Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Обзорная статья
В данном обзоре оценивается использование Caenorhabditis elegans в качестве дополнительной модели in vivo для исследования онкогенных путей, с особым вниманием к консервативным сигнальным путям RTK-RAS-ERK, Notch и Wnt, репрезентативным мутантам, количественным показателям, генетическим инструментам, скринингу противоопухолевых препаратов и применению методов, основанных на хемосенсорике.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) представляет собой генетически доступную, прозрачную и экономически эффективную многоклеточную модель, которая служит связующим звеном между традиционными анализами на клеточных культурах и млекопитающими системами для изучения механизмов развития рака. Данный обзор, сфокусированный на сигнальных путях, охватывает репрезентативные исследования консервативных путей RAS/MAPK, Notch и Wnt и структурирован по принципам консервативности путей, мутантным штаммам, количественным фенотипам, генетическим инструментам, а также применению в исследованиях механизмов, скрининге соединений и анализах на основе хемосенсорики. Сначала мы описываем консервативность компонентов путей и релевантные опухолям фенотипы, включая гиперпролиферацию зародышевой линии и фенотип «множественной вульвы» (Muv). Затем мы приводим перечень репрезентативных мутантов, таких как штаммы glp-1 и let-60 с усилением функции (gain-of-function) и модели gld-1 и lip-1 с потерей функции (loss-of-function), которые позволяют анализировать поддержание стволовых клеток, эктопическую пролиферацию и нарушение регуляции сигналинга. Кроме того, мы обсуждаем доступные инструменты для создания моделей, включая РНК-интерференцию, трансгенез, MosTIC, TALENs и CRISPR/Cas9, выделяя их преимущества и ограничения при изучении функций генов, связанных с раком. В заключение мы обобщаем опубликованные данные о применении C. elegans в скрининге противоопухолевых препаратов, поиске новых сигнальных путей и изучении опухолево-ассоциированной хемосенсорики. Интегрируя генетическую консервативность с масштабируемым фенотипированием in vivo, C. elegans предоставляет дополнительную платформу для выдвижения гипотез, валидации путей и раннего поиска терапевтических средств, при этом следует учитывать ограничения модели в отношении адаптивного иммунитета и сложности органов при переносе полученных результатов на биологию рака у человека.
Рак остается одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Согласно данным GLOBOCAN 2022, во всем мире было зарегистрировано почти 20 миллионов новых случаев рака и 9,7 миллионов смертей от этого заболевания, включая немеланомный рак кожи1. Поскольку прогнозируется рост заболеваемости раком в связи с ростом и старением населения2, экспериментальные системы, способные выявить консервативные механизмы и обеспечить эффективный приоритет мишеней, остаются крайне необходимыми.
Механизмы развития рака обычно исследуют на культурах клеток с последующим тестированием на моделях позвоночных. Однако культура клеток не воспроизводит физиологию всего организма, в то время как исследования на позвоночных дорогостоящи и характеризуются сравнительно низкой пропускной способностью. Таким образом, комплементарная модель, сочетающая в себе возможность генетических манипуляций, многоклеточный контекст и высокую скорость проведения экспериментов, может помочь в решении определенных вопросов при переходе от анализов in vitro к валидации на млекопитающих.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) занимает эту дополняющую нишу. При 20 °C он развивается от эмбриона до половозрелого взрослого примерно за 3 дня, имеет типичную лабораторную продолжительность жизни 2–3 недели и производит около 300 самооплодотворяемого потомства3. ОртоЛист 2 идентифицировал ортологи C. elegans для 10 678 из 20 310 белок-кодирующих генов человека (52,6%)4, в то время как более ранний сравнительный протеомный анализ выявил гомологи человека примерно для 83% протеома C. elegans5. Кроме того, примерно 72% курируемых драйверных генов рака человека имеют как минимум один ортолог у C. elegans6. Консервативные процессы включают апоптоз, контроль клеточного цикла, метаболизм, стрессовые ответы, а также сигналинг RTK–RAS–ERK, Notch, Wnt, TGF-β и инсулина/IGF3,4,6. Тем не менее, ортология не подразумевает полной функциональной эквивалентности, и этому червю не хватает органов позвоночных, адаптивного иммунитета, ангиогенеза и кровеносной системы6.
