Стабилизирующие белки и белки — конденсаты РНК в гидрогелях агарозы с низким уровнем плавления для количественных биофизических измерений

Краткое содержание

Здесь мы представляем надёжный метод физической иммобилизации жидко-жидких фазо-разделённых конденсатов в пористом низкоплавящемся агазозном гидрогеле без нарушения их внутренней динамики жидкости. Этот подход минимизирует отложение капель, слияние и поверхностное увлажнение артефактов, позволяя воспроизводимо визуализацию и количественный биофизический анализ в течение нескольких часов.

Аннотация

Биомолекулярные конденсаты, образованные в результате разделения жидкой фазы на жидкость, всё больше признаются фундаментальными организационными единицами клетки, с ролями от обработки РНК до сборки стресс-гранул. Восстановление таких конденсатов in vitro с использованием очищенных белков и РНК обеспечивает модельные системы, при этом жидкие капли со временем грубеют, осадкивают и распространяются по поверхностям, что вносит значительную вариабельность в количественные измерения в экспериментальные периоды. Встраивание этих конденсатов в разрежённый, оптически прозрачный и химически инертный гидрогель — здесь полученный из агарозы с низким уровнем плавления (LMA) при 0,3–1,0% w/v — стабилизирует капли в трёх измерениях, позволяя использовать методологии с более длительным временем измерения или экспериментальные установки с повторными измерениями. В данной статье представлен подробный, пошаговый протокол подготовки запасов LMA, образования капель и вложения, а также приводятся примеры конкретных биофизических показаний ниже. Мы также показываем, что определённые свойства капель, такие как молекулярная диффузия, сохраняются после вложения LMA в тестируемые репрезентативные системы. Поскольку метод совместим с конфокальной, широкополевой или сверхразрешающей микроскопией, флуоресцентным восстановлением после фотоотбеливания или ядерной магнитно-резонансной спектроскопией, среди прочих, он может поддерживать количественную характеристику биомолекулярных конденсатов, важных для здоровья и болезней.

Введение

Разделение жидкой и жидкой фазы (LLPS) способствует образованию безмембранных органелл и биомолекулярных конденсатов в клетках, включая стресс-гранулы, P-тела и ядро 1,2,3,4,5. Эти конденсаты концентрируют определённые белки и нуклеиновые кислоты, сохраняя при этом быстрый обмен с окружающей цитоплазмой или нуклеоплазмой — отличительной чертой жидкоподобного поведения 1,2,3,4,5. Дисрегуляция LLP связана с различными заболеваниями, такими как нейродегенеративные^{заболевания 3,6,7}, а также связана с репликацией ряда вирусов, таких как SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

In vitro восстановление конденсатов с использованием очищенных белков и РНК при определённых буферных условиях стало основным подходом для изучения механизмов^{LLPS 3,4}. Однако капли в пробирке или на стеклянной поверхности подвержены трём основным артефактам: (i) гравитационное осаждение, вызывающее накопление капель на дне; (ii) слияние, когда капли со временем сливаются в меньшие крупные структуры; и (iii) поверхностное смачивание, когда капли распространяются и частично адсорбируют на слепке покрытия. Эти явления снижают воспроизводимость количественных измерений и затрудняют отслеживание отдельных капель в их физиологически значимых^{измерениях 13}. Эти явления дополнительно ограничивают использование методов, требующих увеличенного времени измерения от минут до часов (например, ядерная магнитно-резонансная [ЯМР] спектроскопия или сверхразрешающая микроскопия, такие как STORM), и запрещают повторные измерения на протяжении длительного времени.

