Ось miR-21-5p — молекула адгезии клеток 1 в прогрессировании и прогнозе немелкоклеточного рака легкого

Краткое содержание

В данном исследовании оценивается экспрессия miR-21-5p, ее связь с молекулой клеточной адгезии 1, а также ее взаимосвязь с миграцией, пролиферацией, экспрессией маркеров воспаления и выживаемостью в тканях и клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого.

Аннотация

Данные свидетельствуют о том, что miR-21-5p является важным молекулярным регулятором при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). Молекула клеточной адгезии 1 (CADM1) является потенциальным опухолевым супрессором, однако регуляторная связь между miR-21-5p и CADM1 в прогрессировании НМРЛ остается неясной. Для определения экспрессии miR-21-5p и CADM1 в тканях и клетках НМРЛ использовали количественную ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR); связывание miR-21-5p с мишенью CADM1 подтверждали с помощью двухлюциферазного репортерного анализа; способность клеток к миграции оценивали с помощью анализа Transwell; для изучения клинической значимости miR-21-5p объединили клинико-патологические данные и анализ выживаемости; функциональное обогащение генов-мишеней miR-21-5p анализировали методами биоинформатики. Экспрессия miR-21-5p в тканях НМРЛ была значительно выше, чем в прилежащих нормальных тканях, а у пациентов с высокой экспрессией miR-21-5p наблюдалась более короткая общая выживаемость. Высокая экспрессия miR-21-5p является независимым фактором риска для выживаемости пациентов с НМРЛ; гиперэкспрессия miR-21-5p стимулировала миграцию клеток НМРЛ и повышала экспрессию воспалительных факторов; двухлюциферазный репортерный анализ подтвердил, что miR-21-5p напрямую нацелена на CADM1; гиперэкспрессия CADM1 подавляла миграцию клеток НМРЛ и снижала экспрессию воспалительных факторов; биоинформационный анализ показал, что гены-мишени miR-21-5p обогащены в нескольких сигнальных путях, связанных с возникновением и развитием опухоли. miR-21-5p способствует прогрессированию НМРЛ, воздействуя на CADM1 и подавляя его, и может служить прогностическим биомаркером и терапевтической мишенью.

Введение

Рак легкого входит в число ведущих причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире, при этом его заболеваемость неуклонно растет^1,2. В популяциях Восточной Азии показатели заболеваемости и смертности от рака легкого составляют 222,1 и 155,5 на 100 000 мужчин против 158,1 и 87,3 на 100 000 женщин соответственно. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет ~80% всех злокачественных новообразований легких и включает три основных гистологических подтипа³. По сравнению с крайне агрессивным мелкоклеточным раком легкого (МРЛ), НМРЛ прогрессирует и метастазирует медленнее; однако из-за неспецифических ранних клинических симптомов более чем у 75% пациентов диагноз ставится на промежуточных или поздних стадиях, что способствует сохранению низких показателей 5-летней общей выживаемости⁴. Туморогенез в легких обусловлен онкогенной активацией и сайленсингом генов-супрессоров опухолей⁵, что подчеркивает острую необходимость в изучении молекулярных механизмов НМРЛ для разработки новых методов терапии⁶.

МикроРНК (miRNAs, длиной 18–25 нуклеотидов) опосредуют посттранскрипционную репрессию генов путем связывания с 3′-нетранслируемой областью (3′-UTR) целевых мРНК, что вызывает подавление трансляции или деградацию мРНК⁷. Биогенез микроРНК начинается с транскрипции с помощью РНК-полимеразы II с образованием первичных транскриптов микроРНК, которые затем расщепляются ферментами РНКазы III с образованием предшественников микроРНК в форме шпильки (pre-miRNAs)⁸. В то время как большинство микроРНК подавляют экспрессию генов за счет частичной или полной комплементарности последовательности с 3′-UTR мРНК, некоторые микроРНК могут стимулировать трансляцию мРНК при определенных условиях клеточного цикла⁹. На сегодняшний день идентифицированы сотни микроРНК человека, которые регулируют основные биологические процессы, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток¹⁰. Ранее обнаружение аберрантно экспрессируемых микроРНК оставалось технически сложной задачей; появление высокопроизводительного секвенирования позволило проводить быстрый и непредвзятый профильный анализ дисрегулируемых микроРНК в тканях при различных заболеваниях¹¹. Здесь мы сосредоточимся на miR-21-5p, одной из первых охарактеризованных микроРНК, транскрибируемых РНК-полимеразой II, чьи онкогенные регуляторные функции в настоящее время подвергаются интенсивному изучению¹².

