Методическая статья

Использование лазерный пинцет для манипуляций Изолированные нейроны In Vitro

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/911

⸱

11 сентября 2008 г.

 ,  , 
1Department of Neurology and Neuroscience, School of Medicine, University of Medicine and Dentistry of New Jersey - UMDNJ

В этой статье

Краткое содержание

Это видео описывает манипуляции культурный нейронов помощью лазерного пинцета в пробирке.

Аннотация

В данной работе и видео, мы описываем протоколов, используемых в нашей лаборатории для изучения ориентации предпочтения регенерации клеточных процессов взрослых нейронов сетчатки в пробирке. Порядок подготовки сетчатки клеточных культурах начинается с рассечение, пищеварения и растирания сетчатки, а в конце покрытия изолированных клеток сетчатки на блюда, приготовленные специально для использования с лазерным пинцетом. Эти блюда делятся на половину ячейки клей с половиной ячейки репеллент. Стороны ячейки клей покрыта слоем Сал-1 антител, которые обеспечивают подложки, на которой наши клетки расти. Другие клей подложки могут быть использованы для других типов клеток. Стороны ячейки репеллент покрыта тонким слоем поли-НЕМА. Клетки высевали на поли-НЕМА стороне блюда оказались в ловушке с лазерным пинцетом, транспортировались и затем помещается рядом с ячейкой на Сал-1 стороной для создания пары. Формирование группы клеток любого размера должно быть возможным с этой техникой. "Лазерный пинцет контролируемых микроманипуляция" означает, что исследователь может выбрать, какие клетки необходимо переместить, и необходимое расстояние между клетками может быть стандартизирована. Поскольку лазерный луч проходит через прозрачную поверхность культуры блюдо, выбора ячейки и размещение делается в закрытых, стерильной среде. Клетки могут контролироваться с помощью видео покадровой и использовать с любой клетки биологических техники требуется. Эта техника может помочь исследование межклеточных взаимодействий.

Протокол

Оптический пинцет для манипуляций изолированных клеток в культуре

Захват силами оптического пинцета создаются из импульсов света (Ашкина, 1991;. Ашкина и др., 1986). Хотя эти силы легко ловушку клеток в суспензии, они не в состоянии двигаться клеток, которые придерживаются поверхности. Поэтому, чтобы уменьшить адгезию к культуре блюдо в точке, где клетки оказались в ловушке, покровное покрыта поли-2-гидроксиэтилметакрилата (поли-НЕМА) (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури), нетоксичные соединения с сотовыми репелленты свойствами ранее для адгезии исследования на эндотелиальных клетках (Фолькмана и Moscona, 1978). Хотя поли-НЕМА охватывает половину культуры блюдо, другая половина покрыта подложкой, что поддерживает рост клеток. В нашей лаборатории, Сал-1 используется в качестве подложки для культивирования клеток сетчатки саламандры. Процедура изготовления Сал-1 и поли-НЕМА покрытием блюд, описанных ниже:

Изготовление культуры блюда

  1. Чистая coverglasses (# 1 VWR Научно Inc, СМИ, PA) в кислоте. Это покровного стекла был выбран для его толщина всего 0,1 мм, необходимые для высокой числовой цели отверстие, необходимое для фокусировки лазера.
  2. Чтобы создать область ячейки репеллент, растворите 20 мг поли-НЕМА (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури) в 1 мл 95% этанола в течение ночи при комнатной температуре. Предпочтительно, это решение должно быть использовано в течение 1 месяца с момента приготовления.
  3. Подоприте coverglasses в почти вертикальное положение в пыли окружающей среды, таких как капот.
  4. Положите одну или две капли поли-НЕМА решение в верхней части покровного стекла с пластмассовым наконечником из 200 мкл микропипетки. Капель (около 50-100 мкл каждого) должно быть ограничено до половины покровного стекла. Крутой склон обеспечивает жидкость стекает на поверхность покровного стекла на дно, обеспечивая тонким ровным покрытием поли-НЕМА. Разрешить поли-НЕМА покрытием coverglasses сушить в капюшоне в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
  5. Марк поли-НЕМА стороне покровного стекла с тонким кончиком пера близко к краю.
  6. Дрель 1 см отверстие в нижней части 35 мм культуры блюдо.
  7. Клей поли-НЕМА покрытием покровного стекла на дно культуры блюдо с Sylgard 184 (Dow Corning Компания Midland, MI), так что поли-НЕМА покрытие боковых граней к внутренней стороне тарелки. Обеспечить краю поли-НЕМА покрытия стекает центре отверстие. Разрешить блюда высохнуть в течение 1-3 дней при комнатной температуре в пыли окружающей среды.
  8. Царапины линию на внешней стороне покровного стекла с алмазным наконечником пера следующие краю поли-НЕМА покрытия. Потом, поцарапать двух пересекающихся линий под прямым углом к ​​ней примерно 2 мм друг от друга. Две точки пересечения служить ссылкой или координатных точках, которые будут использоваться для воспроизведения той же ориентации культуры блюдо на столик микроскопа.
  9. Стерилизовать посуду под ультрафиолетовым светом ночь.
  10. Для создания клеточных приверженцем половине культуры блюдо, пальто без поли-НЕМА пополам с Сал-1, который содержит мыши анти-саламандра антител, выдвигаемые против сетчатки клеточных мембран (любезно предоставлен д-р Питер MacLeish, Морхаус школы медицины , Атланта, Джорджия, см. MacLeish и др. (1983)).. Во-первых, пальто Сал-1 бок с примерно 100 мкл 0,1 мг / мл стерильного антимышиного IgG антител (Boehringer Mannheim корпорации, Индианаполис IN), стараясь не пролить жидкость на на поли-НЕМА стороны. Оставьте на три часа, затем удалить его. Мыть же районе с стерильного раствора Рингера один или два раза, затем поместите 100 мкл Сал-1 супернатант, стараясь не пролить жидкость в поли-НЕМА стороне тарелки. Первый антител обеспечивает Сал-1 покрыта в известной концентрации.
  11. Инкубируйте блюда с Сал-1 ночь.
  12. Удалить Сал-1 раствор антител и промойте область с стерильного раствора Рингера. Ввести 2 мл среды в блюдо непосредственно перед ячейки покрытия.

Состав раствора амфибия Рингера, бессывороточной амфибий среде, и раствор Рингера для ферментативного расщепления находятся в MacLeish и Таунс-Андерсона (1988) и др. Манделл. (1993).

Подготовка культурах клеток

Клетки, которые используются в этом видео были получены от светло-адаптированы, для взрослых, водные фазы тигра саламандры (Ambystoma tigrinum), измерительные 17-22 см в длину (Charles Sullivan Inc, Nashville, TN), поддерживается на уровне 5 ° С на 12 ч: 12 ч свет-темнота цикла. Протоколы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) при Университете медицины и стоматологии Нью-Джерси в строгом соответствии с руководящими принципами, от Национального института здоровья. Процедуры подготовки сетчатки культурах клеток описываются Нахмана-Clewner и Таунс-Андерсона (1996) и заключаются в следующем:

  1. Обезглавьте и сердцевина животных. Удалите глаза и рассекать из роговицы и радужной оболочки глаза. Сетчатки должны отделить немного в наглазник. Размещая изогнутых щипцов под сетчатку, выкопайте сетчатки. Это не важно, если объектив крепится к сетчатке на данном этапе.
  2. Дайджест сетчатки в 14 Ед / мл папаин (Уортингтон, Freehold, штат Нью-Джерси) в растворе Рингера саламандр в течение 40 минут.
  3. Перед использованием раствор папаин Рингера должны быть клокотало с 95% O 2 / 5% СО 2 в течение 30 мин., Затем стерилизуют при прохождении через фильтр 0,22 мкм (Millipore, Carrigtwohill, Ирландия).
  4. Промыть сетчатки с стерильного раствора Рингера саламандра в три раза.
  5. Удалить линзы из раствора Рингера, затем осторожно растирают ткани сетчатки с 3 мм отверстие пипетки для получения клеточной суспензии.

