В данном исследовании оценивается экспрессия miR-21-5p, ее связь с молекулой клеточной адгезии 1, а также ее взаимосвязь с миграцией, пролиферацией, экспрессией маркеров воспаления и выживаемостью в тканях и клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого.
Исследовательская статья
Ось miR-21-5p — молекула адгезии клеток 1 в прогрессировании и прогнозе немелкоклеточного рака легкого
28 просмотров
⸱
11 сентября 2026 г.
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Данные свидетельствуют о том, что miR-21-5p является важным молекулярным регулятором при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). Молекула клеточной адгезии 1 (CADM1) является потенциальным опухолевым супрессором, однако регуляторная связь между miR-21-5p и CADM1 в прогрессировании НМРЛ остается неясной. Для определения экспрессии miR-21-5p и CADM1 в тканях и клетках НМРЛ использовали количественную ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR); связывание miR-21-5p с мишенью CADM1 подтверждали с помощью двухлюциферазного репортерного анализа; способность клеток к миграции оценивали с помощью анализа Transwell; для изучения клинической значимости miR-21-5p объединили клинико-патологические данные и анализ выживаемости; функциональное обогащение генов-мишеней miR-21-5p анализировали методами биоинформатики. Экспрессия miR-21-5p в тканях НМРЛ была значительно выше, чем в прилежащих нормальных тканях, а у пациентов с высокой экспрессией miR-21-5p наблюдалась более короткая общая выживаемость. Высокая экспрессия miR-21-5p является независимым фактором риска для выживаемости пациентов с НМРЛ; гиперэкспрессия miR-21-5p стимулировала миграцию клеток НМРЛ и повышала экспрессию воспалительных факторов; двухлюциферазный репортерный анализ подтвердил, что miR-21-5p напрямую нацелена на CADM1; гиперэкспрессия CADM1 подавляла миграцию клеток НМРЛ и снижала экспрессию воспалительных факторов; биоинформационный анализ показал, что гены-мишени miR-21-5p обогащены в нескольких сигнальных путях, связанных с возникновением и развитием опухоли. miR-21-5p способствует прогрессированию НМРЛ, воздействуя на CADM1 и подавляя его, и может служить прогностическим биомаркером и терапевтической мишенью.
Введение
Рак легкого входит в число ведущих причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире, при этом его заболеваемость неуклонно растет1,2. В популяциях Восточной Азии показатели заболеваемости и смертности от рака легкого составляют 222,1 и 155,5 на 100 000 мужчин против 158,1 и 87,3 на 100 000 женщин соответственно. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет ~80% всех злокачественных новообразований легких и включает три основных гистологических подтипа3. По сравнению с крайне агрессивным мелкоклеточным раком легкого (МРЛ), НМРЛ прогрессирует и метастазирует медленнее; однако из-за неспецифических ранних клинических симптомов более чем у 75% пациентов диагноз ставится на промежуточных или поздних стадиях, что способствует сохранению низких показателей 5-летней общей выживаемости4. Туморогенез в легких обусловлен онкогенной активацией и сайленсингом генов-супрессоров опухолей5, что подчеркивает острую необходимость в изучении молекулярных механизмов НМРЛ для разработки новых методов терапии6.
МикроРНК (miRNAs, длиной 18–25 нуклеотидов) опосредуют посттранскрипционную репрессию генов путем связывания с 3′-нетранслируемой областью (3′-UTR) целевых мРНК, что вызывает подавление трансляции или деградацию мРНК7. Биогенез микроРНК начинается с транскрипции с помощью РНК-полимеразы II с образованием первичных транскриптов микроРНК, которые затем расщепляются ферментами РНКазы III с образованием предшественников микроРНК в форме шпильки (pre-miRNAs)8. В то время как большинство микроРНК подавляют экспрессию генов за счет частичной или полной комплементарности последовательности с 3′-UTR мРНК, некоторые микроРНК могут стимулировать трансляцию мРНК при определенных условиях клеточного цикла9. На сегодняшний день идентифицированы сотни микроРНК человека, которые регулируют основные биологические процессы, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток10. Ранее обнаружение аберрантно экспрессируемых микроРНК оставалось технически сложной задачей; появление высокопроизводительного секвенирования позволило проводить быстрый и непредвзятый профильный анализ дисрегулируемых микроРНК в тканях при различных заболеваниях11. Здесь мы сосредоточимся на miR-21-5p, одной из первых охарактеризованных микроРНК, транскрибируемых РНК-полимеразой II, чьи онкогенные регуляторные функции в настоящее время подвергаются интенсивному изучению12.
miR-21-5p кодируется внутри интрона гена TMEM49 и последовательно гиперэкспрессируется при множестве злокачественных новообразований человека, включая рак пищевода, колоректальный рак и рак легкого13. Существующие доклинические данные по НМРЛ подтверждают его онкогенную активность: повышенный уровень miR-21-5p ускоряет пролиферацию опухоли, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и отдаленное метастазирование путем сайленсинга антионкогенных мишеней, таких как PTEN и PDCD414. Тем не менее, предыдущие работы в основном сосредоточены на опосредованном miR-21 апоптотическом и пролиферативном сигналинге, и лишь в немногих сообщениях систематически исследуется регуляторная ось miR-21-5p/CADM1 при НМРЛ15. Молекула клеточной адгезии 1 (CADM1) является признанным опухолевым супрессором при эпителиальных раках16; она поддерживает межклеточную адгезию, чтобы предотвратить отделение опухолевых клеток и метастатическое распространение, а ее даунрегуляция коррелирует с поздней стадией опухоли и худшей выживаемостью в когортах пациентов с НМРЛ. С точки зрения механизмов, CADM1 также сдерживает проопухолевый воспалительный сигналинг ядерного фактора каппа B (NF-κB), который способствует метастазированию путем индукции секреции провоспалительных цитокинов и ремоделирования микроокружения опухоли17. Несмотря на отдельные данные об онкогенности miR-21-5p и опухолесупрессивных эффектах CADM1, в отношении оси miR-21-5p/CADM1 при НМРЛ сохраняются три критических пробела в знаниях: во-первых, прямое связывание и репрессия CADM1 со стороны miR-21-5p не имеют экспериментального подтверждения в клетках рака легкого; во-вторых, остается неопределенным, способствует ли эта ось развитию злокачественных фенотипов через нижележащие воспалительные пути; в-третьих, прогностическая способность комбинированных профилей экспрессии miR-21-5p/CADM1 не оценивалась на клинических образцах НМРЛ.