miR-21-5p кодируется внутри интрона гена TMEM49 и последовательно гиперэкспрессируется при множестве злокачественных новообразований человека, включая рак пищевода, колоректальный рак и рак легкого¹³. Существующие доклинические данные по НМРЛ подтверждают его онкогенную активность: повышенный уровень miR-21-5p ускоряет пролиферацию опухоли, эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и отдаленное метастазирование путем сайленсинга антионкогенных мишеней, таких как PTEN и PDCD4¹⁴. Тем не менее, предыдущие работы в основном сосредоточены на опосредованном miR-21 апоптотическом и пролиферативном сигналинге, и лишь в немногих сообщениях систематически исследуется регуляторная ось miR-21-5p/CADM1 при НМРЛ¹⁵. Молекула клеточной адгезии 1 (CADM1) является признанным опухолевым супрессором при эпителиальных раках¹⁶; она поддерживает межклеточную адгезию, чтобы предотвратить отделение опухолевых клеток и метастатическое распространение, а ее даунрегуляция коррелирует с поздней стадией опухоли и худшей выживаемостью в когортах пациентов с НМРЛ. С точки зрения механизмов, CADM1 также сдерживает проопухолевый воспалительный сигналинг ядерного фактора каппа B (NF-κB), который способствует метастазированию путем индукции секреции провоспалительных цитокинов и ремоделирования микроокружения опухоли¹⁷. Несмотря на отдельные данные об онкогенности miR-21-5p и опухолесупрессивных эффектах CADM1, в отношении оси miR-21-5p/CADM1 при НМРЛ сохраняются три критических пробела в знаниях: во-первых, прямое связывание и репрессия CADM1 со стороны miR-21-5p не имеют экспериментального подтверждения в клетках рака легкого; во-вторых, остается неопределенным, способствует ли эта ось развитию злокачественных фенотипов через нижележащие воспалительные пути; в-третьих, прогностическая способность комбинированных профилей экспрессии miR-21-5p/CADM1 не оценивалась на клинических образцах НМРЛ.

Исходя из этих нерешенных вопросов, мы выдвигаем центральную механистическую гипотезу: повышенная экспрессия miR-21-5p при НМРЛ напрямую связывается с 3′-UTR CADM1 для подавления экспрессии CADM1, тем самым снимая репрессию с подавляемого CADM1 метастатического воспалительного сигналинга, что ускоряет миграцию клеток НМРЛ и приводит к худшему клиническому прогнозу. Данное исследование преследует три заранее определенные цели: (1) подтвердить прямое молекулярное воздействие miR-21-5p на CADM1 и оценить миграцию в клеточных линиях НМРЛ A549 и H1299; (2) выяснить, модулирует ли каскад miR-21-5p/CADM1 метастатический потенциал посредством передачи воспалительных сигналов; (3) оценить клиническую прогностическую значимость профиля экспрессии miR-21-5p/CADM1 для поиска новых диагностических биомаркеров и терапевтических мишеней при метастатическом НМРЛ.

Протокол

Данное ретроспективное исследование было рассмотрено и одобрено Комитетом по этике больницы традиционной китайской медицины города Цючжоу (номер одобрения 202402208). До начала сбора образцов от каждого включенного в исследование пациента или его законного представителя было получено письменное информированное согласие.

