В этом видео, мы показываем, как этикетка человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) с хлористого марганца (MnCl 2), Который может проникать в клетки с помощью напряжения закрытого кальциевых каналов, когда клетки являются биологически активными. Кроме того, мы покажем использование MnCl 2 Как сотовые МРТ контрастное вещество, чтобы определить жизнеспособность в пробирке из чЭСК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В пробирке Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток для магнитно-резонансная томография
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человека эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) продемонстрировали возможность восстановления ранения миокарда. Магнитно-резонансная томография (МРТ) стала одной из преобладающих форм изображений в целях оценки восстановления ранения миокарда. Кроме того, экс-маркировки естественных агентов, таких как железо-оксидных наночастиц, были использованы для отслеживания и локализации пересаженных стволовых клеток. Однако этот метод не контролирует основных клеточных собственности биологии относительно жизнеспособности пересаженных клеток. Было известно, что хлористого марганца (MnCl 2) входит в клетки с помощью напряжения закрытого кальция (Са 2 +) каналов, когда клетки являются биологически активными и накапливаются внутриклеточно генерировать T 1 сокращения эффекта. Таким образом, мы предполагаем, что марганец наведением МРТ может быть полезно для контроля жизнеспособности клеток после трансплантации чЭСК в миокарде.
В этом видеоролике мы покажем, как на этикетке чЭСК с MnCl 2 и как эти клетки могут быть хорошо видны с помощью МРТ в пробирке. В то же время, биологическая активность Са 2 +-каналов будет модулированного использованием как Са 2 +-канала агонистов и антагонистов для оценки сопутствующих изменений сигнала.
Протокол
Марганец Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
- Trypsinize человеческих эмбриональных стебли, которые были культивировали в фидерных свободных условиях в течение 5 минут. Нейтрализовать трипсина путем добавления питательных сред.
- Спином вниз клетки центрифугированием при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 20 ° по Цельсию. После повторного приостановления осадок клеток, подсчет числа клеток трипанового синего окрашивания. На основе клеток получены, делятся клетки на четыре порции 3 млн. клеток в конических труб. Гранул клетки снова с помощью центрифугирования.
- Просто перед началом марганца маркировки, растворить свежий хлористого марганца с 0,9% раствор натрия хлорида, чтобы сделать 0.1мм марганца раствор хлорида.
- Для того чтобы наблюдать активность кальциевых каналов, четыре образца были готовы. Первая проба нашего контроля, которая содержит клетки инкубировали в 0,9% хлорида натрия в одиночку. Второй образец содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2. Пример 3 и 4 содержат клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2 или с 5 мкМ Са 2 +-канала агониста, (S )-(-)- Bay K8644, или 250 мкМ Са 2 +-канала антагонист, верапамил. Инкубируйте четырех образцов при температуре 37 ° по Цельсию с 5% CO 2 в течение 30 минут.
- Через 30 минут спином вниз клетки при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 20 ° по Цельсию. Затем аспирата супернатант и мыть меченых клеток в два раза с PBS. После мытья, вновь приостановить каждая гранула 200 мкл PBS и передачи в пробирки ПЦР. Эти гранулы, как правило, белого цвета.
Железный Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
- Смешайте клинико-класса протаминсульфат с дистиллированной водой, чтобы получить 1 мг / мл маточного раствора.
- В пробирку человеческих эмбриональных стволовых клеток медиа культуры, добавьте ferumoxides на уровне 100 мкг / мл с последующим добавлением 12 мкг / мл протамина сульфата. Смешайте раствор энергично в течение пяти минут.
- Добавить смешанные решения равное количество средств массовой информации клеточной культуры для достижения конечной концентрации 50 мкг / мл ferumoxides и 6 мкг / мл протамина сульфата на этикетке клеток. Инкубируйте клетки в этом растворе в течение 12 часов.
- Вымойте клетки дважды с PBS, с последним мыть содержащие гепарин 10U/ml распустить внеклеточной ferumoxides-протамина сульфат комплекса. После мытья trypsinize клетки для получения суспензии отдельных клеток.