Исходя из этих нерешенных вопросов, мы выдвигаем центральную механистическую гипотезу: повышенная экспрессия miR-21-5p при НМРЛ напрямую связывается с 3′-UTR CADM1 для подавления экспрессии CADM1, тем самым снимая репрессию с подавляемого CADM1 метастатического воспалительного сигналинга, что ускоряет миграцию клеток НМРЛ и приводит к худшему клиническому прогнозу. Данное исследование преследует три заранее определенные цели: (1) подтвердить прямое молекулярное воздействие miR-21-5p на CADM1 и оценить миграцию в клеточных линиях НМРЛ A549 и H1299; (2) выяснить, модулирует ли каскад miR-21-5p/CADM1 метастатический потенциал посредством передачи воспалительных сигналов; (3) оценить клиническую прогностическую значимость профиля экспрессии miR-21-5p/CADM1 для поиска новых диагностических биомаркеров и терапевтических мишеней при метастатическом НМРЛ.
Протокол
Данное ретроспективное исследование было рассмотрено и одобрено Комитетом по этике больницы традиционной китайской медицины города Цючжоу (номер одобрения 202402208). До начала сбора образцов от каждого включенного в исследование пациента или его законного представителя было получено письменное информированное согласие.
Сбор образцов
Ткани первичных опухолей НМРЛ были получены хирургическим путем от включенных в исследование пациентов, в то время как соответствующие им прилегающие нормальные ткани легкого были ретроспективно собраны в Национальном инженерном исследовательском центре клинической биопсии (город Цючжоу, провинция Чжэцзян, Китай). В данное когортное исследование были включены образцы 157 пациентов с НМРЛ, последовательно набранных в период с января 2019 по декабрь 2024 года. Размер выборки из 157 парных образцов был статистически обоснован на основе ранее опубликованных исследований прогностической значимости miRNA при НМРЛ: при условии умеренного размера эффекта 0,5, α = 0,05 и статистической мощности 80% минимально необходимый размер выборки был рассчитан как 122 случая. Учитывая возможную потерю образцов, выраженный некроз тканей и потерю пациентов для последующего наблюдения, мы последовательно включили 157 подходящих пациентов с января 2019 по декабрь 2024 года, чтобы гарантировать достаточную статистическую мощность. Все ткани опухолей и соответствующих прилегающих нормальных тканей легкого были извлечены у одного и того же пациента во время хирургической резекции, что позволило сформировать парные образцы для последующего сравнительного анализа.
Критерии включения были следующими: (1) пациенты с патологически подтвержденным первичным НМРЛ по данным послеоперационной биопсии; (2) наличие полных исходных клинических данных, стадирования по гистопатологическим показателям и данных о выживаемости при долгосрочном наблюдении; (3) отсутствие лучевой, химической или таргетной терапии до момента забора тканей; (4) наличие полного набора парных образцов опухолевой и паранеопластической тканей.
Критерии исключения были следующими: (1) сочетанные вторичные злокачественные опухоли других органов; (2) пациенты, связь с которыми была утрачена в течение 3 месяцев после операции; (3) образцы с выраженным некрозом или недостаточным объемом ткани для последующего молекулярного анализа.
Все образцы свежей ткани помещали в жидкий азот в течение 15 min после хирургического иссечения, затем переносили в морозильник сверхнизких температур и хранили при −80 °C для последующей экстракции RNA и белков. Клиническое наблюдение проводилось регулярно; общая выживаемость измерялась в месяцах с момента постановки патологоанатомического диагноза до смерти или даты последнего контрольного осмотра.
Стратификация уровня экспрессии miR-21-5p
Значения относительной экспрессии miR-21-5p всех 157 пациентов были отсортированы в порядке возрастания, и когорта была стратифицирована по медианному порогу экспрессии. В связи с наличием множества совпадающих значений в районе медианы, пациенты с экспрессией ниже медианы были отнесены к группе с низкой экспрессией (n = 61); пациенты с экспрессией, равной или превышающей медиану, включая все совпадающие значения на уровне медианы, были классифицированы в группу с высокой экспрессией (n = 96). Данное правило распределения совпадающих значений было определено до проведения группировки для разрешения дублирования показателей медианы, а результат группировки был перепроверен по исходным количественным данным qRT-PCR.
Культивирование клеток
Линии клеток НМРЛК человека A549 и H1299 были получены от коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов). Клетки A549 поддерживали в среде RPMI-1640, а клетки H1299 культивировали в среде DMEM. Обе среды для культивирования дополняли 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллином (100 U/mL) и стрептомицином (100 µg/mL). Клетки культивировали в стандартных условиях при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂.
Для подтверждения подлинности клеточных линий A549 и H1299 перед всеми функциональными экспериментами было проведено профилирование коротких тандемных повторов (STR). Тестирование на контаминацию микоплазмами проводилось ежемесячно с использованием коммерческого набора для детекции микоплазм на основе ПЦР; для последующих анализов использовались только клетки, отрицательные по микоплазмам.
Клетки в логарифмической фазе роста с сохранной морфологией собирали для транзиентной трансфекции. Липидный реагент для трансфекции (см. Таблицу материалов) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Последующие клеточные анализы проводили через 50 h после трансфекции.
Трансфекция клеток
Для трансфекции клетки в логарифмической фазе роста с сохраненной морфологией высевали в культуральные планшеты за 24 ч до начала процедуры для достижения 60%–70% конфлюэнтности. Трансфекцию проводили с использованием липидного реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Использовали четыре экспериментальные группы: отрицательный контроль мимика (mimic-NC), мимик miR-21-5p, отрицательный контроль ингибитора (inhibitor-NC) и ингибитор miR-21-5p. Нуклеотидные последовательности приведены в Дополнительном файле 1.
Общую РНК экстрагировали через 50 ч после трансфекции, после чего проводили количественную обратную транскрипцию с ПЦР (qRT-PCR) для измерения относительной экспрессии miR-21-5p и проверки эффективности трансфекции. Анализы клеточной миграции выполняли через 50 ч после трансфекции. Для транзиентной трансфекции клетки обрабатывали мимиком miR-21-5p или отрицательным контролем мимика (mimic-NC) в конечной концентрации 50 nM, в то время как ингибитор miR-21-5p и отрицательный контроль ингибитора (inhibitor-NC) вводили в концентрации 100 nM. Чтобы избежать искажающих эффектов, вызванных различиями в количестве вводимых нуклеиновых кислот, общее количество трансфецированных нуклеиновых кислот поддерживали одинаковым для всех четырех групп обработки.
Пролиферацию клеток оценивали с помощью анализа с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Стабильно трансфицированные клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 3 × 103 клеток/лунку, при этом для каждой группы создавали шесть технических повторностей. Через 24, 48 и 72 ч после посева в каждую лунку добавляли 10 µL реагента CCK-8, после чего инкубировали при 37 °C в течение 2 ч. Пролиферацию клеток количественно определяли путем измерения оптической плотности при 450 nm с помощью микропланшетного ридера.
