Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Новый метод биопсии с масштабами для сбора злокачественных и незлокачественных лимфоцитов данио-рерио.

144 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72153

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

В этой статье

Краткое содержание

Новый метод масштабной биопсии позволяет собирать клетки острого лимфобластного лейкоза у живых данио-реривов. Результаты показывают обильное количество лимфоцитов в чешуе дикого типа (WT) и резкое увеличение лимфоцитов в чешуе у рыб с АЛЛ (острым лимфобластным лейкозом). Эта техника позволяет проводить минимально инвазивные исследования эпидермальных и злокачественных лимфоцитов.

Аннотация

Данио-рерио (Danio rerio) является мощной моделью для изучения лимфопоэза и лимфоидных раков, поскольку данио-рерио и люди имеют схожую адаптивную иммунную систему, включая B и T-клетки. Описано несколько моделей острого лимфобластного лейкоза D. rerio T-клеток (T-ALL), включая рыб, экспрессирующих лимфобластно-специфический человеческий MYC (hMYC). Мы сообщили, что у рыб rag2:hMYC также развивается острый В-клеточный лимфобластный лейкоз (B-ALL), что делает их полезными для изучения обоих типов ALL. Ограничением ALL моделей данио-рерио является отсутствие нелетальных методов для серийного отбора ALL. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новый метод «масштабной биопсии» для сбора ВСЕХ клеток живых данио-рерио. Однако сведения о том, какие лимфоциты находятся в нормальной чешуе данио, ограничены. Таким образом, для определения нормальной идентичности эпидермальных лимфоцитов мы провели масштабную биопсию трансгенных линий, маркированных лимфоцитами, без rag2:hMYC. Мы использовали традиционную и конфокальную микроскопию для анализа чешуек, выявив обильное количество эпидермальных лимфоцитов. Мы также проанализировали чешуйки рыб с T- и B-ALL, что показало заметное увеличение лимфоцитов в слияющихся слоях клеток ALL во многих чешуях. Далее мы использовали флуоресцентно-активированное сортирование клеток (FACS) для очистки незлокачественных и ВСЕХ лимфоцитов из чешуек для экс виво исследований. Анализ потоковой цитометрии и экспрессии ВСЕХ клеток из чешуек или других тканей той же рыбы показали, что экспрессия гена ВСЕХ клеток чешуйки напоминает экспрессию ВСЕХ клеток в других местах. Мы также количественно оценили количество нормальных клеток T, B, T-ALL и B-ALL, которые можно было очистить по шкале. В целом, масштабная биопсия обеспечивает нелетальную, минимально инвазивную технику изучения эпидермальных лимфоцитов данио-рерио, позволяя экс-виво исследования, включая анализ злокачественных образцов.

Введение

Барьерная функция кожи млекопитающих и её роль в иммунитетеустановлены 1,2,3. Млекопитающие лимфоциты способствуют формированию кожного иммунитета: цитотоксические Т-клетки находятся в эпидермисе, а B, T и натуральные киллеры (NK) присутствуют в дерме 1,3,4,5. У данио-религии есть такие лимфоциты с поверхностными иммуноглобулинами, Т-клеточными рецепторами, рецепторами основного гистосовместимостного комплекса (MHC), цитокиноми и их рецепторами, а также другими иммунными молекулами, что соответствует большинству иммунологических признаковмлекопитающих 6,7,8,9. Недавние исследования кожи и чешуи данио-религии выявили наличие различных кожных популяций лимфоцитов, включая эпителиальные Т- и В-клетки10,11, а также лимфоидную сеть, способствующую трафику Т-клеток и мониторингуантигенов 12. Сходство между лимфоцитами телостных рыб и млекопитающих делает D. rerio мощной in vivo моделью для изучения лимфопоэза, функции лимфоцитов и лимфоидных заболеваний, включая острый лимфобластный лейкоз (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