Сбор образцов
Ткани первичных опухолей НМРЛ были получены хирургическим путем от включенных в исследование пациентов, в то время как соответствующие им прилегающие нормальные ткани легкого были ретроспективно собраны в Национальном инженерном исследовательском центре клинической биопсии (город Цючжоу, провинция Чжэцзян, Китай). В данное когортное исследование были включены образцы 157 пациентов с НМРЛ, последовательно набранных в период с января 2019 по декабрь 2024 года. Размер выборки из 157 парных образцов был статистически обоснован на основе ранее опубликованных исследований прогностической значимости miRNA при НМРЛ: при условии умеренного размера эффекта 0,5, α = 0,05 и статистической мощности 80% минимально необходимый размер выборки был рассчитан как 122 случая. Учитывая возможную потерю образцов, выраженный некроз тканей и потерю пациентов для последующего наблюдения, мы последовательно включили 157 подходящих пациентов с января 2019 по декабрь 2024 года, чтобы гарантировать достаточную статистическую мощность. Все ткани опухолей и соответствующих прилегающих нормальных тканей легкого были извлечены у одного и того же пациента во время хирургической резекции, что позволило сформировать парные образцы для последующего сравнительного анализа.

Критерии включения были следующими: (1) пациенты с патологически подтвержденным первичным НМРЛ по данным послеоперационной биопсии; (2) наличие полных исходных клинических данных, стадирования по гистопатологическим показателям и данных о выживаемости при долгосрочном наблюдении; (3) отсутствие лучевой, химической или таргетной терапии до момента забора тканей; (4) наличие полного набора парных образцов опухолевой и паранеопластической тканей.

Критерии исключения были следующими: (1) сочетанные вторичные злокачественные опухоли других органов; (2) пациенты, связь с которыми была утрачена в течение 3 месяцев после операции; (3) образцы с выраженным некрозом или недостаточным объемом ткани для последующего молекулярного анализа.

Все образцы свежей ткани помещали в жидкий азот в течение 15 min после хирургического иссечения, затем переносили в морозильник сверхнизких температур и хранили при −80 °C для последующей экстракции RNA и белков. Клиническое наблюдение проводилось регулярно; общая выживаемость измерялась в месяцах с момента постановки патологоанатомического диагноза до смерти или даты последнего контрольного осмотра.

Стратификация уровня экспрессии miR-21-5p
Значения относительной экспрессии miR-21-5p всех 157 пациентов были отсортированы в порядке возрастания, и когорта была стратифицирована по медианному порогу экспрессии. В связи с наличием множества совпадающих значений в районе медианы, пациенты с экспрессией ниже медианы были отнесены к группе с низкой экспрессией (n = 61); пациенты с экспрессией, равной или превышающей медиану, включая все совпадающие значения на уровне медианы, были классифицированы в группу с высокой экспрессией (n = 96). Данное правило распределения совпадающих значений было определено до проведения группировки для разрешения дублирования показателей медианы, а результат группировки был перепроверен по исходным количественным данным qRT-PCR.

Культивирование клеток
Линии клеток НМРЛК человека A549 и H1299 были получены от коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов). Клетки A549 поддерживали в среде RPMI-1640, а клетки H1299 культивировали в среде DMEM. Обе среды для культивирования дополняли 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллином (100 U/mL) и стрептомицином (100 µg/mL). Клетки культивировали в стандартных условиях при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂.

Для подтверждения подлинности клеточных линий A549 и H1299 перед всеми функциональными экспериментами было проведено профилирование коротких тандемных повторов (STR). Тестирование на контаминацию микоплазмами проводилось ежемесячно с использованием коммерческого набора для детекции микоплазм на основе ПЦР; для последующих анализов использовались только клетки, отрицательные по микоплазмам.

Клетки в логарифмической фазе роста с сохранной морфологией собирали для транзиентной трансфекции. Липидный реагент для трансфекции (см. Таблицу материалов) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Последующие клеточные анализы проводили через 50 h после трансфекции.