Лазерный пинцет манипуляции изолированных нейронов

  1. Место культуры блюдо на столике микроскопа, ориентируя блюдо, совместив метку на блюдо с ориентиром на сцене. Сохранить координаты реперных точек в компьютер.
  2. Пластина клеток на обеих Сал-1 и поли-НЕМА половинки блюдо.
  3. Разрешить клетки урегулировать в течение примерно 20 минут, что является достаточно долго, для клеток на приверженцем стороне блюдо для подключения к антитела подложки.
  4. Выберите ячейку Сал-1 приверженцем стороне тарелки. Марк х и у координаты этапе положение, близкое к клетке. В нашем случае точка была приблизительно 10 мкм от первичной дендритов выбранной ячейки. Сохранить координаты в компьютер.
  5. Выбор второго нейрона, в нашем случае фоторецептор, на поли-НЕМА сторону тарелку и использовать инструмент лазерный пинцет, чтобы уловить. Захват может быть достигнута в широком диапазоне уровней мощности. Тем не менее, мы устанавливаем мощность лазера на 10% -20%, что является достаточно низким, чтобы избежать захвата мусор вместе с клеткой, но достаточный для транспортировки клетку через среду.
  6. Удерживая ячейку в ловушку, ниже этапе, с тем, что клетка значительно выше поверхности культуры блюдо и выше всех присоединенных нейронов. Перемещение сцене под управлением компьютера принести ячейку ранее сохраненные координаты х и у на Сал-1 стороны. Сценического движения была установлена ​​на уровне 8-20 мкм / с, но максимальная скорость должна быть определены эмпирически. По прибытию в пункт назначения на Сал-1 стороны, поднимать на сцену, чтобы принести ловушку ячейки на поверхности блюда. Сотовые размещения могут быть сделаны с точностью до нескольких микрон. Разрешить ячейки придерживаться Сал-1 подложке.
  7. Получение цифровых изображений обеих клеток в паре до и после образования пар представляет собой полезный записи.
  8. Поддерживать ячейки пар в инкубаторе. Для саламандры клетки, места блюд во влажной камере при 10 ° C. Клетки могут контролироваться с помощью видео промежуток времени и использовать с любой клетки биологических техники требуется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Свет импульс, и, когда световой луч преломляется, проходя через ячейки, сила требуется для изменения направления движения. В силу закона сохранения импульса, силы в противоположном направлении должна, в свою очередь, реагируют обратно на камеру. Ашкина (1991) показали, что сила, создаваемая с помощью лазерного луча фокусируется объективом микроскопа будет двигаться ячейки к центру внимания. Хотя лазерный луч генерирует только несколько piconewtons силы, эта сила достаточно, чтобы вытащить камеру через среду. Ближней инфракрасной длине волны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке грантов NIH EY012031 и EY0182175 и FM-Кирби Foundation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Покрывное стекло №1, круг диаметром 25mmVWR international48380 080
поли-2-гидроксиэтилметакрилат (poly-HEMA)Sigma-AldrichP-3932Растворить в 95% этаноле
Козьи антитела против IgG мышиChemicon InternationalAP181 1mg в 1ml, развести в 10 раз перед использованием
Супернатант Sal-1, содержащий мышиные антитела против саламандрыпредоставлено д-ром Питером Маклейшем (Dr. Peter MacLeish)Д-р Питер Маклейш, Медицинская школа Морхауса, Атланта, Джорджия
Одноразовые пирексевые пипетки объемом 5ml с диаметром отверстия 3 mmCorning7078A-5
Чашки для культивирования клеток 35mm x 10mmCorning430165
Набор для силиконового эластомера Sylgard 184Dow Corning
Оптический пинцет-микроинструмент или лазерный пинцетCell Robotics Inc.
Диодный лазер непрерывного излучения мощностью 1 W с длиной волны 980nmCell Robotics Inc.
Инвертированный световой микроскоп Axiovert 100Carl Zeiss, Inc.
Объектив Plan Neofluor с масляной иммерсией, увеличение 40xCarl Zeiss, Inc.Числовая апертура (N.A. 1.3)
Черно-белая CCD-камераSony Corporation
Компьютер и джойстик с программным обеспечениемCell Robotics Inc.для управления моторизованным предметным столиком

Ссылки

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
  2. Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
  3. Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
  4. Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
  5. MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
  6. MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
  7. Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
  8. Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
  9. Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HEMASal 1

Похожие статьи