Наши предыдущие исследования показали, что T- и B-линии ALL (T-ALL, B-ALL) обе возникают у трансгенных данио-рерио-трансгенного rag2:hmyc, что делает эту линию полезной для изучения обоих ВСЕХтипов 13,15,21,22. Основным ограничением моделей D. rerio ALL, особенно в исследованиях продольной экспрессии или лекарственного тестирования, является отсутствие методов сбора серийных образцов ALL у отдельных животных. Предыдущие методы, такие как ретро-орбитальный сбор крови, технически сложны из-за малого размера D. rerio, что затрудняет серийный анализкрови 23. Поэтому большинство исследователей эвтаназируют данио-рерио, чтобы получить ВСЕ клетки. Это была распространённая практика в лабораториях и большинстве специалистов в полевых условиях, но это исключает возможность проведения продольных экспериментов на живых животных. Чтобы преодолеть это, мы недавно описали эпителиальные лимфоциты T и B в чешуе данио-рерио, собранные с помощью стратегии биопсии с нелетальнойчешуйкой 10. Другое недавнее исследование показало резервуар Т-клеток на/рядом с поверхностью данио-рерио, между соседнимичешуями 12. D. rerio содержит сотни чешуй, которые быстро восстанавливаются всего через несколько дней послеудаления 24. В совокупности эти данные и признаки показывают, что чешуя данио-рерио-рерио-рероа является источником лимфоцитов, не требующих эвтаназии, что позволяет проводить продольные исследования у живых рыб.

Здесь мы описываем метод масштабной биопсии для сбора эпидермальных лимфоцитов данио-рыбы у рыб с лимфоцитно-специфическими флуорофорными маркерами, с ALL или без них. Для изучения клеток T-линии мы использовали хорошо известных рыб lck:GFP и аналогичную линию lck:mCherry; обе маркируют T и T-ALLячейки 10,13,15,20. Для изучения клеток линии B мы использовали трансгенные рыбы cd79a:GFP и cd79b:GFP с флуоресцентно маркированными клетками B иB-ALL 10,13,17. Каждая из этих линий позволяет визуализировать их с помощью флуоресцентной микроскопии и очистки цитометрической сортировки клеток13. Мы исследовали чешуйки после биопсии, получили высокоточные изображения лимфоцитов в чешуе, выявили экспрессию генов эпидермальных лимфоцитов с помощью qRT-ПЦР, сравнили её с лимфоцитами других лимфоцитов той же рыбы и количественно оценили количество лимфоцитов на чешую с помощью потокной цитометрии/флуоресцентно-активированной сортировки клеток. В итоге протокол описывает простой и практичный метод получения лимфоцитов из живых данио-рерио, включая продольный отбор отдельных животных в нескольких временных точках экспериментальной последовательности. Этот метод предназначен для изучения биологии лимфоцитов данио-рерио, прогрессирования лейкемии, лекарственных ответов или других продольных экспериментальных проектов, требующих многократного отбора проб отдельных данио-рерио. Мы разработали протокол с использованием взрослой трансгенной данио-рерыбы с флуоресцентно маркированными популяциями лимфоцитов и валидировали его для последующих применений, включая флуоресцентную микроскопию, проточную цитометрию/флуоресцентно-активную сортировку клеток, анализ экспрессии РНК и другие экс-виво исследования, требующие жизнеспособных лимфоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы (протоколы 24-028-EAH и 25-068-EACHIR). Этот протокол предлагает подход к выделению и анализу нормальных и/или злокачественных лимфоцитов из чешуйки живых данио-рерио, с подробностями о цели, исполнении и принципах, лежащих в основе этих процедур.

ВНИМАНИЕ: MS-222 — это опасный химический анестетик, и с ним необходимо обращаться с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), таких как лабораторные перчатки, защита для глаз и лабораторный халат. Утилизация растворов MS-222 в соответствии с институциональными рекомендациями по химическим отходам. Будьте осторожны при обращении с иглами и щипцами, чтобы предотвратить острые травмы. Считать все биологические образцы потенциально биологически опасными и утилизировать отходы в соответствии с институциональными процедурами биобезопасности.

1. Подготовка сортировочных материалов

  1. Добавка 1× раствор RPMI 1640 с 1% плодовой бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: среда RPMI 1640 поддерживает жизнеспособность лимфоцитов ex vivo. RPMI 1640 можно заменить на 0,9× PBS. Сыворотка плода (FBS) обеспечивает факторы роста для повышения жизнеспособности клеток. Пенициллин и стрептомицин ограничивают бактериальное загрязнение.
  2. Аликвот медиа в микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 мл в объёмах 500 мкл, каждая трубка рассчитана на 10–20 масштабов. Поддерживайте сортировочные медиа-трубки на льду.