Трансфекция клеток
Для трансфекции клетки в логарифмической фазе роста с сохраненной морфологией высевали в культуральные планшеты за 24 ч до начала процедуры для достижения 60%–70% конфлюэнтности. Трансфекцию проводили с использованием липидного реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Использовали четыре экспериментальные группы: отрицательный контроль мимика (mimic-NC), мимик miR-21-5p, отрицательный контроль ингибитора (inhibitor-NC) и ингибитор miR-21-5p. Нуклеотидные последовательности приведены в Дополнительном файле 1.

Общую РНК экстрагировали через 50 ч после трансфекции, после чего проводили количественную обратную транскрипцию с ПЦР (qRT-PCR) для измерения относительной экспрессии miR-21-5p и проверки эффективности трансфекции. Анализы клеточной миграции выполняли через 50 ч после трансфекции. Для транзиентной трансфекции клетки обрабатывали мимиком miR-21-5p или отрицательным контролем мимика (mimic-NC) в конечной концентрации 50 nM, в то время как ингибитор miR-21-5p и отрицательный контроль ингибитора (inhibitor-NC) вводили в концентрации 100 nM. Чтобы избежать искажающих эффектов, вызванных различиями в количестве вводимых нуклеиновых кислот, общее количество трансфецированных нуклеиновых кислот поддерживали одинаковым для всех четырех групп обработки.

Пролиферацию клеток оценивали с помощью анализа с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Стабильно трансфицированные клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 3 × 10³ клеток/лунку, при этом для каждой группы создавали шесть технических повторностей. Через 24, 48 и 72 ч после посева в каждую лунку добавляли 10 µL реагента CCK-8, после чего инкубировали при 37 °C в течение 2 ч. Пролиферацию клеток количественно определяли путем измерения оптической плотности при 450 nm с помощью микропланшетного ридера.

Все эксперименты по транзиторной трансфекции, CCK-8 и миграции проводились не менее чем в трех независимых биологических повторностях, при этом каждая биологическая повторность включала 3–6 технических повторностей, как описано выше.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией
Общую РНК из клеток НМРЛ, а также из парных образцов клинических опухолей и прилегающих нормальных тканей выделяли с помощью реагента для экстракции РНК на основе фенола/гуанидина (см. Таблицу материалов). Чистоту и концентрацию РНК определяли методом ультрафиолетовой спектрофотометрии; обратной транскрипции подвергали только те образцы, у которых соотношение оптической плотности (OD) 260/280 и OD 260/230 составляло 1,8–2,1. Последовательности праймеров приведены в Дополнительном файле 1. Система для обратной транскрипции содержала 500 ng общей РНК, 2 µL буфера для обратной транскрипции, 1 µL смеси dNTP, 0,5 µL обратной транскриптазы, 1 µL специфического стем-петлевого праймера для miRNA или олиго(dT)-праймера для mRNA и воду, свободную от РНказ, до общего объема 20 µL. Система для амплификации qRT-PCR (общий объем 20 µL) состояла из 10 µL мастер-микса SYBR Green qPCR, 0,4 µL прямого праймера (10 µM), 0,4 µL обратного праймера (10 µM), 2 µL разведенной матрицы кДНК и 7,2 µL воды, свободной от РНказ.