Физическая иммобилизация в гидрогелевой сети одновременно охватывает все три артефакта. Агароза образует физически сшитый гель при температурах ниже 34–38 °C. При концентрациях 0,3–1,0% w/v размер сетки агарозы достаточно велик, чтобы удерживать целые микрометровые капли, оставаясь при этом достаточно пористым, чтобы не мешать молекулярной динамике внутри^{капель 13}. Кроме того, пористость агарозной матрицы позволяет диффузии макромолекул и малых молекул внутрь и наружу вложенных капель. Для особенно чувствительных к температуре систем, включающих белки со свернутыми доменами или следующих фазового разделения типа верхней и нижней критической температуры раствора (UCST/LCST), вместо этого можно использовать агарозу с низким уровнем плавления (LMA) с точкой гелирования 26–30 °C. Альтернативные методы защиты от увлажнения, такие как поверхностная пассивация, могут снизить адгезию конденсата и, соответственно, увлажнение, но часто требуют специализированной подготовки и не предотвращают осадкование или слияние капель. В отличие от этого, агарозное вложение обеспечивает простой и широко доступный способ пространственной обездвиживания конденсатов. Важно отметить, что агароза была подтверждена тем, что не нарушает конформационное состояние сросшегося в саркоме (FUS) и других РНК-связывающих белков при образовании капель до концентрации агарозы до 1,0% w/^{v 13}. Этот протокол стандартизирует подход вложения агарозы для общего использования с множеством интересующих систем белков или белков-РНК, предоставляя пошаговые рекомендации по подготовке реагентов и образцов.

Протокол

1. Приготовление агарозного бульона

ВАЖНО: Подготовьте агарозный бульон в том же буфере, что используется для изготовления фазово-разделенных образцов (далее — «капельный буфер»), чтобы предотвратить несоответствие^{буфера 14}. Пример: образец нуклеокапсида готовится в буфере A (25 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,2), который также следует использовать для подготовки агарозного запаса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные экспериментальные условия, включая, но не ограничиваясь, буферным составом, концентрацией белка, использованием добавок и объёмами окончательного образца, во многом зависят от конкретной исследуемой биологической системы и конкретного последующего применения. Аналогично, параметры сбора, настройка приборов и анализ данных сильно зависят от образца и конкретного эксперимента. Например, подготовка нуклеокапсида SARS-CoV-2 с поли(A) описана на рисунке 1A (конфокальная флуоресцентная микроскопия).

1. Взвесьте соответствующее количество LMA или обычной агарозы в трубку объёмом 1,5 мл с буфером для капель. Пример: для бульона с 2% w/v растворите 20 мг агарозы в 1 мл буфера A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговая концентрация агарозы должна составлять 1–2% w/v, в зависимости от желаемой конечной концентрации агарозы в образце. Превышание 2% w/v не рекомендуется, так как становится всё сложнее пипетировать. Отрежьте узкий конец кончика пипетки, чтобы облегчить пипетирование, особенно при высокой концентрации агарозы. Обратитесь к разделу обсуждения, чтобы определить, требуется ли LMA или обычная агароза для образцов.
2. Нагрейте агарозный бульон до 80–90 °C в нагревательном блоке или водяной бане и полностью растворите агарозу с помощью вихря (примерно 10 минут).
   ВНИМАНИЕ: Расплавленная агароза горячая. Обращайтесь осторожно.
3. Уравновесьте агарозный бульон до 37 °C (LMA) или 55 °C (обычная агароза) в нагревательном блоке или водяной бане. Убедитесь, что раствор остаётся прозрачным и жидким при этой температуре. При необходимости проверьте температуру агарозного бульона с помощью термометра.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Расплавленные запасы агарозы можно поддерживать в тепле 30–60 минут.
   Нагрев агарозы в водяной бане настоятельно рекомендуется для обеспечения более однородного нагрева и поддержания целевой температуры с достаточной точностью. Это особенно важно при работе с LMA, так как небольшие отклонения температуры могут вызвать преждевременное желирование.
4. После подготовки образца (раздел 2) храните остатки агарозы при +4 °C. Следуйте шагам 1.2 и 1.3 выше, чтобы повторно расплавить и уравновесить запас агарозы перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем хранить бульон агарозы максимум 2 недели при +4 °C и подвергать его не более чем 2–3 циклам затвердевания/плавления. Используйте хорошие производственные практики для предотвращения загрязнения. Убрасывайте запасы раньше, если они не переплавляются или затвердеют, либо если возникает видимое загрязнение.