2. Анестезия данио, флуоресцентная микроскопия и визуализация

  1. Анестезируйте D. rerio буферным метансульфонатом трикана 0,02% (MS-222), приготовленным в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными, используя воду из рыбной системы.
  2. После седации аккуратно поместите рыбу в контейнер для клеточной культуры с достаточной системной водой (плюс 0,02% MS-222) для поддержания влаги при последующем обращении.
  3. Осмотрите и снимите анестезируемых рыб с помощью эпифлуоресцентного микроскопа для обнаружения флуоресценции от трансгена(ов). Этот этап определяет флуоресцентные шкалы для биопсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: линии без флуоресцентных трансгенов можно просматривать с помощью стандартной световой микроскопии.
  4. Используйте флуоресценцию для идентификации Т-клеток (lck:GFP или lck:mCherry fish) или T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP или lck:mCherry fish). Клетки T-линии ярко флуоресцентны в этих линиях; B-ALL ячейки тускло флуоресцентны на фонах lck:GFP и lck:mCherry 13,15,21.
  5. Проводите скрининг по линии B с маркировкой cd79a:GFP или cd79b:GFP рыб (с или без неё) на эпидермальные B-клетки и/или B-ALL, с использованием GFP для выбора чешуек для биопсии.
  6. Практикуйте позиционирование данио-рерио и регулировку настроек микроскопа перед биопсии, если требуется визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения визуализации и биопсии требуется 5–7 минут седации с дозой 0,02% MS-222. Постоянно следите за движением оперкулярных движений. Если движение оперкулярного движения заметно замедляется или прекращается, немедленно переведите рыбу в воду без анестезии и прерывают биопсию. Повторно наносите ~50–100 мкл воды с анестетиками на кожу, оперкулум и жабры каждые 1–2 минуты во время обследования и биопсии, чтобы поддерживать поверхностную влажность.

3. Сбор и подготовка весов

  1. Чтобы разместить рыбу для биопсии, положите её на бок в контейнер для клеточной культуры.
  2. Чтобы предотвратить скольжение рыбы во время биопсии, используйте влажную губку с линейным или V-образным вырезом и поместите её в контейнер для клеточной культуры, чтобы держать рыбу на руках.
  3. В качестве альтернативы убедитесь, что уровень воды в системе едва покрывает дно контейнера для клеточной культуры (достаточно, чтобы сохранить влажность поверхности), чтобы поверхностное натяжение стабилизировало рыбу.
  4. Периодически наносите ~50–100 мкл 0,02% MS-222, приготовленного в системной воде, на оперкулум и жабры для поддержания влажности и поддержания анестезии во время визуализации и биопсии.
  5. Проведите биопсию с использованием эпифлуоресцентной микроскопии для выделения высокофлуоресцентных чешуек, обогащённых лимфоцитами или ВСЕМИ клетками.
  6. Соберите 10–20 соседних чешуек из одной сильно флуоресцентной области, желательно внутри первой или второй горизонтальной пигментной полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно достаточно одной шкалы для визуализации. Коллекция из 10–20 чешуек обычно даёт >1 000 лимфоцитов от рыб WT и рекомендуется для дальнейших анализов, таких как проточная цитометрия и qRT-ПЦР.
  7. Доминантная рука (игла): используйте иглу для шприца 31-го калибра, аккуратно поместите кончик иглы под задний край чешуи и переверните её вперёд (то есть в цефалад). Используйте разные стерильные иголки для каждой рыбы. Чистые щипцы между рыбами; стерилизуйте при необходимости институциональных процедур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поднять весы иглой предпочтительнее, чем использовать только щипцы, так как это поднимает весы и минимизирует соскребание поверхности. Это гарантирует, что нежный эпидермический слой под чешуем остаётся приклеенным к поверхности чешуи, что критически важно для максимизации выхода клетки.
  8. Недоминантная рука (щипцы): держа чешую в перевернутом положении вперёд иглой, захватывая жёсткую внешнюю поверхность чешуи щипцем. Плавным движением вытащить весы из кармана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные кровотечения могут возникать в местах удаления чешуек, которые обычно самоограничены.
  9. Если возникает избыточное кровотечение, приложите мягкое давление щипцами и ненадолго прополосните 0,02% MS-222 в системной воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гемостаз можно достичь за считанные секунды, прежде чем перейти к следующей шкале.
  10. Для биопсии нескольких чешуек берите 10–20 чешуек на рыбу, удаляя соседние чешуйки из смежной области в одной горизонтальной пигментированной полосе, а не из нескольких областей тела или с обеих сторон животного.
  11. Последовательно выщипывайте отдельные чешуйки и удерживайте их на кончиках щипца во время сбора, при этом поверхность медиальной чешуйки направлена вверх.
  12. Чтобы избежать помех накопленных чешуек при дальнейшем удалении чешуек, сначала перевернуть каждую чешую вперёд, а затем захватить её за задний край. После сбора каждых 5 шкал или когда дополнительные чешуи нельзя надёжно удерживать на кончиках щипцов, переносите чешуи в трубку с сортировочным материалом.
  13. После сбора масштабов обрабатывайте образцы как можно быстрее. Немедленно перенесите чешуи из щипца в трубки объёмом 1,5 мл с 500 мкл холодного сортировочного материала на льду для сохранения жизнеспособности клетки. Дезинфицируйте щипцы между рыбами с помощью 70% этанола перед сбором последующих образцов. Обрабатывайте чешую каждой рыбы в отдельных трубках во время сбора, диссоциации и для анализов ниже по течению.
  14. После сбора чешуйки немедленно переместите рыбу в резервуар с пресной системной водой без MS-222.
  15. Следите за движениями оперкулярных операций и поведением в плавании до восстановления нормального дыхания и осанки. Осмотрите место биопсии на наличие постоянного кровотечения или признаков страдания перед возвращением рыбы в рециркуляционную систему.
  16. Верните рыбу в её родной аквариум после восстановления нормального равновесия и плавания.