Матричную РНК для CADM1 и GAPDH подвергали обратной транскрипции с использованием набора для обратной транскрипции, в то время как для miR-21-5p обратная транскрипция проводилась с использованием стем-петлевых праймеров и экзогенного cel-miR-39 в качестве внутреннего контроля (spike-in). Экзогенный контроль cel-miR-39 добавляли в каждый образец РНК сразу после выделения общей РНК и перед обратной транскрипцией. Поскольку cel-miR-39 представляет собой синтетическую микроРНК C. elegans, не имеющую гомологичных последовательностей в транскриптах человека, она позволяет корректировать отклонения, вызванные различной эффективностью экстракции РНК, потерей при деградации РНК и вариациями эффективности обратной транскрипции в разных образцах клинических тканей, служа экзогенным универсальным контролем нормализации для количественного определения микроРНК. qRT-PCR проводили с использованием мастер-микса на основе флуоресцентного ДНК-связывающего красителя на системе ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалов): 95 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов: 95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 20 с, с последующим анализом кривых плавления для подтверждения специфичности амплификации. Для каждого образца было выполнено три биологических повтора, каждый из которых включал три технических повтора; относительный уровень экспрессии рассчитывали методом 2⁻^ΔΔCt. Полные последовательности праймеров для амплификации мРНК CRP, TNF-α и IL-6 приведены в Дополнительном файле 1 вместе с последовательностями праймеров для CADM1, GAPDH и miR-21-5p.

Создание линии со стабильной экспрессией miR-21-5p с помощью лентивируса
Коммерческие лентивирусные векторы LV-miR-21-5p и пустой контрольный вектор LV-NC были упакованы в клетках 293T. Последовательность предшественника miR-21-5p была встроена в лентивирусный остов, содержащий ген устойчивости к пуромицину и репортерный ген GFP. Супернатанты лентивирусов собирали через 48 ч и 72 ч после трансфекции, затем концентрировали и очищали для последующего заражения клеток.

Клетки A549 и H1299 высевали за 24 ч до инфицирования для достижения 50–60% конфлюэнтности. Клетки инфицировали при MOI = 10 (A549) и MOI = 15 (H1299) с добавлением 5 µg/mL полибрен для повышения эффективности трансфекции. Среду заменяли через 24 ч после инфицирования, и клетки культивировали еще 48 ч перед отбором с помощью пуромицина.

Отбор стабильных клеток проводили с использованием пуромицина в концентрации 5 µg/mL в течение 10 дней подряд; для подтверждения полного удаления нетрансдуцированных клеток в течение 7 дней использовали неинфицированные контрольные клетки. Одиночные GFP-положительные клоны изолировали и экспандировали для создания стабильных моноклональных клеточных линий LV-21 и LV-NC.

Для проведения анализа восстановления функции CADM1 были подготовлены коммерческие лентивирусы для гиперэкспрессии LV-CADM1 и нокдауна sh-CADM1. Было сформировано четыре экспериментальные группы: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 и группа восстановления LV-miR-21-5p + LV-CADM1. Инфицирование лентивирусами CADM1 проводили при том же MOI и в тех же условиях скрининга пуромицином, что и для векторов miR-21-5p. Все эксперименты по восстановлению пролиферации и миграции были повторены в трех независимых биологических повторностях.

Валидация стабильной гиперэкспрессии miR-21-5p
Из собранных стабильных клеточных клонов LV-21 и LV-NC экстрагировали общую РНК. Для определения относительного уровня экспрессии hsa-miR-21-5p с использованием cel-miR-39 в качестве экзогенного контроля проводили qRT-PCR. Клоны клеток с повышением уровня miR-21-5p более чем в 8 раз по сравнению с группой LV-NC были отобраны для всех последующих функциональных анализов, что подтвердило успешное создание клеточных линий со стабильной гиперэкспрессией miR-21-5p.

Двойной люциферазный репортерный анализ
Были сконструированы репортерная плазмида с 3'-UTR дикого типа CADM1 (WT-CADM1), содержащая предполагаемую последовательность связывания miR-21-5p, и репортерная плазмида с мутантным 3'-UTR CADM1 (MUT-CADM1) с мутацией в области сид-последовательности связывания. Клетки A549 высевали в 24-луночные планшеты за 24 ч до трансфекции для достижения 60%–70% конфлюэнтности. В каждую лунку проводили ко-трансфекцию 500 ng WT/MUT репортерной плазмиды, 50 nM мимика miR-21-5p или NC-мимика и плазмиды внутреннего контроля Renilla люциферазы в фиксированном массовом соотношении. Через 48 ч после трансфекции клетки полностью лизировали, после чего последовательно определяли сигналы люминесценции светлячковой и Renilla люциферазы с помощью набора для двойного люциферазного анализа. Относительную люциферазную активность рассчитывали как отношение значения люминесценции светлячковой люциферазы к значению люминесценции Renilla люциферазы. Каждая экспериментальная группа включала три независимых биологических повтора, по три технических повтора в каждом биологическом повторе; для статистического сравнения относительной люциферазной активности между группами NC-мимика и мимика miR-21-5p использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок.