2. Подготовка образцов

1. Предварительно разогрейте все материалы, непосредственно контактирующие с агарозой (например, наконечники пипеток, трубки, микроскопические стекла), примерно до 37 °C, поместив их на нагревательный блок или в инкубатор на 2–3 минуты.
2. Подготовьте запас агарозы, как описано в Разделе 1.
3. Подготовьте буфер для капель, компоненты, разделяющие фазы (например, запасы белков или РНК) и любые другие добавки (например, агенты для сближения, красители) для образцов согласно стандартному протоколу. Уравновесить до комнатной температуры (RT). Пример: буфер A (25 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,2), нуклеокапсидный белковый запас (60 мкм, в буфере A), поли(A) запас (30 мкм, в буфере A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для восстановления после флуоресценции после фотоотбеливания (FRAP), конфокальной флуоресцентной микроскопии или стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM) добавьте небольшую долю флуоресцентно меченного белка или РНК в белки или РНК соответственно (рекомендуемо: <5% разметированной фракции).
4. Рассчитайте объёмы буфера капель, запаса агарозы, компоненты, разделяющие фазы (например, белок или РНК, представляющие интерес), а также любые дополнительные добавки (например, агенты для наполнения), необходимые для образца. Пример: 6 мкл буфера A, 5 мкл 2% агарозного запаса (конечные 0,5%), 5 мкл нуклеокапсидного белка (конечные 15 мкм), 4 мкл поли(A) (конечные 6 мкм). Финальный том 20 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это сильно зависит от тарелки, трубки, пластины или другого сосуда, используемого для эксперимента, обычно используемые объёмы включают 150 мкл для ЯМР-трубки диаметром 3 мм, 20 мкл для микроскопических или FRAP-экспериментов в 6-канальном микроскопическом слайде и 20–30 мкл для экспериментов STORM в микроскопических слайдах с 18 лунками (см. таблицу материалов).
   1. В качестве начальных значений используйте конечные 0,3–0,5% с агарозой для стандартных биофизических тестов и 0,8–1,0% с водой для долгосрочной стабилизации (например, эксперименты по старению).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочной стабилизации и хранения образцов следует принять меры для предотвращения обезвоживания образца (например, герметизация контейнера, хранение в увлажнённой камере и добавление испарительного барьера) и для обеспечения стабильности буферного состава и pH во время длительных инкубаций.
   2. Для ЯМР-образцов добавьте финальные 5% v/v D2O в образец для блокировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация всех остальных компонентов и общий объём образца сильно зависят от конкретного применения и экспериментальной установки.
5. Добавьте соответствующие объёмы буфера, компонентов для разделения фаз, агарозного запаса и добавок в предварительно нагретую трубку объёмом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуем сначала добавить буфер и агарозу, а затем любые дополнительные добавки. Мы также рекомендуем добавить компоненты, разделяющие фазы, для запуска образования конденсата. Однако оптимальный порядок смешивания зависит от системы и должен быть определен заранее. Это особенно актуально для систем, в которых стехиометрия и порядок сложения могут сильно влиять на размер капель или компартментализацию. Пример: Порядок смешивания образца нуклеокапсида: первый буфер A, второй агарозный запас, третий нуклеокапсидный белок и последний поли(A), используя объёмы, указанные в шаге 2.4. В этом примере LLPS запускается добавлением poly(A). Для систем, в которых LLPS создаёт видимую мутность, мутность может служить качественным индикатором контроля качества; однако время запуска и видимость зависят от системы, и отсутствие мгновенной мутности само по себе не означает сбой протокола.