4. Диссоциация и фильтрация клеток

  1. Проверьте чешуи внизу трубки. Чешуя легко видна невооружённым глазом до диссоциации. Диссоциировать чешуи с помощью стерильного пластикового микротрубочного пестика, применяя мягкое, контролируемое ручное давление в течение 30–60 секунд.
  2. Используйте медленное вращение и движение вверх-вниз для высвобождения эпидермальных клеток, избегая чрезмерного сдвиги чешуек.
  3. Продолжайте диссоциацию, пока распределяющие материалы не станут заметно мутными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешность процедуры подтверждается мутнением среды, что указывает на высокую концентрацию освобождённых клеток в суспензии.
  4. Пропустите гомогенизированные образцы через нейлоновый сетчатый фильтр диаметром 35 мкм для удаления мусора и создания суспензий на одной ячейке для цитометрии потока/флуоресценционной сортировки клеток.
  5. Если после первоначальной фильтрации присутствуют видимые ячеточные агрегаты, пропустите образец через свежий сетчатый фильтр диаметром 35 мкм непосредственно перед цитометрическим анализом потока. Повторяйте фильтрацию не более чем в 2 раза в сумме, чтобы минимизировать потерю клетки.

5. Цитометрический анализ потока

  1. Анализировать образцы с помощью потоковой цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточная цитометрия может быть проведена до очищения клеток, активируемых флуоресценцией, или экстракции РНК для оценки состава образца.
  2. Анализировать одноэлементные суспензии с помощью потокового цитометра, оснащённого лазером 488 нм для обнаружения GFP и лазером 561 нм для обнаружения mCherry.
  3. Исключайте мусор с помощью параметров прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Идентифицировать лимфоциты с помощью описанного ранее лимфоцитноговорота 10,13,21.
  4. Исключать агрегаты ячеек с помощью параметров синглетного гейтинга (то есть SSC-area [SSC-A] против SSC-height [SSC-H]).
  5. Оценивайте жизнеспособность клетки с помощью йодида пропидия (PI) или эквивалентного живого/мёртвого красителя. Исключить PI-положительные клетки из последующих анализов и процедур сортировки.
  6. Установить флуоресцентные элементы с помощью нетрансгенных контролей данио-рерио и одноцветных флуоресцентных трансгенных контролей. Определите GFP-положительные и mCherry-положительные популяции относительно отрицательных контрольных показателей.
  7. Экспортировать стандартные файлы проточной цитометрии (FCS) и анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа потоковой цитометрии.

6. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией,

  1. Для сортировки клеток используйте флуоресцентно-активированную систему сортировки клеток, оснащённую лазерами 488 нм и/или 561 нм для обнаружения GFP и mCherry.
  2. Последовательно «гейт» лимфоциты (FSC/SSC), синглеты (SSC-A против SSC-H) и жизнеспособные клетки (PI-отрицательные) до флуоресцентного сортирования.
  3. Определите популяцииGFP lo,GFP hi и mCherry-положительные с помощью флуоресцентных элементов, полученных из отрицательных контрольных образцов.
  4. Сортируйте популяцииGFP lo,GFP hi и mCherry-положительные популяции в пробирки с охлаждённой сортировочной средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе с линией lck:GFP клетки с высоким GFP (GFP hi) против низкого GFP (GFP lo) — это разные линии лимфоцитов, как описаноранее 10,13,15,21.
  5. Поддерживайте отсортированные образцы на льду и немедленно приступайте к следующим приложениям, таким как изоляция РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя вышеуказанным шагам, мы анестезиировали и проверили взрослых данио-рерио на флуоресцентные лимфоциты или ALL с помощью микроскопии. Рыба дикого типа (WT ) lck:GFP демонстрировала флуоресценцию преимущественно в тимической области, тогда как рыба cd79b:GFP демонстрировала флуоресценцию в области головы/жабер, что соответствует предыдущим наблюдениям10 (рисунок 1A, слева). В отличие от этого, двойные трансгенные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает нелетальный метод биопсии чешуек для сбора эпидермальных лимфоцитов данио-рерио, включая как незлокачественные лимфоциты, так и клетки острого лимфобластного лейкоза (ALL). Данио-рерио — хорошо зарекомендованные модели лимфопоэза и лимфоидных злокачественных опухолей, но большинство методов получения лимфоцитов требуют эвтаназии и рассечения тканей, что предотвращает продольные исследования отдельных животных