Анализ миграции в системе Transwell
Для проведения анализа миграции в системе Transwell стабильно трансфецированные клетки суспендировали в безсывороточной среде и высевали в верхние вставки из расчета 4 × 10⁴ клеток на лунку. Нижние камеры заполняли полной культуральной средой с добавлением 10% FBS для создания хемотаксического градиента. После инкубации в течение 48 h при 37 °C в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO₂ клетки, оставшиеся на верхней поверхности мембраны, осторожно удаляли. Клетки, мигрировавшие на нижнюю сторону мембраны, фиксировали метанолом и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Миграцию количественно оценивали путем подсчета клеток в пяти случайно выбранных микроскопических полях для каждой вставки. Каждый эксперимент проводили с использованием трех независимых биологических повторностей, включая по три технических повтора для каждой биологической повторности.

Статистический анализ
Все эксперименты in vitro проводились как минимум в трех независимых биологических повторностях, каждая из которых сопровождалась соответствующими техническими повторами. Сначала распределение данных оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка на нормальность для выбора метода статистического анализа. Для парных сравнений между опухолевой и прилегающей нормальной тканями применяли либо парный t-критерий, либо парный критерий знаковых рангов Уилкоксона, в зависимости от распределения данных. Сравнения между двумя независимыми группами анализировали с помощью независимого t-критерия или U-критерия Манна-Уитни. Различия между несколькими группами, включая эксперименты по восстановлению функции (rescue experiments), оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующей апостериорной коррекцией Бонферрони, в то время как ANOVA с повторными измерениями использовали для анализа лонгитюдных наборов данных, таких как тесты на пролиферацию CCK-8 и заживление ран. Связи между категориальными клиническими переменными исследовали с помощью критерия χ², а взаимосвязь между экспрессией miR-21-5p и CADM1 оценивали с помощью корреляционного анализа Пирсона. Выживаемость пациентов анализировали с помощью кривых Каплана-Мейера, сравнения проводили с помощью лог-рангового критерия. Независимые прогностические факторы определяли с помощью однофакторного и многофакторного регрессионного анализа пропорциональных рисков Кокса. Статистическая значимость определялась как P < 0.05. Многофакторная регрессия Кокса была скорректирована по возрасту, полу, гистологическому типу, уровню miR-21-5p и состоянию лимфатических узлов (контрольные значения: возраст ≤ 60, женский пол, плоскоклеточный рак, низкий уровень miR-21-5p, отсутствие поражения узлов); допущение о пропорциональности рисков проверяли по остаткам Шенфельда, переменные с однофакторным P < 0.10 включали методом принудительного ввода (enter selection).

Результаты

Корреляция между экспрессией miR-21-5p и клинико-патологическими характеристиками пациентов с НМРЛ
В общей сложности 157 образцов опухолей при НМРЛ были разделены на группы с низкой экспрессией miR-21-5p (n = 61) и высокой экспрессией (n = 96) на основе медианных уровней miR-21-5p. Анализ с использованием критерия хи-квадрат не выявил значимых корреляций экспрессии miR-21-5p с возрастом пациентов (χ² = 1.36, P = 0.2435), полом (χ² = 1.06, P = 0.3032), гистологическим типом (χ