   1. Держите трубку в нагревательном блоке или в водяной бане, несколько раз поднимайтесь и опускайте трубку. Избегайте появления воздушных пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пока агароза остаётся жидкой, капли могут слиться. Таким образом, изменение времени прединкубации на нагревательном блоке или в водяной бане перед началом гелирования может быть полезным инструментом для изучения капель разного размера. Характеристика кинетики роста капель при отсутствии агарозы перед выбором интервала прединкубационного времени позволяет исследователям воспроизводимо нацелиться на конкретный диапазон размеров капель.
6. Для образцов микроскопии / FRAP:
   1. Используйте обычную пипетку для быстрого переноса образца в/на выбранный микроскопический стекло (например, канальный микроскопический слайд с нижней частью накладки).
   2. Позвольте желировать на RT в течение 5–10 минут (см. примечание в разделе обсуждения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте микроскопический стекло в этот период. Защищайте люминесцентные образцы от света.
   3. Измеряйте образец согласно стандартному протоколу. Пример: вращающийся дисковый конфокальный микроскоп, 100x 1.45 plan apo масляный объектив, длина волны возбуждения 561 нм для красителя Cy3, захват 100 мс при 30% мощности лазера (Cy3) и 50 мс при 6% интенсивности света (яркое поле). Для FRAP: область отбеливателя размером 1/10 диаметра капли, размещённая в центре капли, 25 кадров предварительного отбеливания (без задержки), 60 кадров после отбеливателя (с интервалом в 1 с), лазерный импульс для отбеливания 15 мс при мощности 70% лазера. Анализировать восстановление FRAP с помощью полномасштабной нормализации в программном обеспечении с открытым доступом; Сообщайте о параметрах кинетической подгонки только в случае выполнения подгонки.
7. Для образцов STORM:
   1. Используйте обычную пипетку, чтобы быстро перенести образец в выбранный затвор STORM (например, 18-камерный затвор с нижним дном с укрытием). Раздайте образец каплёй.
   2. Позвольте желировать на RT в течение 5–10 минут (см. примечание в разделе обсуждения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте микроскопический стекло в этот период. Защищайте люминесцентные образцы от света.
   3. Заполните всю скважину буфером STORM. Запечатайте скважину согласно стандартному протоколу.
   4. Уравновесить образец не менее 1–2 часа перед измерением, чтобы буфер STORM диффундировал в агарозный гидрогель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная диффузия буфера STORM в образец легко проверить, если флуоресцентные красители мигают во время получения STORM. В зависимости от спецификаций образца может потребоваться более длительное время уравновешения.
   5. Измеряйте образец в соответствии со стандартным протоколом. Пример: инвертированный микроскоп Ti2, масляный объектив SR apochromat TIRF 100x 1.49, сильно наклонённое тонкое освещение. Получение 20 000 кадров на образец, поле обзора 64 x 64 пикселя, время экспозиции 10 мс с лазером мощностью 125 мВт 647 нм для красителя Cy5, а также использование лазера мощностью 20 мВт 405 нм для перехода из долгоживущего темного состояния в основное состояние. Изображения обрабатывались с использованием оценки максимальной вероятности с использованием многоизлучательной подгонки. Была применена коррекция дрейфа, и в финальную визуализацию были включены только точки данных с точностью локализации 25 нм и выше. Окончательные изображения получаются с использованием метода среднесмещённой гистограммы при увеличении в 20 раз (1 пиксель = 8 нм в итоговом изображении).
8. Для образцов ЯМР:
   1. Используйте длинную, тонкую стеклянную пипетку (предварительно подогретую), чтобы быстро перенести образец в ЯМР-трубку. Раздайте образец на дне пробирки.
   2. Позвольте желировать на RT в течение 5–10 минут (см. примечание в разделе обсуждения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не трясите ЯМР-трубку в этот период.
   3. Измеряйте образец в соответствии со стандартным протоколом. Пример: напряжённость поля ЯМР 750 МГц с зондом комнатной температуры PATXI, трубка 3 мм, захват при 25 °C, стандартная последовательность импульсов (stebpgp1s19) для экспериментов с диффузией (DOSY), параметры: 4 096 точек при 32 сканах, сила градиента 2–95%, время диффузии 0,08 с, градиентный импульс 12 мс, задержка релаксации (d1) 5 с.