Все эксперименты по транзиторной трансфекции, CCK-8 и миграции проводились не менее чем в трех независимых биологических повторностях, при этом каждая биологическая повторность включала 3–6 технических повторностей, как описано выше.
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией
Общую РНК из клеток НМРЛ, а также из парных образцов клинических опухолей и прилегающих нормальных тканей выделяли с помощью реагента для экстракции РНК на основе фенола/гуанидина (см. Таблицу материалов). Чистоту и концентрацию РНК определяли методом ультрафиолетовой спектрофотометрии; обратной транскрипции подвергали только те образцы, у которых соотношение оптической плотности (OD) 260/280 и OD 260/230 составляло 1,8–2,1. Последовательности праймеров приведены в Дополнительном файле 1. Система для обратной транскрипции содержала 500 ng общей РНК, 2 µL буфера для обратной транскрипции, 1 µL смеси dNTP, 0,5 µL обратной транскриптазы, 1 µL специфического стем-петлевого праймера для miRNA или олиго(dT)-праймера для mRNA и воду, свободную от РНказ, до общего объема 20 µL. Система для амплификации qRT-PCR (общий объем 20 µL) состояла из 10 µL мастер-микса SYBR Green qPCR, 0,4 µL прямого праймера (10 µM), 0,4 µL обратного праймера (10 µM), 2 µL разведенной матрицы кДНК и 7,2 µL воды, свободной от РНказ.
Матричную РНК для CADM1 и GAPDH подвергали обратной транскрипции с использованием набора для обратной транскрипции, в то время как для miR-21-5p обратная транскрипция проводилась с использованием стем-петлевых праймеров и экзогенного cel-miR-39 в качестве внутреннего контроля (spike-in). Экзогенный контроль cel-miR-39 добавляли в каждый образец РНК сразу после выделения общей РНК и перед обратной транскрипцией. Поскольку cel-miR-39 представляет собой синтетическую микроРНК C. elegans, не имеющую гомологичных последовательностей в транскриптах человека, она позволяет корректировать отклонения, вызванные различной эффективностью экстракции РНК, потерей при деградации РНК и вариациями эффективности обратной транскрипции в разных образцах клинических тканей, служа экзогенным универсальным контролем нормализации для количественного определения микроРНК. qRT-PCR проводили с использованием мастер-микса на основе флуоресцентного ДНК-связывающего красителя на системе ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалов): 95 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов: 95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 20 с, с последующим анализом кривых плавления для подтверждения специфичности амплификации. Для каждого образца было выполнено три биологических повтора, каждый из которых включал три технических повтора; относительный уровень экспрессии рассчитывали методом 2⁻ΔΔCt. Полные последовательности праймеров для амплификации мРНК CRP, TNF-α и IL-6 приведены в Дополнительном файле 1 вместе с последовательностями праймеров для CADM1, GAPDH и miR-21-5p.
Создание линии со стабильной экспрессией miR-21-5p с помощью лентивируса
Коммерческие лентивирусные векторы LV-miR-21-5p и пустой контрольный вектор LV-NC были упакованы в клетках 293T. Последовательность предшественника miR-21-5p была встроена в лентивирусный остов, содержащий ген устойчивости к пуромицину и репортерный ген GFP. Супернатанты лентивирусов собирали через 48 ч и 72 ч после трансфекции, затем концентрировали и очищали для последующего заражения клеток.
Клетки A549 и H1299 высевали за 24 ч до инфицирования для достижения 50–60% конфлюэнтности. Клетки инфицировали при MOI = 10 (A549) и MOI = 15 (H1299) с добавлением 5 µg/mL полибрен для повышения эффективности трансфекции. Среду заменяли через 24 ч после инфицирования, и клетки культивировали еще 48 ч перед отбором с помощью пуромицина.
Отбор стабильных клеток проводили с использованием пуромицина в концентрации 5 µg/mL в течение 10 дней подряд; для подтверждения полного удаления нетрансдуцированных клеток в течение 7 дней использовали неинфицированные контрольные клетки. Одиночные GFP-положительные клоны изолировали и экспандировали для создания стабильных моноклональных клеточных линий LV-21 и LV-NC.
Для проведения анализа восстановления функции CADM1 были подготовлены коммерческие лентивирусы для гиперэкспрессии LV-CADM1 и нокдауна sh-CADM1. Было сформировано четыре экспериментальные группы: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 и группа восстановления LV-miR-21-5p + LV-CADM1. Инфицирование лентивирусами CADM1 проводили при том же MOI и в тех же условиях скрининга пуромицином, что и для векторов miR-21-5p. Все эксперименты по восстановлению пролиферации и миграции были повторены в трех независимых биологических повторностях.
Валидация стабильной гиперэкспрессии miR-21-5p
Из собранных стабильных клеточных клонов LV-21 и LV-NC экстрагировали общую РНК. Для определения относительного уровня экспрессии hsa-miR-21-5p с использованием cel-miR-39 в качестве экзогенного контроля проводили qRT-PCR. Клоны клеток с повышением уровня miR-21-5p более чем в 8 раз по сравнению с группой LV-NC были отобраны для всех последующих функциональных анализов, что подтвердило успешное создание клеточных линий со стабильной гиперэкспрессией miR-21-5p.
Двойной люциферазный репортерный анализ
Были сконструированы репортерная плазмида с 3'-UTR дикого типа CADM1 (WT-CADM1), содержащая предполагаемую последовательность связывания miR-21-5p, и репортерная плазмида с мутантным 3'-UTR CADM1 (MUT-CADM1) с мутацией в области сид-последовательности связывания. Клетки A549 высевали в 24-луночные планшеты за 24 ч до трансфекции для достижения 60%–70% конфлюэнтности. В каждую лунку проводили ко-трансфекцию 500 ng WT/MUT репортерной плазмиды, 50 nM мимика miR-21-5p или NC-мимика и плазмиды внутреннего контроля Renilla люциферазы в фиксированном массовом соотношении. Через 48 ч после трансфекции клетки полностью лизировали, после чего последовательно определяли сигналы люминесценции светлячковой и Renilla люциферазы с помощью набора для двойного люциферазного анализа. Относительную люциферазную активность рассчитывали как отношение значения люминесценции светлячковой люциферазы к значению люминесценции Renilla люциферазы. Каждая экспериментальная группа включала три независимых биологических повтора, по три технических повтора в каждом биологическом повторе; для статистического сравнения относительной люциферазной активности между группами NC-мимика и мимика miR-21-5p использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок.