Обсуждение

В данном исследовании систематически подтверждено повышенное выражение miR-21-5p в клинических тканях НМРЛ, что коррелировало с усилением транскрипции воспалительных факторов, а также более выраженной способностью клеток к миграции и пролиферации; при этом эксперименты с использованием двойного люциферазного теста, qRT-PCR и опыт спасения (rescue experiments) позволили идентифицировать CADM1 в качестве прямой функциональной мишени miR-21-5p. Биоинформатический прогноз дополнительно показал, что нижестоящие мишен...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10% нейтральный буферизованный формалин	Fisher Scientific (Fisherbrand™)	SF100-4 (типичный)	Фиксатор для тканей; ткани нарезают до &толщина < 5 мм, фиксация при комнатной температуре в течение 14–26 часов
96-луночный планшет для культивирования клеток	Corning	3526	Планшет для высева трансфицированных клеток и проведения анализа заживления ран (царапинного теста)
Линия клеток A549	ATCC (или Шанхайский ресурсный центр)	CCL-185	Линия клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека (аденокарцинома)
набор для анализа CCK-8	Dojindo	CK04	Определение пролиферации
Среда для культивирования клеток (неуказанная)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	Различные (напр., RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022)	Базальная среда для клеточных линий НМРЛ; точный состав зависит от используемой клеточной линии
cel-miR-39 (экзогенный контрольный стандарт)	GenePharma (Шанхай, Китай)	Индивидуальный (например, B010302)	Внешний стандарт для нормализации экспрессии микроРНК, добавляемый при выделении РНК
CO2 Инкубатор (с увлажнением)	Thermo Fisher Scientific (Heracell)	Heracell 150i (50116047)	Предоставляет 37°C, 5% CO22и насыщенная влажность для культивирования клеток
СРБ/ФНО-αпары праймеров для ИЛ-6	Sangon Biotech	синтез на заказ	Полные последовательности в Дополнительном файле 1
Раствор для окрашивания кристаллическим фиолетовым	Solarbio	G1062	Окрашивание мигрировавших клеток
среда DMEM	Gibco	11965092	Для культивирования клеток H1299/293T
Набор для проведения двухлюциферазного репортерного анализа	Promega	E1910	Детекция 3'-UTR CADM1 дикого типа и мутантной формы
Экзогенная cel-miR-39	Qiagen	специальный внутренний стандарт (spike-in)	Добавлен этап после изоляции РНК для нормализации
Фетальная бычья сыворотка (ФБС)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10437028	Добавка, вносимая в культуральную среду до конечной концентрации 10% для поддержания роста клеток
тонкий наконечник для пипетки (например, 10 µL совет)	Axygen (Corning)	T-300	Используется для ручного соскабливания монослоя клеток с целью создания "рана" пробел
GAPDH (эндогенный контроль)	Различные поставщики (например, Sangon Biotech, RiboBio; праймеры по индивидуальному заказу)	Специальный вариант	Референтный ген для нормализации мРНК, используемый в qRT-PCR
GO/KEGG (аннотация с помощью clusterProfiler)	Bioconductor	сборка 2026 года
GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad	v9.5.1	Построение графиков & статистика in vitro
Клеточная линия H1299	ATCC (или Шанхайский ресурсный центр)	CRL-5803	Линия клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека, полученная из метастаза в лимфатический узел
Термоинактивированная FBS	Gibco	10099141	10% рабочая концентрация
линия клеток HEK-293T	ATCC	CRL-3216	RRID:CVCL_0063; ежемесячное STR-тестирование, микоплазмы не обнаружены
Смесь для упаковки лентивируса	Genecopoeia (или Takara Bio)	HPK-LvT-100 (Genecopoeia)	Предоставляет упаковочные плазмиды (gag/pol, rev, vsv-g) для продукции лентивируса
Лентивирусный вектор-21 (LV-21)	GeneChem (Шанхай, Китай) или Genecopoeia	Индивидуальный заказ	Лентивирусный вектор, содержащий miR-21-5p, для создания клеточных линий со стабильной экспрессией