Результаты

Протокол применялся к конденсатам, образованным N-концевым доменом FUS (FUS NTD) или к белку SARS-CoV-2 нуклеокапсид (N) с поли(A) или s2m РНК, как к представительным примерам как белковых, так и белок-РНК-капель. Чтобы оценить, влияет ли агароза на образование конденсата в исследуемых условиях, мы сформировали капли с N-белком и поли(A) при наличии и отсутствии 0,5% w/v LMA. Поскольку LMA затвердевает примерно через 5 минут на RT, мы записали изображения флуоресцентной микроскопии в этот момент и обнаружили, что капли примерно одинакового размера в обоих случаях (рисунок 1A,B). Чтобы продемонстрировать превентивное действие агарозы на смачивание и сращение капель, мы записали ещё один набор изображений через 60 минут после подготовки образца. В то время как капли, вложенные в агарозу, не меняли размер, конденсаты при отсутствии LMA демонстрировали резкое увеличение размера из-за сплавления и поверхностного увлажнения (рисунок 1A,B). Хотя мы вложили капли относительно рано после нуклеации, капли разного размера можно вложить, изменяя время предварительной инкубации. Несмотря на вложение капель в агарозный гидрогель, измеренная динамика конденсата не была заметно изменена. Восстановление FRAP и, следовательно, видимая диффузия капель были очень похожи как с LMA, так и без неё в образце (рисунок 1C). Кроме того, предыдущие эксперименты с ЯМР-спектроскопией с диффузионным порядком (DOSY) с конденсатами FUS NTD показали, что частоты диффузии не были заметно обнаруживались концентрацией агарозы, по крайней мере в диапазоне 0,25–1% w/v (см. рисунок 1D) (адаптирован из Emmanouilidis et ^al.13). Эти результаты показывают, что агарозный гидрогель подходит для захвата фазово-разделённых конденсатов в пространстве и времени, что позволяет проводить повторные измерения на протяжении длительного времени.

Хотя микроскопические и FRAP-измерения записываются довольно быстро (от секунд до минут), некоторые эксперименты требуют нескольких минут (например, STORM, 1D ¹H NMR) или даже часов (например, 2D [^{15 N 1}H] HSQC NMR). Для таких экспериментов крайне важно, чтобы капли оставались неподвижными на протяжении всего набора и не осадивались со временем. Здесь мы показываем, что стабилизировали N-белок + s2m РНК-капли в LMA достаточно долго, чтобы получить изображения STORM (рисунок 1E). Кроме того, спектры ЯМР капель FUS NTD при наличии и отсутствии агарозы имели сопоставимую ширину линий, что указывает на отсутствие обнаруженного взаимодействия между гидрогелями агарозы и белком при таких условиях (см. рисунок 1F) (адаптировано из Emmanouilidis et ^al.13). В отличие от этого, спектры конденсатов, вложенных в агарозу, показывали более высокую интенсивность сигнала, вероятно, потому что нестабилизированные капли осаживались в трубке ЯМР-трубки при получении и, следовательно, больше не были доступны для измерений (см. рисунок 1F) (адаптировано из Эммануилидис и ^др.13). В заключение, стабилизация конденсатов в агарозных гидрогелях не только позволяет проводить временные эксперименты, но и применять методы с увеличенным временем накопления, сохраняя при этом измеренные свойства капель в протестируемых системах.