Анализ миграции в системе Transwell
Для проведения анализа миграции в системе Transwell стабильно трансфецированные клетки суспендировали в безсывороточной среде и высевали в верхние вставки из расчета 4 × 104 клеток на лунку. Нижние камеры заполняли полной культуральной средой с добавлением 10% FBS для создания хемотаксического градиента. После инкубации в течение 48 h при 37 °C в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO₂ клетки, оставшиеся на верхней поверхности мембраны, осторожно удаляли. Клетки, мигрировавшие на нижнюю сторону мембраны, фиксировали метанолом и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Миграцию количественно оценивали путем подсчета клеток в пяти случайно выбранных микроскопических полях для каждой вставки. Каждый эксперимент проводили с использованием трех независимых биологических повторностей, включая по три технических повтора для каждой биологической повторности.
Статистический анализ
Все эксперименты in vitro проводились как минимум в трех независимых биологических повторностях, каждая из которых сопровождалась соответствующими техническими повторами. Сначала распределение данных оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка на нормальность для выбора метода статистического анализа. Для парных сравнений между опухолевой и прилегающей нормальной тканями применяли либо парный t-критерий, либо парный критерий знаковых рангов Уилкоксона, в зависимости от распределения данных. Сравнения между двумя независимыми группами анализировали с помощью независимого t-критерия или U-критерия Манна-Уитни. Различия между несколькими группами, включая эксперименты по восстановлению функции (rescue experiments), оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующей апостериорной коррекцией Бонферрони, в то время как ANOVA с повторными измерениями использовали для анализа лонгитюдных наборов данных, таких как тесты на пролиферацию CCK-8 и заживление ран. Связи между категориальными клиническими переменными исследовали с помощью критерия χ2, а взаимосвязь между экспрессией miR-21-5p и CADM1 оценивали с помощью корреляционного анализа Пирсона. Выживаемость пациентов анализировали с помощью кривых Каплана-Мейера, сравнения проводили с помощью лог-рангового критерия. Независимые прогностические факторы определяли с помощью однофакторного и многофакторного регрессионного анализа пропорциональных рисков Кокса. Статистическая значимость определялась как P < 0.05. Многофакторная регрессия Кокса была скорректирована по возрасту, полу, гистологическому типу, уровню miR-21-5p и состоянию лимфатических узлов (контрольные значения: возраст ≤ 60, женский пол, плоскоклеточный рак, низкий уровень miR-21-5p, отсутствие поражения узлов); допущение о пропорциональности рисков проверяли по остаткам Шенфельда, переменные с однофакторным P < 0.10 включали методом принудительного ввода (enter selection).
Результаты
Корреляция между экспрессией miR-21-5p и клинико-патологическими характеристиками пациентов с НМРЛ
В общей сложности 157 образцов опухолей при НМРЛ были разделены на группы с низкой экспрессией miR-21-5p (n = 61) и высокой экспрессией (n = 96) на основе медианных уровней miR-21-5p. Анализ с использованием критерия хи-квадрат не выявил значимых корреляций экспрессии miR-21-5p с возрастом пациентов (χ2 = 1.36, P = 0.2435), полом (χ2 = 1.06, P = 0.3032), гистологическим типом (χ2 = 1.09, P = 0.2965) или размером опухоли (χ2 = 5.623, P = 0.0601), в то время как высокая экспрессия miR-21-5p была значимо связана с высокой степенью злокачественности опухоли (χ2 = 16.25, P = 0.00006), наличием метастазов в лимфатических узлах (χ2 = 12.17, P = 0.00049) и более высокой стадией T (χ2 = 4.30, P = 0.117), что позволяет предположить, что miR-21-5p оказывает онкогенное воздействие, способствуя прогрессированию НМРЛ (Таблица 1).
Многофакторный регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса для определения независимых прогностических факторов НМРЛ
Многофакторный регрессионный анализ Кокса с учетом возраста, пола, гистологического типа, экспрессии miR-21-5p и метастазов в лимфатических узлах показал, что высокая экспрессия miR-21-5p (отношение рисков [HR] = 3,066; 95% доверительный интервал [CI]: 1,412–6,659; P = 0,005) и наличие метастазов в лимфатических узлах (HR = 22,295; 95% CI: 3,039–163,588; P = 0,002) являются независимыми неблагоприятными прогностическими факторами риска низкой общей выживаемости пациентов с НМРЛ, в то время как возраст, пол и гистологический подтип пациентов не оказали значимого независимого прогностического влияния (все P > 0,05) (Таблица 2).
Характеристики клинической экспрессии miR-21-5p и ее корреляция с CADM1 и воспалительными факторами
Детекция методом qRT-PCR парных образцов опухоли НМРЛ и прилегающих нормальных тканей показала значительно более высокие относительные уровни miR-21-5p в раковых тканях по сравнению с нормальным контролем (Рисунок 1A, P < 0.001). Кривые выживаемости Каплана-Мейера продемонстрировали, что пациенты с высокой экспрессией miR-21-5p имели значительно более низкую общую выживаемость, чем пациенты с низкой экспрессией miR-21-5p (Рисунок 1B, P = 0.0027). Содержание мРНК воспалительных медиаторов — С-реактивного белка (CRP), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6) — было заметно повышено в образцах НМРЛ (Рисунок 1C, P < 0.01, P < 0.001). Корреляционный анализ Пирсона выявил сильно значимую отрицательную корреляцию между экспрессией miR-21-5p и мРНК CADM1 в клинических образцах (r = -0.7773, 95% CI: от -0.8325 до -0.7076, P < 0.0001, Рисунок 1D).
Клеточная функциональная валидация miR-21-5p в клетках НМРЛ
Методом qRT-PCR была подтверждена эффективность трансфекции миметика miR-21-5p в клетках A549 и H1299 (Рисунок 2A). Анализ в системе Transwell показал, что гиперэкспрессия miR-21-5p значительно увеличивает относительную миграционную способность и количество мигрирующих клеток в обеих клеточных линиях (Рисунок 2B,C). Определение уровней воспалительных цитокинов с помощью qRT-PCR выявило заметное повышение уровней мРНК CRP, TNF-α и IL-6 после трансфекции миметиком miR-21-5p, в то время как обработка ингибитором miR-21-5p обратила этот эффект (Рисунок 2D). Эксперименты по реверсии (rescue experiments) подтвердили, что миметик miR-21-5p резко подавляет транскрипцию CADM1, а ко-трансфекция LV-CADM1 полностью восстанавливает экспрессию мРНК CADM1 в клетках A549 и H1299 (Рисунок 2E,F). В совокупности эти клеточные данные продемонстрировали, что miR-21-5p способствует миграции клеток НМРЛ и развитию воспалительного ответа путем репрессии CADM1.