Данный обзор сосредоточен на сигнальных путях RTK (рецепторной тирозинкиназы)–RAS–ERK, Notch и Wnt, так как эти пути эволюционно консервативны, часто нарушены при раке у человека и связаны с легко оцениваемыми фенотипами C. elegans. Мы разграничиваем истинные опухоли зародышевой линии и фенотипы гиперплазии развития или эктопической дифференцировки клеток, приводим перечень репрезентативных штаммов и количественных показателей, рассматриваем генетические инструменты для создания моделей и обсуждаем исследования, в которых эксперименты на червях позволили прояснить антираковые механизмы или приоритизировать поиск соединений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Консервативность онкогенных сигнальных путей у C. elegans
Развитие рака обусловлено сочетанием генетических и эпигенетических изменений, которые нарушают пролиферацию, дифференцировку, выживаемость, поддержание целостности генома, метаболизм и взаимодействия с микроокружением. C. elegans не может воспроизвести все особенности злокачественных новообразований человека, однако на этой модели можно изолированно изучать функции консервативных путей в контексте всего организма. Таким образом, наиболее информативными являются модели, в которых определенное молекулярное повреждение сочетается с измеряемым фенотипом и четко сформулированной аналогией с раком у человека.
Сигналинг RTK-RAS-ERK
Активация рецепторных тирозинкиназ (RTK) способствует димеризации или перестройке рецепторов и транс-автофосфорилированию цитоплазматических остатков тирозина7. Сайты связывания фосфотирозина привлекают адапторные белки и факторы обмена гуаниновых нуклеотидов, которые переводят RAS из GDP-связанного в GTP-связанное состояние7,8. RAS-GTP привлекает RAF-киназы к плазматической мембране, где активация RAF инициирует киназный каскад RAF–MEK–ERK8,9. Активированный ERK фосфорилирует цитоплазматические и ядерные субстраты, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку, выживаемость и судьбу клетки10. Таким образом, онкогенные мутации RAS или аберрантная активность RTK могут поддерживать работу этого пути независимо от нормального внеклеточного контроля8,11.
C. elegans кодирует несколько RTK, включая LET-23/EGFR и EGL-15/FGFR12. Во время индукции вульвы LIN-3/EGF активирует LET-23 и консервативный каскад SEM-5/GRB2–SOS-1–LET-60/RAS–LIN-45/RAF–MEK-2–MPK-1/ERK12,13,14. ERK-зависимая регуляция LIN-1 и LIN-31 определяет судьбу клеток-предшественников вульвы12,15. Снижение активности этого пути приводит к фенотипу отсутствия вульвы, тогда как избыточная активация — например, при наличии аллелей let-60 с приобретением функции — вызывает фенотип множественной вульвы (Muv)15,16. Этот же путь регулирует развитие выделительного протока, связи между маткой и вульвой, а также несколько процессов в мужских половых клетках и зародышевой линии12,17,18,19. Сигналинг EGL-15/FGFR контролирует миграцию половых миобластов, поддержание мышц, наведение аксонов и жидкостный гомеостаз20,21,22,23. Поскольку результат работы сигнального пути зависит от ткани и стадии развития, информативные модели, связанные с раком, определяются конкретным молекулярным повреждением, соответствующим тканевым контекстом и количественным показателем12.
Сигналинг Notch
Notch представляет собой контактно-зависимый сигнальный путь, при котором мембранно-связанный лиганд Delta/Serrate/LAG-2 (DSL) одной клетки активирует рецептор Notch на соседней клетке24,25. В процессе созревания рецептора в секреторном пути происходит расщепление по сайту S124. Связывание лиганда делает сайт S2 доступным для протеаз семейства ADAM, после чего следует расщепление по сайту S3 γ-секретазой24,25. Высвобожденный внутриклеточный домен Notch проникает в ядро и образует транскрипционный комплекс с ДНК-связывающими белками семейства CSL и коактиваторами семейства Mastermind24. У C. elegans соответствующими ядерными факторами являются LAG-1 и SEL-825.
C. elegans имеет два рецептора Notch: LIN-12 и GLP-125. В зародышевой линии взрослых особей клетки дистального кончика (DTC) предоставляют DSL-лиганды, главным образом LAG-2 и APX-1, рецептору GLP-1 на соседних стволовых клетках-предшественниках зародышевой линии (GSCs)26,27. Высокая активность GLP-1 поддерживает митотическую пролиферацию; по мере удаления клеток от DTC снижение Notch-сигналинга позволяет путям GLD стимулировать вступление в мейоз28,29. Аллели glp-1 с приобретением функции могут поддерживать эктопический митоз и приводить к образованию опухолей зародышевой линии25,30. LIN-12 контролирует несколько решений о судьбе соматических клеток, включая выбор между якорной клеткой и вентральной клеткой матки; конститутивная активность LIN-12 в клетках-предшественниках вульвы приводит к фенотипу многовульвности (Muv), а активированный GLP-1 может эктопически определять судьбу клеток вульвы25,31,32.
