональная альтернативная стерильная поддержка прорастания.
Набор пипеток и наконечников	Merck	EP3123000918-1EA	Используется для удаления стерилизующих растворов, промывки, разбавления и посева.
Среда R2A агар	HI-MEDIA	M1743-500G	Опциональная дополнительная среда для расширенных культуромических рабочих процессов.
Хлорид натрия, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Используется для приготовления стерильного 0,45% NaCl для гомогенизации и серийных разбавлений; также является частью среды LB.
Гипохлорит натрия	Carlo Erba	370323	Используется для приготовления 20% об/об раствора гипохлорита натрия для стерилизации поверхности семян. Ядовит; требует ИЛП.
Стерильные одноразовые пестики	Eppendorf	EP0030120973	Используется для гомогенизации сухих семян и проросших саженцев.
Вихревой миксер	Fisher Scientific	15901137	Используется для взвешивания микробных клеток из гомогенатов.