Влияние miR-21-5p на пролиферацию клеток НМРЛ
Кривые пролиферации, полученные с помощью метода CCK-8 через 24 ч, 48 ч и 72 ч, показали, что трансфекция мимиком miR-21-5p заметно увеличивала значения OD при 450 нм в клетках A549 и H1299, в то время как ингибитор miR-21-5p значительно подавлял жизнеспособность клеток; статистически значимые различия наблюдались через 72 ч (Рисунок 3A,B; P < 0.001). Эти данные продемонстрировали, что miR-21-5p оказывает пропролиферативное действие на клетки НМРЛ.
Валидация CADM1 в качестве прямой мишени miR-21-5p с помощью биоинформационного прогнозирования и двухлюциферазного репортерного анализа
Для скрининга потенциальных нижестоящих генов-мишеней miR-21-5p было проведено пересечение данных трех онлайн-баз прогнозирования мишеней мкРНК (miRWalk, StarBase, TargetScan), в результате чего было получено 95 общих генов-мишеней (Рисунок 4A). Анализ обогащения по генной онтологии (GO) показал, что эти гниды-кандидаты преимущественно обогащены в биологических процессах, клеточных компонентах и молекулярных функциях, связанных с метаболизмом клеток, ответом на стресс и регуляцией транскрипции (Рисунок 4B). Анализ обогащения путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) дополнительно выявил выраженное обогащение сигнальных каскадов, связанных с опухолями, включая пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и Ras (Рисунок 4C). Двухлюциферазный репортерный анализ продемонстрировал, что имитатор miR-21-5p значительно подавляет относительную люциферазную активность репортера 3'-UTR дикого типа CADM1, в то время как в группе с мутантным 3'-UTR CADM1 ингибирующего эффекта не наблюдалось (Рисунок 4D, P < 0.01, ns: статистически не значимо), что подтверждает прямое связывание miR-21-5p и CADM1.
Стимуляция злокачественных фенотипов НМРЛ посредством супрессии CADM1 в экспериментах по реверсии (rescue-экспериментах)
Методом qRT-PCR была подтверждена эффективность трансфекции мимика и ингибитора miR-21-5p в клетках A549 и H1299 (Рисунок 5A). Оверэкспрессия CADM1 (LV-CADM1) снижала уровни мРНК провспалительных факторов CRP, TNF-α и IL-6, тогда как нокдаун CADM1 с помощью малых интерферирующих РНК (si-CADM1) заметно повышал их экспрессию (Рисунок 5B). Анализ миграции в системе Transwell показал, что трансфекция LV-CADM1 значительно подавляла миграционную способность обеих линий клеток НМРЛ (Рисунок 5C,D). Определение пролиферации с помощью CCK-8 дополнительно продемонстрировало, что пропролиферативный эффект, опосредованный LV-21, был полностью нивелирован ко-трансфекцией LV-CADM1, в то время как ускорение роста клеток, индуцированное si-CADM1, могло быть подавлено ингибитором miR-21-5p (Рисунок 5E,F). В совокупности эти данные по реверсии подтвердили, что CADM1 действует как функциональный нижележащий медиатор, ответственный за пролиферацию, миграцию и воспалительную активацию в НМРЛ, вызванные miR-21-5p.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Исходные данные, подтверждающие результаты этого исследования, представлены в Дополнительном файле 2 и доступны вместе с опубликованной статьей.
Рисунок 1: Профили экспрессии miR-21-5p, воспалительных факторов и их корреляция с CADM1 в клинических образцах НМРЛ. (A) Относительная экспрессия miR-21-5p в нормальных тканях легкого и опухолевых тканях при НМРЛ. (B) Кривые общей выживаемости Каплана-Мейера для пациентов с НМРЛ, стратифицированных по уровню экспрессии miR-21-5p. (C) Относительная экспрессия мРНК воспалительных факторов CRP, TNF-α и IL-6 в нормальных тканях и тканях при НМРЛ. (D) Диаграмма рассеяния корреляции Пирсона, показывающая отрицательную линейную корреляцию между экспрессией miR-21-5p и мРНК CADM1. **P < 0.01, ***P < 0.001. Для панели C: статистические сравнения проводились между парными опухолевыми тканями и прилегающими нормальными тканями соответственно для CRP, TNF-α и IL-6; **P < 0.01, ***P < 0.001 обозначают значимые различия по сравнению с соответствующими нормальными тканями легкого. Все панели включают ≥3 независимых биологических повторности; данные qRT-PCR представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; для межгруппового сравнения использовался парный t-критерий; для анализа корреляции на диаграмме рассеяния использовался критерий Пирсона. Сокращения: CADM1 = молекула клеточной адгезии 1; CI = доверительный интервал; CRP = С-реактивный белок; IL-6 = интерлейкин-6; NSCLC = немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ); TNF-α = фактор некроза опухоли альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Клеточные фенотипы и экспрессия CADM1, регулируемые miR-21-5p в клетках НМРЛ A549 и H1299. (A) Определение экспрессии miR-21-5p методом qRT-PCR после трансфекции мимиком. (B) Статистический количественный анализ относительной миграции клеток по результатам анализов в системе Transwell. (C) Количественное определение числа мигрировавших клеток на одно микроскопическое поле. (D) Относительная экспрессия мРНК CRP, TNF-α и IL-6 при гиперэкспрессии или ингибировании miR-21-5p. (E) Относительная экспрессия мРНК CADM1 в группах восстановления A549 (NC, мимик miR-21-5p, LV-CADM1, мимик+LV-CADM1). (F) Относительная экспрессия мРНК CADM1 в группах восстановления H1299. **P < 0.01, ***P < 0.001. Все клеточные анализы повторяли в трех независимых биологических повторностях с тремя техническими повторностями для каждой; планки погрешностей представляют среднее значение ± SD; для межгрупповых сравнений использовали однофакторный ANOVA с поправкой Бонферрони; обозначения групп строго соответствуют группам трансфекции, описанным в разделе «Методы». Сокращения: CADM1 = молекула клеточной адгезии 1; CRP = С-реактивный белок; IL-6 = интерлейкин-6; LV = лентивирусный вектор; NC = отрицательный контроль; НМРЛ = немелкоклеточный рак легкого; qRT-PCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; TNF-α = фактор некроза опухоли альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кривые пролиферации CCK-8, отражающие жизнеспособность клеток после гиперэкспрессии или нокдауна miR-21-5p. (A) Зависимые от времени кривые абсорбции OD₄₅₀ клеток A549, трансфицированных mimic-NC, мимиком miR-21-5p, inhibitor-NC