Рисунок 1: Стабилизация конденсата с помощью агарозного вложения без заметного возмущения измеренных свойств капель. (A) Флуоресцентная микроскопия нуклеокапсидного белка 15 мкм с 6 мкм Cy3-poly(A) (5% с меткой) в буфере A (25 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, pH 7,2) при наличии (+ агарозе) или отсутствии (без агарозы) 0,5% w/v LMA. Изображения были получены через 5 или 60 минут после смешивания / встраивания агарозой. Изображения представляют собой 7 изображений, полученных в n = 2 независимых экспериментах. Шкала = 5 мкм. (B) Количественная оценка радиусов капель конденсатов, показанных в (A). Данные отображаются в виде коробочных графиков (box = межквартильный диапазон, центральная линия = медиана, whiskers = диапазон оставшихся данных, точка = выбросы). Средний радиус ± стандартного отклонения (sd) и количество анализируемых капель в каждом состоянии отображаются непосредственно на графике. Данные следуют нормальному распределению. Отдельные капли не рассматривались как независимые биологические копии для статистического вывода. Статистический тест не проводился; распределения показаны описательно. (C) FRAP капель, показанных в (A) в момент времени 5 минут. Фотоотбеливание проводилось лазером 561 нм (Cy3). Данные показывают нормированную интенсивность (среднее ± sd n = 3 независимых репликаций на каждое условие), которая получается нормализацией обесцвеченного сигнала до значений до отбеливателя, неотбеленной области того же образца и фоновой флуоресценции. (D) Неатенуированный сигнал DOSY белка 200 мкм FUS NTD в буфере B (30 мМ HEPES, 200 мМ KCl, 600 мМ мочевины, pH 7,3) в присутствии 0,25, 0,5 или 1,0% w/v обычной агарозы. N = 1. (E) Конфокальная флуоресцентная микроскопия и STORM-изображения белка Cy5-нуклеокапсидного белка (5% с меткой) с 6 мкм вирусной s2m РНК в буфере A, содержащей 0,5% w/v LMA. Представитель n = 3 независимых эксперимента. Шкала = 1 мкм на обоих изображениях. (F) ^{1D 1}H ЯМР-спектры (слева) и 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR спектры (справа) с 200 мкм FUS NTD в буфере B при наличии или отсутствии 0,5% w/v регулярной агарозы. N = 1. Панели (D) и (F) воспроизведены из Эммануилидис и ^др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Успех вложения биомолекулярных конденсатов в агарозу зависит от нескольких факторов. Во-первых, агарозу необходимо поддерживать при температуре, достаточно высокий, чтобы предотвратить преждевременное желирование, и при этом достаточно низким, чтобы не нарушать биомолекулярные структуры или взаимодействия. Агарозы с низким уровнем плавления имеют температуру гелирования 26–30 °C и температуру плавления 60–65 °C, тогда как обычная агароза имеет температуру гелирования 34–38 °C и температуру плавления 90–95 °C. Во-вторых, быстрое смешивание и перенос в конечный реагионный сосуд (например, ЯМР-трубка) критически важны, поскольку небольшие отклонения во времени или температуре могут привести к неравномерному вложению и, следовательно, к снижению воспроизводимости.

Несмотря на эти критические моменты, метод можно легко адаптировать под различные экспериментальные нужды. Для систем с фазовым разделением с внутренне неупорядочёнными белками или систем, не подверженных тепловой денатурации, вместо LMA можно использовать обычную агарозу для экономии затрат. При подготовке образцов, содержащих белки с сложенными доменами, или любой другой температурочувствительной (био)молекулами, подверженной термической денатурации, следует использовать LMA для предотвращения денатурации. Можно подготовить контрольный образец только с теплом/без агарозы, чтобы отделить эффекты вложения агарозы от эффектов временного нагрева образца. Для снижения риска температурно-зависимых эффектов денатурации агароза с низким уровнем плавления особенно подходит для чувствительных к температуре образцов, тогда как концентрация агарозы может регулироваться для модуляции размера сетки и степени механического удержания. Для высокочувствительных диффузионных измерений, таких как недавно разработанный метод ЯМР под названием LLPS REDIFINE^15,16, обычно предпочтительнее наименьшая концентрация агарозы, предотвращающая осадконакопление — обычно 0,3–0,5% w/v. Для экспериментов по созреванию, требующих недель или месяцев стабильности, предпочтительнее 0,8–1% w/v. Эти параметры должны быть оптимизированы для обеспечения эффективной стабилизации без заметного изменения морфологии или динамики конденсата и всегда адаптироваться к конкретной системе. Эта валидация требует сравнения образцов с вложением агарозы и без них (и в других условиях идентичности) или сравнения различных концентраций агарозы (чтобы исключить эффекты сетки, зависящие от концентрации), например, использование микроскопии для оценки морфологии капель, FRAP для оценки диффузии или любого другого подходящего метода для оценки свойств капель, важных для исследователя.