Проксимальные опухоли зародышевой линии также могут возникать посредством неклеточного автономного механизма «латентной ниши»33. У мутантов по гену pro-1 или мутантов с усилением функции glp-1(ar202) задержка вступления в мейоз позволяет недифференцированным проксимальным зародышевым клеткам взаимодействовать с DSL-лигандами, включая APX-1 и ARG-1, секретируемыми созревающими клетками гонадного чехла33. Последующая непрерывная активация GLP-1/Notch поддерживает митоз и развитие опухоли33. Напротив, потеря gld-1 вызывает появление опухолей зародышевой линии вследствие нарушения мейотической дифференцировки и не должна классифицироваться как прямая активация сигнального пути Notch34.
Wnt-сигналинг
Wnt-сигналинг регулирует судьбу клеток, их полярность, миграцию и пролиферацию через несколько контекстно-зависимых ветвей35,36. В каноническом β-catenin-пути связывание Wnt с Frizzled и LRP5/6 ингибирует деструкционный комплекс AXIN–APC–GSK3–CK1, что позволяет β-catenin накапливаться и взаимодействовать с факторами TCF/LEF в ядре35,36. Нарушение регуляции этого пути играет центральную роль при развитии нескольких видов рака у человека, в частности, колоректального рака36.
C. elegans использует как канонический путь BAR-1/β-catenin, так и дивергентный путь асимметрии Wnt/β-catenin37,38. Сигнализация, зависимая от BAR-1, способствует принятию решений о судьбе клеток в постэмбриональный период, включая развитие вульвы37,38. В пути асимметрии WRM-1/β-catenin и LIT-1/NLK снижают уровень ядерного POP-1/TCF в одной дочерней клетке, в то время как SYS-1/β-catenin действует как транскрипционный коактиватор; неодинаковые уровни POP-1 и SYS-1 определяют разные судьбы дочерних клеток37,38,39. Эти специфичные для червей особенности отличаются от канонического пути Wnt млекопитающих и должны интерпретироваться как отдельные архитектуры сигнализации37,38.
Неканоническая Wnt-сигнализация контролирует полярность и миграцию клеток через Frizzled-зависимые пути и пути, подобные рецепторным тирозинкиназам35,40. У C. elegans Wnt-лиганды и рецепторы направляют миграцию нейронов и мезодермы, а также определяют ориентацию асимметричного деления37,41. Эти показатели имеют значение для биологии рака, поскольку изменение полярности и подвижности являются необходимыми условиями для инвазии, хотя червь и не является моделью самого метастатического распространения36,37.
Типичные фенотипы пути Wnt включают дефекты развития вульвы у животных с потерей функции bar-142, дефекты эмбриональной полярности у мутантов по mom-2 или mom-537,43, а также дефекты миграции клеток или наведения аксонов у мутантов по mig-1 или prkl-137,41. Данные штаммы являются специфичными для этого пути моделями развития и не являются прямыми эквивалентами злокачественных опухолей36,37.