или ингибитором miR-21-5p. (B) Зависимые от времени кривые абсорбции OD₄₅₀ клеток H1299 в четырех группах трансфекции. ***P < 0.001. Анализы CCK-8 включали шесть технических повторов для каждой группы в 3 биологических повторах; данные представлены как среднее ± SD; для сравнения временных точек использовался ANOVA с повторными измерениями. Сокращения: CCK-8 = набор для подсчета клеток-8; NC = отрицательный контроль; OD = оптическая плотность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Биоинформационный скрининг и двухлюциферазный анализ ген-мишени CADM1 для miR-21-5p. (A) Диаграмма Венна, иллюстрирующая общие гены-мишени miR-21-5p, определенные с помощью прогностических баз данных miRWalk, StarBase и TargetScan. (B) Пузырьковая диаграмма анализа функционального обогащения GO для пересекающихся генов-мишеней. (C) Столбчатая диаграмма наиболее обогащенных сигнальных путей KEGG. (D) Активность двухлюциферазного репортера для дикого типа и мутантного 3'-UTR CADM1 после гиперэкспрессии miR-21-5p. **P < 0.01; ns, отсутствие статистической значимости. На панели D для двухлюциферазного анализа использовались только ко-трансфекции WT-CADM1 3'-UTR и MUT-CADM1 3'-UTR с имитатором miR-21-5p/mimic-NC; метки «Control/overexpression/interference», указанные в предварительных черновиках графиков, были заменены на стандартную группировку WT/MUT на окончательных рисунках. Анализ предсказания мишеней проводился с использованием трех онлайн-баз данных; значения P при обогащении были скорректированы с помощью поправки Benjamini-Hochberg FDR; двухлюциферазные эксперименты проводились в трех биологических повторах (по три технических повтора в каждом); планки погрешностей представляют среднее значение ± SD; для статистического сравнения использовался двухвыборочный t-критерий. Сокращения: CADM1 = молекула клеточной адгезии 1; GO = генная онтология; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; MUT = мутантный; NC = отрицательный контроль; ns = не значимо; UTR = нетранслируемая область; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Эксперименты по функциональному спасению, подтверждающие регуляторную ось miR-21-5p/CADM1 в клетках A549 и H1299. (A) Относительная экспрессия miR-21-5p после трансфекции мимика или ингибитора. (B) Относительная экспрессия мРНК CRP, TNF-α и IL-6 в группах LV-CADM1 и si-CADM1. (C) Статистическая количественная оценка относительной способности к миграции при сверхэкспрессии CADM1. (D) Количественная оценка числа мигрировавших клеток на одно микроскопическое поле в группах LV-CADM1 . (E) Значения OD₄₅₀ CCK-8 для групп спасения A549 (LV-NC, LV-21, LV-CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+ингибитор miR-21). (F) Значения OD₄₅₀ CCK-8 для групп спасения H1299 с аналогичными вариантами трансфекции. **P < 0.01, ***P < 0.001. Все анализы спасения включали три независимых биологических повтора; планки погрешностей указывают среднее ± SD, однофакторный ANOVA с апостериорным тестом Бонферрони для сравнения нескольких групп. Сокращения: CADM1 = молекула клеточной адгезии 1; CRP = С-реактивный белок; IL-6 = интерлейкин-6; LV = лентивирусный вектор; NC = отрицательный контроль; OD = оптическая плотность; qRT-PCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; si = малая интерферирующая РНК; TNF-α = фактор некроза опухоли-альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| экспрессия miR-21-5p | Общий | Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.2 | Значение p | |||
| Низкий | Высокий | |||||
| Возраст (лет) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1.357 | 0.244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| Общее количество | 61 | 96 | 157 | |||
| Пол | Самец | 42 | 73 | 115 | 1.06 | 0.3032 |
| Женский пол | 19 | 23 | 42 | |||
| Общий итог | 61 | 96 | 157 | |||
| Гистологический тип | Плоскоклеточный рак | 31 | 41 | 72 | 1.09 | 0.2965 |
| Аденокарцинома | 30 | 55 | 85 | |||
| Общий | 61 | 96 | 157 | |||
| Степень злокачественности опухоли | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16.25 | 0.00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| Общее количество | 61 | 96 | 157 | |||
| Метастазирование в лимфатические узлы | Отрицательный | 41 | 37 | 78 | 12.17 | 0.00049 |
| Положительный | 20 | 59 | 79 | |||
| Общий | 61 | 96 | 157 | |||
| Размер опухоли (см) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5.623 | 0.0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| Общее количество | 61 | 96 | 157 | |||
| Стадия T | T1 | 15 | 17 | 32 | 4.295 | 0.117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| Общее количество | 61 | 96 | 157 | |||
Таблица 1: Связь между экспрессией miR-21-5p и клинико-патологическими характеристиками у пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Значения представляют собой количество пациентов. Связи оценивали с помощью теста χ2. Сокращение: NSCLC = немелкоклеточный рак легкого. Каждый тест χ2 проводился для категориальных клинико-патологических переменных; во всех анализах использовались образцы всех 157 пациентов.
| n | P значение | Относительный риск | 95% доверительный интервал | |||
| Нижний | Верхний | |||||
| Возраст (лет) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| Пол | Самец | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| Женский пол | 42 | |||||
| Гистологический тип | Плоскоклеточный рак | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| Аденокарцинома | 85 | |||||
| экспрессия miR-21-5p | Высокий | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| Низкий | 61 | |||||
| Метастазирование в лимфатические узлы | Отрицательный | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| Положительный | 79 | |||||
Таблица 2: Многофакторный анализ пропорциональных рисков Кокса для общей выживаемости пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Значения представляют собой отношения рисков с 95% доверительными интервалами. Сокращения: CI = доверительный интервал; NSCLC = немелкоклеточный рак легкого. Многофакторная регрессия Кокса была проведена на основе полных данных клинической когорты; HR и 95% CI были рассчитаны для независимого прогностического скрининга.