Лентивирусный контрольный вектор (LV-NC)	GeneChem (Шанхай, Китай) или Genecopoeia	Специальный	Отрицательный контроль: лентивирусный вектор без вставки miR-21-5p
Липидный реагент для трансфекции	Thermo Fisher	L3000015	Для транзиентной трансфекции
Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	L3000015 или L3000008	Реагент для трансфекции на основе липидов; через 50 часов после трансфекции для последующих экспериментов
Метанол	Sinopharm	67-56-1	Фиксация клеток
Метанол (фиксатор/разбавитель для окрашивания)	Sigma-Aldrich	34860	Используется в качестве фиксатора или разбавителя при окрашивании кристаллическим фиолетовым
ингибитор miR-21-5p/отрицательный контроль ингибитора	GenePharma	синтез на заказ	Последовательности в Дополнительном файле 1
мимик miR-21-5p/отрицательный контроль мимика (mimic-NC)	GenePharma	синтез на заказ	Последовательности в Дополнительном файле 1
miRDB	Вашингтонский университет	v6.0
miRWalk	Гейдельбергский университет	v3.0
Национальный центр биопсийной инженерии	Национальный центр биопсийной инженерии (Китай)	Данные отсутствуют	Институциональный поставщик образцов тканей рака легкого с зарегистрированными клиническими данными и гистопатологическим диагнозом
Ткань НМРЛ (для первичного культивирования)	Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co.	Индивидуальный заказ	Источник ткани; культивирование в среде с 10% FBS при 37°C; для трансфекции отобраны клетки с хорошей морфологией, находящиеся в логарифмической фазе роста
ПЦР-амплификатор	Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)	7500 Fast (4406984)	Получение продуктов амплификации для ОТ-ПЦР в реальном времени
Пенициллин-стрептомицин	Solarbio	P1400	100 ЕД/мл пенициллина, 100 μg/mL стрептомицин
Дозаторы (одноканальные & Многоканальный)	Eppendorf	Серия Research Plus	Для точного дозирования жидкостей во всех экспериментах
Полибрен	Sigma-Aldrich	H9268	Заключительный 5 μg/mL для lentivirus-инфицирования
Пуромицин	InvivoGen	ant-pr-1	5 μg/mL для скрининга стабильных клеточных линий
Дигидрохлорид пуромицина	Thermo Fisher Scientific (InvivoGen)	ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich)	Селективный антибиотик, используемый в концентрации 5 μg/mL для создания стабильно трансфицированных клеточных линий
R	Фонд R	v4.2.1	Пакеты: clusterProfiler, ggplot2
Набор для обратной транскрипции	Takara	RR047	РТ со шпилечными праймерами для мкРНК, oligo(dT) для мРНК
Эппендорф-пробирки, свободные от РНаз	Axygen (Corning)	MCT-150-C	Пробирки объемом 1,5 мл, не содержащие РНКазы, для хранения и обработки РНК
среда RPMI-1640	Gibco	11875093	Для культуры клеток A549
si-CADM1	GenePharma	синтез на заказ	Последовательности в Дополнительном файле 1
si-NC	GenePharma	синтез на заказ	Последовательности в Дополнительном файле 1
SPSS	IBM	v26.0	Клинический анализ / регрессионный анализ Кокса
Мастер-микс для qPCR с SYBR Green	Roche	4913914001	амплификация методом ОТ-ПЦР в реальном времени
TargetScan	Массачусетский технологический институт	v8.2
Реагент для экстракции тотальной РНК	Takara	9109	Лизис на основе фенола/гуанидина
Камера Transwell	Corning (Costar)	3422 (на 24 лунки, 8.0 µm)	Для трансфекции клеток в среде при комнатной температуре; добавляли химические праймеры и инкубировали в течение 48 ч
Камеры для миграции Transwell	Corning	3422	8 μm размер пор
Реагент TRIzol	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	15596026	Экстракция суммарной РНК из образцов тканей; оценка качества РНК по соотношениям OD260/280 и OD260/230
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	25200072	Для отсоединения клеток от культуральных сосудов перед посевом в 24-луночные планшеты