Выбор фенотипов и показателей анализа, релевантных для рака
Термин «опухоль» следует использовать с осторожностью в C. elegans модели, связанные с раком6. C. elegans опухоли зародышевого пути содержат эктопически пролиферирующие герминативные клетки с дефектами дифференцировки и, следовательно, представляют собой наиболее близкий аналог неопластического разрастания у червя30,34,44Напротив, фенотип многовульвы (Muv) отражает эктопическую индукцию судьбы клеток вульвы и разрастание тканей; он является чувствительным индикатором активности путей RAS/MAPK или Notch, но не представляет собой злокачественную опухоль.15,16,25В дистальной части зародышевой линии Notch-сигнализация, исходящая от клеток дистального кончика (DTC), поддерживает пул митотических предшественников.28,44Приобретение функции (gain-of-function) ГПП-1 аллели или дефекты в генах меиотической дифференцировки, таких как gld-1 могут экспансировать митотические зародышевые клетки30,34,44В клетках-предшественниках вульвы, let-60активация функции RAS или снижение активности негативных регуляторов, таких как LIP-1, могут вызывать или усиливать фенотипы Muv15,16,45Эти категории фенотипов схематично представлены на Рисунок 1. Рисунок 1A показывает нормальный анатомический контекст и базовые показатели, используемые в C. elegans анализы, связанные с раком. Рисунок 1D связывает LIN-3/LET-23-зависимый сигнальный путь RAS/MAPK с решениями о судьбе клеток-предшественников вульвы, в то время как Рисунок 1E иллюстрирует сигнальные пути GLP-1/Notch в дистальной нише стволовых клеток зародышевой линии и механизмы опухолей в латентной нише. Рисунок 1F дополнительно отделяет BAR-1-зависимую каноническую ветвь Wnt от пути асимметрии Wnt/β-катенин, подчеркивая, что показатели, связанные с Wnt, в C. elegans следует интерпретировать как фенотипы, чувствительные к развитию или сигнальным путям, а не как прямые модели злокачественных опухолей. Рекомендуемые количественные конечные точки включают процент животных с фенотипом Muv, количество эктопических выступов вульвы, длину митотической зоны, число половых клеток, положительных по фосфо-гистону H3, площадь гонад, фертильность, локализацию репортера и зависимости «доза-ответ»15,28,30,44,45. Таблица 1 в документе представлены репрезентативные штаммы, их молекулярные повреждения, фенотипы, количественные анализы и области применения в исследованиях рака.
Генетические и экспериментальные инструменты
Модели C. elegans могут быть созданы с помощью классического мутагенеза, трансгенеза, РНК-интерференции (RNAi) или направленного редактирования генома46,47,48. Микроинъекции в гонады позволяют эффективно создавать внехромосомные массивы46, в то время как облучение, бомбардировка микрочастицами и системы вставки одной копии позволяют получать интегрированные или низкокопийные трансгенные линии, что снижает количество артефактов, связанных с числом копий и мозаицизмом47,48. Сайт-специфические рекомбиназы, вставка одной копии с помощью Mos1, цинковые пальцевые нуклеазы, TALEN и, в особенности, CRISPR/Cas9 позволяют осуществлять направленные делеции, точковые мутации, эндогенное мечение, создание условных аллелей и гуманизированных вариантов48,49. Метод следует выбирать исходя из того, требуется ли в исследовании транзиторный нокдаун, стабильная потеря функции, приобретение функции, тканеспецифичность, эндогенная экспрессия или замена на вариант, характерный для рака человека48,49.
РНК-интерференция (RNAi) может быть осуществлена путем гонадной инъекции, замачивания или скармливания бактерий, экспрессирующих двухцепочечную РНК50. Этот метод является быстрым и масштабируемым, однако эффективность нокдауна варьирует в зависимости от тканей и генов, а RNAi создает фенокопию, а не определенный наследуемый аллель50. Для исследований соединений валидация модели должна включать генетический рескью (спасение) или эпистаз, использование независимых аллелей и ортогональные методы считывания, чтобы отличить специфические для сигнального пути эффекты от токсичности, задержки развития или снижения потребления пищи6,44.
Практический рабочий процесс применения этих моделей обобщен на Рисунке 2. В рамках данной схемы вопрос, связанный с раком, сначала сопоставляется с консервативным сигнальным путем и определенным молекулярным повреждением, после чего выбираются подходящий штамм C. elegans или модифицированная модель, количественный фенотип и контроли валидации. Такой поэтапный дизайн помогает отличить специфическую модуляцию пути от общей токсичности или задержки развития и обеспечивает рациональную основу для последующего применения в исследованиях механизмов, приоритизации соединений или в анализах, основанных на хемосенсорике.