Дополнительный файл 1: Последовательности олигонуклеотидов и праймеров, использованных для трансфекции и количественной ПЦР с обратной транскрипцией. В файле перечислены мимик и ингибитор miR-21-5p, их соответствующие отрицательные контроли, а также праймеры для CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p и cel-miR-39. Все последовательности представлены в направлении 5′–3′. Сокращения: CADM1 = молекула клеточной адгезии 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; hsa = Homo sapiens; miR = микроРНК; PCR = полимеразная цепная реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2. Исходные данные к рисункам. Этот файл содержит базовые наборы данных и результаты статистического анализа, использованные для построения рисунков, представленных в рукописи, включая клинические характеристики, анализы экспрессии, данные по выживаемости и соответствующие статистические результаты. Эти исходные данные подтверждают выводы, изложенные в основном тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
В данном исследовании систематически подтверждено повышенное выражение miR-21-5p в клинических тканях НМРЛ, что коррелировало с усилением транскрипции воспалительных факторов, а также более выраженной способностью клеток к миграции и пролиферации; при этом эксперименты с использованием двойного люциферазного теста, qRT-PCR и опыт спасения (rescue experiments) позволили идентифицировать CADM1 в качестве прямой функциональной мишени miR-21-5p. Биоинформатический прогноз дополнительно показал, что нижестоящие мишени miR-21-5p обогащены в онкогенных каскадах MAPK и Ras, что дает предварительные доказательства того, что ось miR-21-5p/CADM1 может быть задействована в сигнальных путях, связанных с злокачественным прогрессированием опухоли.
Анализ клинической когорты показал, что высокая экспрессия miR-21-5p тесно связана с высокой степенью злокачественности опухоли, метастазированием в лимфатические узлы и более короткой общей выживаемостью. Многофакторный регрессионный анализ Кокса подтвердил, что miR-21-5p является независимым неблагоприятным прогностическим фактором, что позволяет предположить, что miR-21-5p может служить потенциальным биомаркером для оценки риска прогрессирования и исхода выживаемости пациентов с НМРЛ.
In vitro функциональные анализы показали, что гиперэкспрессия miR-21-5p способствует пролиферации, миграции и воспалительному ответу клеток НМРЛ, тогда как повышение экспрессии CADM1 обращает все эти онкогенные фенотипы; отрицательная корреляция экспрессии miR-21-5p и CADM1 в образцах пациентов, наряду с данными по восстановлению клеточного фенотипа, полностью разъяснили регуляторный механизм, согласно которому miR-21-5p стимулирует злокачественное поведение НМРЛ путем прямого ингибирования CADM1.
В соответствии с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось об онкогенной роли miR-21-5p при карциноме легкого, данная работа дополняет имеющиеся данные о клинической корреляции и предоставляет полные результаты валидации путем реверсии (rescue validation) для подтверждения ее опухолестимулирующей функции; в отличие от существующих исследований, сосредоточенных только на одном фенотипе метастазирования, настоящее исследование одновременно связывает miR-21-5p с пролиферацией клеток и воспалительным микроокружением опухоли через мишень CADM1, расширяя регуляторную сеть miR-21-5p при НМРЛ.
Основываясь на вышеизложенных предварительных данных, определение экспрессии miR-21-5p в тканях может иметь вспомогательную ценность для стратификации риска и прогностической оценки НМРЛ, а ось miR-21-5p/CADM1 может стать новым потенциальным набором молекулярных мишеней для разработки стратегий противодействия прогрессированию НМРЛ, хотя ее клиническая терапевтическая эффективность еще требует подтверждения.
Данное исследование имеет несколько ограничений. В нем использовались клеточные анализы in vitro и одна ретроспективная клиническая когорта без валидации на ксенографтах in vivo или на независимой внешней когорте. Дополнительные анализы пролиферации (например, EdU и анализ формирования колоний), анализы инвазии, апоптоза и клеточного цикла не проводились. Также отсутствовали тестирование периферической крови для оценки неинвазивного диагностического потенциала, валидация уровня белка CADM1, полный список перекрывающихся целевых генов и систематический анализ сети белок-белковых взаимодействий (PPI). В будущих работах следует устранить эти ограничения и более детально изучить апстрим-регуляторы miR-21-5p и даунстрим-сигналинг CADM1.
В совокупности данная работа предоставляет предварительные доказательства того, что miR-21-5p действует как онкогенная микроРНК, ускоряя пролиферацию, миграцию и воспаление при НМРЛ путем прямого воздействия на CADM1, а его высокая экспрессия прогнозирует неблагоприятный прогноз выживаемости пациентов.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии каких-либо финансовых или нефинансовых конфликтов интересов.
Благодарности
Нет данных
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10% нейтральный буферизованный формалин | Fisher Scientific (Fisherbrand™) | SF100-4 (типичный) | Фиксатор для тканей; ткани нарезают до &толщина < 5 мм, фиксация при комнатной температуре в течение 14–26 часов |
| 96-луночный планшет для культивирования клеток | Corning | 3526 | Планшет для высева трансфицированных клеток и проведения анализа заживления ран (царапинного теста) |
| Линия клеток A549 | ATCC (или Шанхайский ресурсный центр) | CCL-185 | Линия клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека (аденокарцинома) |
| набор для анализа CCK-8 | Dojindo | CK04 | Определение пролиферации |
| Среда для культивирования клеток (неуказанная) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Различные (напр., RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | Базальная среда для клеточных линий НМРЛ; точный состав зависит от используемой клеточной линии |
| cel-miR-39 (экзогенный контрольный стандарт) | GenePharma (Шанхай, Китай) | Индивидуальный (например, B010302) | Внешний стандарт для нормализации экспрессии микроРНК, добавляемый при выделении РНК |
| CO2 Инкубатор (с увлажнением) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | Предоставляет 37°C, 5% CO22и насыщенная влажность для культивирования клеток |
| СРБ/ФНО-αпары праймеров для ИЛ-6 | Sangon Biotech | синтез на заказ | Полные последовательности в Дополнительном файле 1 |
| Раствор для окрашивания кристаллическим фиолетовым | Solarbio | G1062 | Окрашивание мигрировавших клеток |
| среда DMEM | Gibco | 11965092 | Для культивирования клеток H1299/293T |
| Набор для проведения двухлюциферазного репортерного анализа | Promega | E1910 | Детекция 3'-UTR CADM1 дикого типа и мутантной формы |
| Экзогенная cel-miR-39 | Qiagen | специальный внутренний стандарт (spike-in) | Добавлен этап после изоляции РНК для нормализации |
| Фетальная бычья сыворотка (ФБС) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | Добавка, вносимая в культуральную среду до конечной концентрации 10% для поддержания роста клеток |