Время желирования — ещё один важный фактор. Время, необходимое для затвердевания агарозы, зависит от нескольких факторов, таких как тип буфера, pH, конечная концентрация агарозы, начальная температура и то, используется ли агароза с низким плавлением или обычная агароза. Обычно агароза затвердевает в течение 5–10 минут. Желирование агарозного бульона может служить показателем желирования образца. Аналогично, изменение времени прединкубации перед вложением агарозы позволяет воспроизводить различные размеры капель. Выбор буфера тоже^{критически 14}. Крайне важно, чтобы агарозный бульон был подготовлен в том же буфере, что и для подготовки образцов, чтобы избежать несоответствия буферов. Буфер должен быть таким, в котором система известна тем, что разделяет фазы.

Для каждой системы следует учитывать чувствительность к температуре. Многие системы фазового разделения демонстрируют термообратимое фазовое поведение, известные как LLPS типа UCST/LCST. Поэтому кратковременное воздействие слегка повышенных температур при смешивании агарозы должно быть проверено, чтобы убедиться, что это не нарушает фазовое поведение или свойства измеренной капли. Если возникают проблемы, их обычно можно устранить путём уточнения температурных условий, минимизации времени обработки или корректировки концентрации агарозы. Например, хотя запасы LMA идеально нагреваются до 37 °C, запасы LMA всё равно останутся жидкими при 33–35 °C.

Устранение неисправностей важно, поскольку могут возникать различные режимы отказа в зависимости от образца и экспериментальной настройки. Если капли растворяются при смешивании с агарозой, это может быть вызвано слишком тёплым LMA или несоответствием буферов. В этом случае запас LMA следует поддерживать ровно при температуре или на несколько градусов ниже целевой температуры и готовить в таком же буфере, что и интересуемый белок/РНК. Если в кончике пипетки происходит преждевременное желирование, это может быть связано с слишком холодным LMA или ненагретыми кончиками. Чтобы этого избежать, наконечники и трубки должны быть предварительно прогреты до 37 °C, оператор должен работать быстро, а нагревательный блок должен оставаться при нужной температуре. Если со временем происходит увлажнение, слияние или осаждение, это может быть связано с слишком редким гелем или неравномерным желированием. В этом случае концентрацию LMA можно увеличить, и даже желирование при комнатной температуре должно быть обеспечено. Если раствор агарозы содержит видимые частицы, это может быть связано с неполным растворением агарозы. В этом случае агарозу следует нагреть до полной прозрачности и тщательно перемешать перед использованием (например, в вихрь). Если при смешивании или пиппинге появляются пузырьки воздуха, они могут мешать визуализации и приводить к неравномерному распределению конденсата. Чтобы минимизировать образование пузырьков, растворы следует аккуратно перемешивать, медленно поднимая и опуская трубку. Если наблюдается гетерогенное желирование или неравномерное распределение конденсата, это может быть связано с недостаточным смешиванием или локальными температурными градиентами во время желирования. В этом случае образцы следует хранить на нагревательном блоке (или водяной бане) до добавления всех компонентов, немедленно, но аккуратно перемешать и дать затвердеть при однородных температурных условиях. Следует избегать резких температурных градиентов; рекомендуется затвердеть при комнатной температуре (и затвердеть в холодильнике избегать). В долгосрочных экспериментах испарение образца может изменять концентрацию растворённых веществ и свойства конденсата. Чтобы минимизировать испарение, образцы следует правильно герметизировать и по возможности содержать в условиях с контролируемой влажностью.