Предыдущие исследования
Опубликованные работы демонстрируют, как модели C. elegans с определенными сигнальными путями могут быть использованы для приоритезации соединений на ранних этапах. В платформе EGFR, специфичной для конкретных мутаций, Bae и др. экспрессировали в клетках вульвы химерные рецепторы LET-23, содержащие тирозинкиназный домен человеческого EGFR, включая варианты дикого типа, L858R и T790M/L858R. Активирующие химеры L858R и T790M/L858R вызывали фенотип многовульварности (Muv), что позволило использовать процент животных с Muv-фенотипом в качестве количественного показателя скрининга. Гефитиниб и эрлотиниб подавляли Muv-фенотип, связанный с L858R, но не фенотип, связанный с T790M/L858R. В ходе предварительного скрининга 8 960 малых молекул AG1478 и U0126 были идентифицированы как ингибиторы EGFR- и MEK-зависимой сигнализации соответственно51. Medina и др. дополнительно оценили кандидатов для перепрофилирования — итраконазол, дисульфирам, этодолак и уабаин — на мутантных штаммах с определенными путями, представляющих нарушения Wnt, Notch и RAS–ERK. В качестве фенотипического конечного показателя для приоритезации соединений использовалось восстановление при стерильности, бесплодии или Muv-фенотипе52. Совсем недавно Makhoul и др. протестировали EAPB02303 на животных MT2124 let-60(n1046gf) и MT4698 let-60(n1700gf). Они количественно оценили как долю животных с Muv-фенотипом, так и количество эктопических вульв на одно животное и наблюдали фенотипическое подавление, соответствующее снижению активности пути LET-60/RAS–MAPK. Их дополнительные эксперименты по продолжительности жизни и локализации DAF-16 также подтвердили влияние на сигнализацию инсулин/IGF-1–PI3K–AKT53. Тем не менее, фенотипическое восстановление в этих моделях на червях следует интерпретировать как свидетельство модуляции сигнального пути и основание для приоритезации соединений на раннем этапе, а не как прямое доказательство противоопухолевой эффективности в опухолях млекопитающих.
Модели опухолей зародышевой линии позволяют разграничить механистически различные пути устойчивой пролиферации. Аллели glp-1 с приобретением функции поддерживают GLP-1/Notch-зависимый митоз в зародышевой линии, в то время как мутанты pro-1 демонстрируют неоцеллюлярный механизм латентной ниши, при котором лиганды DSL проксимальных обкладочных клеток поддерживают аберрантное сохранение митоза. Напротив, потеря функции gld-1 вызывает образование опухоли зародышевой линии преимущественно за счет дефектной мейотической дифференцировки, а не через прямую активацию пути Notch. Таким образом, эти модели представляют собой взаимодополняющие системы для изучения поддержания стволовых клеток, нарушений дифференцировки и инициации опухолей, зависящей от микроокружения30,33,34.
Другие приложения, связанные с раком, включают скрининги синтетической летальности LIN-35/Rb, анализы CEP-1/p53-зависимого апоптоза, а также исследования сигнализации AMPK и PI3K6,44. Приложения, основанные на хемосенсорике, следует рассматривать отдельно от моделирования опухолей и скрининга лекарственных средств. В этих исследованиях C. elegans подвергаются воздействию летучих или мочевых метаболитов, связанных с раком, а поведенческие реакции измеряются в качестве потенциальных диагностических сигналов. Такие анализы не моделируют рост опухоли или активность противоопухолевых препаратов и требуют аналитической и клинической валидации перед внедрением в диагностику54,55.
Перспективы
C. elegans наиболее ценен в тех случаях, когда биологический вопрос зависит от консервативных клеточно-автономных или системных механизмов, которые могут быть связаны с количественным фенотипом. Его ограничения, включая отсутствие адаптивного иммунитета, сосудов, органоспецифических эпителиев и естественного метастазирования, исключают прямое моделирование многих взаимодействий между опухолью, стромой и иммунной системой. Будущие возможности включают эндогенное редактирование вариантов, полученных от пациентов, тканеспецифическое воздействие, высококонтентную визуализацию, автоматизированное фенотипирование и интеграцию генетики червей с геномикой рака человека. Полученные результаты следует рассматривать как доказательства для выявления механизмов или мишеней и проверять на клетках млекопитающих или моделях позвоночных, прежде чем делать трансляционные выводы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
C. elegans представляет собой взаимодополняющую, генетически доступную систему in vivo для анализа консервативных сигнальных путей, связанных с раком, и приоритизации потенциальных мишеней или соединений. Наиболее информативные области ее применения напрямую связывают изменения при раке человека с консервативным ортологом у червя, контекстом ткани и количественными фенотипами, такими как гиперпролиферация зародышевой линии, формирование множественной вульвы (multivulva), активность репортера или ответ ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мы благодарим Центр генетики Caenorhabditis, финансируемый Управлением программ инфраструктуры исследований NIH (P40 OD010440), за предоставление информации о штаммах и ресурсов. Данная работа была поддержана Научным фондом Бюро здравоохранения провинции Чжэцзян (№ 2025KY1608).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.