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет финансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Мы благодарим Амиру Хасан, M.B.B.S., Ph.D., и Браше Вуда за их вклад в этот проект. Исследования были поддержаны пилотной грантовой программой Центра рака Стивенсона OUHSC, Центром исследований стволовых клеток взрослых Оклахомы (OCASCR), научными и грантовыми грантами Фонда здравоохранения Пресвитерианского университета, а также Фондом семьи В. Дж. Джонса. FACS от Центра молекулярной биологии и цитометрии OUHSC Stephenson Cancer Center был профинансирован грантом поддержки NCI Cancer Center Support Grant P30 CA225520. Это исследование было частично поддержано средствами Американского онкологического общества (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Иман Оуэнс — стипендиат программы «STRONG» после бакалавриата ACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реактивы и расходные материалы:
Трикаин метилсульфонат (MS-222)Sigma-AldrichE10521Анестезирующее средство
Среда RPMI 1640ThermoFisher11875093Среда для жизнеспособности лимфоцитов
Фетальный сывороточный белок бычьего сывороточного белкаSigma-AldrichF2442Для жизнеспособности клеток
Пенициллин-стрептомицинThermoFisher15140122Ограничение бактериальной контаминации
70% этанолThermoScientificT038181000Для стерилизации щипцов
CellPro 1x PBSVWR104027-280Разбавить до 0.9x стерильной водой
Пропидий йодидInvitrogenP1304MMPДискриминация живых/мёртвых клеток для флоу/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Размер: 12 x 12 ДЮЙМ. 35 мкм фильтровальная бумага
Lab Pak 03-35/16		SefarДля сортирования клеток
Ссылка: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Изоляция злокачественных и незлокачественных В-клеток из линий рыб льва-зебры lck:Egfp. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Альтернатива для фильтровальной бумаги: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Для сортирования клеток
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1.5 млEppendorf®20901-551микроцентрифужная пробирка для сортирования клеток
УльтиКэр ВетРх U-100 Инсулиновые шприцы 3/10cc 31G x 5/16" Полу-единицы маркировкиУльтиКэр9436Для биопсий чешуи
Глубокая чаша Петри 100 x 25 ммUSA Scientific8609-0625Для биопсий чешуи
Одноразовые стамески Bel-Art®Bel-Art®BAF199230001Для диссоциации чешуи
Набор пинцетов E-Z Pik 6-PieceAven18480EZДля биопсий чешуи
Микрологический стеклянный предметный столик Corning®, одна сторона матовая, один конецSigma-AldrichCLS294875X25Для визуализации
Покрывальные стеклаSigma-AldrichC8181Для визуализации
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, с DAPIThermoFisherS36920Для монтирования чешуи на слайде
RNeasy Mini KitQiagen74104Для извлечения РНК
Оборудование:
Микроскоп Nikon AZ100 и камера DS-Qi1MCNikonФлуоресцентный микроскоп и камера
CFX96 Touch-PCR SystemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterАнализ цитометрии потока
Leica SP8LeicaКонфокальный микроскоп
Программное обеспечение:
Программное обеспечение для анализа Kaluza версии 2.1Beckman-CoulterАнализ цитометрии потока
Ссылка: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
Программное обеспечение LAS-X версии 3.7.4.23463LeicaКонфокальный микроскоп
Ссылка: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Ссылки

  1. Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
  2. Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
  3. Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
  4. Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
  5. Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
  6. Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
  7. Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
  8. Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
  9. Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
  10. Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
  11. Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
  12. Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
  13. Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
  14. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
  15. Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
  16. Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
  17. Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
  18. Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
  19. Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
  20. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
  21. Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
  22. Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
  23. Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
  24. Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
  25. Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

234234
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.