- Граф клетки и аликвоты на необходимое количество образцов. После мытья, вновь приостановить каждая гранула 200 мкл PBS и передачи в пробирки ПЦР. Эти гранулы должны быть темно-оранжевого коричневого цвета.
Выполнение Сотовая Магнитно-резонансная томография
- Сделать фантом в целях стабилизации пробирки, содержащие ячейки гранул, а также, чтобы избежать артефактов из окружающего воздуха во время сканирования. Для этого смешайте 0,8% агара и 1% медного купороса в дистиллированной воде и довести его до кипения от микроволновой печи в течение 5-7 минут. Прохладный эта смесь, по крайней мере за 1 час до сканирования для достижения гель.
- Пробирки, содержащие гранулы помечены ячейки помещаются в фантом для сканирования. В пробирке сотовой МРТ проводится при Signa HDx 3Т МРТ (GE Medical Systems) с помощью клинических катушки колена.
- Сканирование марганца меченых клеток для каждого из трех образцов с помощью последовательности спинового эха: TR; Повторение времени = 800 мсек. TE; Эхо время = минимум, FOV; поле зрения = 12 х 12 см; матрица = 256x256, NEX 1.
- Сканирование железа меченых клеток, используя градиент-эхо последовательность. Мы используем следующие параметры для этого изображения: TR = 100 мсек, TE = 10 мсек, ФА; флип угол = 30 °; FOV = 12 х 12 см; матрица = 256 х 256, NEX 1.
Анализ результатов МРТ
- Анализ изображений МРТ с 4 различных образцов марганец-меченых клеток:
- Пример № 1 нашего контроля, которая содержит клетки инкубировали в 0,9% хлорида натрия в одиночку.
- Образец № 2 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2.
- Пример № 3 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2 с 5 мкМ Са 2 +-канала агониста, (S )-(-)- Bay K8644.
- Пример № 4 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2 с 250 мкМ Са 2 +-канала антагонист, верапамил.
- Как и ожидалось, различия в интенсивности сигнала от марганца меченых клеток видны. По сравнению с клетками меченого чисто с марганцем, интенсивность сигнала заметно увеличивается в присутствии агониста кальциевых каналов и уменьшается в присутствии антагониста кальция канал. Области, где интенсивность сигнала возросла на марганец меченых клеток измеряются с помощью изображения J (NIH, Bethesda, MD, США). То же самое программное обеспечение используется для анализа области темных вне резонансного сигнала от железа меченых клеток. Размер темно сигнал от железа меченых клеток зависит от количества клеток или число частиц железа, содержащиеся клетками. В этом случае, Один миллион клеток показывает меньшую площадь темного сигнала по сравнению с сигналом от трех миллионов клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эти результаты показывают, что марганец делает войти через напряжения закрытого кальциевых каналов, и марганца может быть использован как МРТ контрастное вещество, которое может также показать жизнеспособность клеток. Таким образом, мы предполагаем, что марганец наведением МРТ может быть полезно для контроля жизнеспособности клеток после трансплантации человеческих эмбриональных стволовых клеток в миокард.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Тетрагидрат хлорида марганца | Реагент | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Реагент | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Верапамила гидрохлорид, титрование минимум 99,0% | Реагент | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Хлорид натрия 0,85-0,90% m/v | Реагент | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Реагент | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | раствор для инъекций феррумоксида 11,2 mg железа/mL |
| Протамина сульфат | Реагент | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (заменитель сыворотки для ЭСК) | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2-меркапто–этанол 98+% | Реагент | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-глутамин 200mM 100x | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Пенициллин-стрептомицин 10 000 ед/ml | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM, раствор незаменимых аминокислот 100x | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T МРТ | Оборудование | GE Healthcare | ||
| клиническая катушка для коленного сустава | Оборудование | GE Healthcare | ||
| DPBS | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
Ссылки
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