В отличие от таких методов, как фиксация параформальдегида, агарозное вложение не фиксирует образцы химически. Таким образом, конденсаты остаются динамичными, что выгодно для функциональных исследований, но ограничивает длительное хранение. В течение длительного экспериментального периода необходимо принимать меры предосторожности для предотвращения испарения и изменений буфера, таких как сдвиги pH. Кроме того, хотя агароза обычно маловзаимодействует в этих анализах, следует учитывать возможные косвенные эффекты на диффузию или местную среду. Если подозревают взаимодействия агарозы и биомолекулы, такие как неспецифическое связывание белка с агарозой, можно рассмотреть альтернативные гидрогелевые матрицы, такие как фотосвязанный полиэтиленгликольдиакрилат (PEG-DA) с соответствующим размером и пористостью сетки. Отсутствие взаимодействий следует проверять путём измерения FRAP при наличии и отсутствии матрицы.

Помимо химической фиксации, для уменьшения адгезии и увлажнения конденсата часто применяются стратегии поверхностной пассивации, такие как поверхностные покрытия BSA, PEG или поверхностно-активным веществом, а также поддерживаемые липидные бислои. Хотя эти подходы эффективно минимизируют взаимодействия поверхности, они не предотвращают движение конденсата, осадконакопление или слияние. Таким образом, встраивание агарозы дополняет эти методы, обеспечивая физическую иммобилизацию при сохранении динамики конденсата, что делает его особенно полезным для длительных экспериментов, трёхмерной визуализации и количественных измерений, требующих стабильного позиционирования образца. Выбор метода, таким образом, должен основываться на экспериментальной цели.

В целом, агарозные гидрогели предоставляют простой, но эффективный способ стабилизации конденсатов в трёх измерениях. Это предотвращает смачивание капель и слияние без заметного нарушения измеренных внутренних свойств в протестируемых системах, что позволяет проводить эксперименты с временным ходом и методы, требующие длительного накопления, такие как^{ЯМР-спектроскопия 15}. Хотя этот метод может быть не пригоден для всех систем фазового разделения по ряду причин, представленный здесь метод применим к изучению нескольких биомолекулярных конденсатов и особенно полезен для изучения процессов созревания, связанных с механизмами нейродегенеративных^{заболеваний 17}.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1.5 mL tubes	любая марка подходит	N/A
18-полостные камерные слайды	ibidi	81816	для STORM
агароз, с низкой температурой застывания	Sigma-Aldrich	A9414	для молекулярной биологии
агароз, ультра чистый	Invitrogen	16500500
каналовые слайды	ibidi	80606	для микроскопии
конфокальный микроскоп	Nikon	N/A
Cy5-краситель, NHS-химия	Jena Biosciences	FP-201-CY5	для маркировки белка
D2O (дейтерий оксид)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM буфер	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD белок	N/A	N/A	выраженный рекомбинантным путем в нашей лаборатории, как описано в ссылке 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
нагревательный блок или водяная баня	любая марка подходит	N/A	любой бренд или модель подойдет
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
программное обеспечение для анализа изображений	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
ЯМР спектрометр	Bruker	N/A	750 МГц, PATXI комнатная температура зонд, см. ссылку 13 для получения дополнительной информации (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
ЯМР колба	Bruker	N/A	3 мм, стеклянная
пипетки P10, P20, P200 и P1000	любая марка подходит	N/A
pCp-Cy3-краситель	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	для маркировки РНК
поли(А) РНК	N/A	N/A	транскрибированная in vitro в нашей лаборатории, длина приблизительно 50 нуклеотидов, как описано в Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m РНК	N/A	N/A	транскрибированная in vitro в нашей лаборатории, длина 45 нуклеотидов, последовательность: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', как описано в Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2	N/A	N/A	выраженный рекомбинантным путем в нашей лаборатории, как описано в Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
программное обеспечение для построения графиков (напр. R)	R-Project	Версия 4.2.1	https://www.r-project.org/
микроскоп STORM	Nikon N-STORM	N/A
плагин ThunderSTORM	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
насадки для используемых пипетов	любая марка подходит	N/A
TopSpin	Bruker	Версия 3.2 и 4.1
мочевина	Sigma-Aldrich	U5128