| тонкий наконечник для пипетки (например, 10 µL совет) | Axygen (Corning) | T-300 | Используется для ручного соскабливания монослоя клеток с целью создания "рана" пробел |
| GAPDH (эндогенный контроль) | Различные поставщики (например, Sangon Biotech, RiboBio; праймеры по индивидуальному заказу) | Специальный вариант | Референтный ген для нормализации мРНК, используемый в qRT-PCR |
| GO/KEGG (аннотация с помощью clusterProfiler) | Bioconductor | сборка 2026 года | |
| GraphPad Prism | Программное обеспечение GraphPad | v9.5.1 | Построение графиков & статистика in vitro |
| Клеточная линия H1299 | ATCC (или Шанхайский ресурсный центр) | CRL-5803 | Линия клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека, полученная из метастаза в лимфатический узел |
| Термоинактивированная FBS | Gibco | 10099141 | 10% рабочая концентрация |
| линия клеток HEK-293T | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; ежемесячное STR-тестирование, микоплазмы не обнаружены |
| Смесь для упаковки лентивируса | Genecopoeia (или Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | Предоставляет упаковочные плазмиды (gag/pol, rev, vsv-g) для продукции лентивируса |
| Лентивирусный вектор-21 (LV-21) | GeneChem (Шанхай, Китай) или Genecopoeia | Индивидуальный заказ | Лентивирусный вектор, содержащий miR-21-5p, для создания клеточных линий со стабильной экспрессией |
| Лентивирусный контрольный вектор (LV-NC) | GeneChem (Шанхай, Китай) или Genecopoeia | Специальный | Отрицательный контроль: лентивирусный вектор без вставки miR-21-5p |
| Липидный реагент для трансфекции | Thermo Fisher | L3000015 | Для транзиентной трансфекции |
| Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 или L3000008 | Реагент для трансфекции на основе липидов; через 50 часов после трансфекции для последующих экспериментов |
| Метанол | Sinopharm | 67-56-1 | Фиксация клеток |
| Метанол (фиксатор/разбавитель для окрашивания) | Sigma-Aldrich | 34860 | Используется в качестве фиксатора или разбавителя при окрашивании кристаллическим фиолетовым |
| ингибитор miR-21-5p/отрицательный контроль ингибитора | GenePharma | синтез на заказ | Последовательности в Дополнительном файле 1 |
| мимик miR-21-5p/отрицательный контроль мимика (mimic-NC) | GenePharma | синтез на заказ | Последовательности в Дополнительном файле 1 |
| miRDB | Вашингтонский университет | v6.0 | |
| miRWalk | Гейдельбергский университет | v3.0 | |
| Национальный центр биопсийной инженерии | Национальный центр биопсийной инженерии (Китай) | Данные отсутствуют | Институциональный поставщик образцов тканей рака легкого с зарегистрированными клиническими данными и гистопатологическим диагнозом |
| Ткань НМРЛ (для первичного культивирования) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | Индивидуальный заказ | Источник ткани; культивирование в среде с 10% FBS при 37°C; для трансфекции отобраны клетки с хорошей морфологией, находящиеся в логарифмической фазе роста |
| ПЦР-амплификатор | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | Получение продуктов амплификации для ОТ-ПЦР в реальном времени |
| Пенициллин-стрептомицин | Solarbio | P1400 | 100 ЕД/мл пенициллина, 100 μg/mL стрептомицин |
| Дозаторы (одноканальные & Многоканальный) | Eppendorf | Серия Research Plus | Для точного дозирования жидкостей во всех экспериментах |
| Полибрен | Sigma-Aldrich | H9268 | Заключительный 5 μg/mL для lentivirus-инфицирования |
| Пуромицин | InvivoGen | ant-pr-1 | 5 μg/mL для скрининга стабильных клеточных линий |
| Дигидрохлорид пуромицина | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | Селективный антибиотик, используемый в концентрации 5 μg/mL для создания стабильно трансфицированных клеточных линий |
| R | Фонд R | v4.2.1 | Пакеты: clusterProfiler, ggplot2 |
| Набор для обратной транскрипции | Takara | RR047 | РТ со шпилечными праймерами для мкРНК, oligo(dT) для мРНК |
| Эппендорф-пробирки, свободные от РНаз | Axygen (Corning) | MCT-150-C | Пробирки объемом 1,5 мл, не содержащие РНКазы, для хранения и обработки РНК |
| среда RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Для культуры клеток A549 |
| si-CADM1 | GenePharma | синтез на заказ | Последовательности в Дополнительном файле 1 |
| si-NC | GenePharma | синтез на заказ | Последовательности в Дополнительном файле 1 |
| SPSS | IBM | v26.0 | Клинический анализ / регрессионный анализ Кокса |
| Мастер-микс для qPCR с SYBR Green | Roche | 4913914001 | амплификация методом ОТ-ПЦР в реальном времени |
| TargetScan | Массачусетский технологический институт | v8.2 | |
| Реагент для экстракции тотальной РНК | Takara | 9109 | Лизис на основе фенола/гуанидина |
| Камера Transwell | Corning (Costar) | 3422 (на 24 лунки, 8.0 µm) | Для трансфекции клеток в среде при комнатной температуре; добавляли химические праймеры и инкубировали в течение 48 ч |
| Камеры для миграции Transwell | Corning | 3422 | 8 μm размер пор |
| Реагент TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | Экстракция суммарной РНК из образцов тканей; оценка качества РНК по соотношениям OD260/280 и OD260/230 |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | Для отсоединения клеток от культуральных сосудов перед посевом в 24-луночные планшеты |
Ссылки
- Bautista-Sánchez D, et al. The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;20:409-20.
- Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
- The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
- Reyes J, et al. Oncogenic and tumor-suppressive forces converge on a progenitor niche at the benign-to-malignant transition. Cell. 2026;189(10):2875-97.e53.
- Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
- O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402.
- Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):5-20.
- Ohno S, Kuroda M. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs. Methods Mol Biol. 2016;1448:261-70.
- Ell B, Kang Y. MicroRNAs as regulators of bone homeostasis and bone metastasis. Bonekey Rep. 2014;3:549.
- Dedeoğlu BG. High-throughput approaches for microRNA expression analysis. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103.
- Qu K, et al. Circulating miRNA-21-5p as a diagnostic biomarker for pancreatic cancer: evidence from comprehensive miRNA expression profiling analysis and clinical validation. Sci Rep. 2017;7(1):1692.
- Xu H, et al. Engineered exosomes transporting the lncRNA, SVIL-AS1, inhibit the progression of lung cancer via targeting miR-21-5p. Am J Cancer Res. 2024;14(7):3335-47.
- Chawra HS, et al. MicroRNA-21's role in PTEN suppression and PI3K/AKT activation: implications for cancer biology. Pathol Res Pract. 2024;254:155091.
- Huang Y, Feng G. MiR-423-5p aggravates lung adenocarcinoma via targeting CADM1. Thorac Cancer. 2021;12(2):210-7.
- Hartsough EJ, et al. CADM1 is a TWIST1-regulated suppressor of invasion and survival. Cell Death Dis. 2019;10(4):281.
- Li H, Gao J, Zhang S. Functional and clinical characteristics of cell adhesion molecule CADM1 in cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714298.