Это видео описывает манипуляции культурный нейронов помощью лазерного пинцета в пробирке.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование лазерный пинцет для манипуляций Изолированные нейроны In Vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данной работе и видео, мы описываем протоколов, используемых в нашей лаборатории для изучения ориентации предпочтения регенерации клеточных процессов взрослых нейронов сетчатки в пробирке. Порядок подготовки сетчатки клеточных культурах начинается с рассечение, пищеварения и растирания сетчатки, а в конце покрытия изолированных клеток сетчатки на блюда, приготовленные специально для использования с лазерным пинцетом. Эти блюда делятся на половину ячейки клей с половиной ячейки репеллент. Стороны ячейки клей покрыта слоем Сал-1 антител, которые обеспечивают подложки, на которой наши клетки расти. Другие клей подложки могут быть использованы для других типов клеток. Стороны ячейки репеллент покрыта тонким слоем поли-НЕМА. Клетки высевали на поли-НЕМА стороне блюда оказались в ловушке с лазерным пинцетом, транспортировались и затем помещается рядом с ячейкой на Сал-1 стороной для создания пары. Формирование группы клеток любого размера должно быть возможным с этой техникой. "Лазерный пинцет контролируемых микроманипуляция" означает, что исследователь может выбрать, какие клетки необходимо переместить, и необходимое расстояние между клетками может быть стандартизирована. Поскольку лазерный луч проходит через прозрачную поверхность культуры блюдо, выбора ячейки и размещение делается в закрытых, стерильной среде. Клетки могут контролироваться с помощью видео покадровой и использовать с любой клетки биологических техники требуется. Эта техника может помочь исследование межклеточных взаимодействий.
Протокол
Оптический пинцет для манипуляций изолированных клеток в культуре
Захват силами оптического пинцета создаются из импульсов света (Ашкина, 1991;. Ашкина и др., 1986). Хотя эти силы легко ловушку клеток в суспензии, они не в состоянии двигаться клеток, которые придерживаются поверхности. Поэтому, чтобы уменьшить адгезию к культуре блюдо в точке, где клетки оказались в ловушке, покровное покрыта поли-2-гидроксиэтилметакрилата (поли-НЕМА) (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури), нетоксичные соединения с сотовыми репелленты свойствами ранее для адгезии исследования на эндотелиальных клетках (Фолькмана и Moscona, 1978). Хотя поли-НЕМА охваты....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Свет импульс, и, когда световой луч преломляется, проходя через ячейки, сила требуется для изменения направления движения. В силу закона сохранения импульса, силы в противоположном направлении должна, в свою очередь, реагируют обратно на камеру. Ашкина (1991) показали, что сила, создаваемая с помощью лазерного луча фокусируется объективом микроскопа будет двигаться ячейки к центру внимания. Хотя лазерный луч генерирует только несколько piconewtons силы, эта сила достаточно, чтобы вытащить камеру через среду. Ближней инфракрасной длине волны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов NIH EY012031 и EY0182175 и FM-Кирби Foundation.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Покрывное стекло №1, круг диаметром 25mm | VWR international | 48380 080 | |
| поли-2-гидроксиэтилметакрилат (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Растворить в 95% этаноле |
| Козьи антитела против IgG мыши | Chemicon International | AP181 | 1mg в 1ml, развести в 10 раз перед использованием |
| Супернатант Sal-1, содержащий мышиные антитела против саламандры | предоставлено д-ром Питером Маклейшем (Dr. Peter MacLeish) | Д-р Питер Маклейш, Медицинская школа Морхауса, Атланта, Джорджия | |
| Одноразовые пирексевые пипетки объемом 5ml с диаметром отверстия 3 mm | Corning | 7078A-5 | |
| Чашки для культивирования клеток 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Набор для силиконового эластомера Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Оптический пинцет-микроинструмент или лазерный пинцет | Cell Robotics Inc. | ||
| Диодный лазер непрерывного излучения мощностью 1 W с длиной волны 980nm | Cell Robotics Inc. | ||
| Инвертированный световой микроскоп Axiovert 100 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Объектив Plan Neofluor с масляной иммерсией, увеличение 40x | Carl Zeiss, Inc. | Числовая апертура (N.A. 1.3) | |
| Черно-белая CCD-камера | Sony Corporation | ||
| Компьютер и джойстик с программным обеспечением | Cell Robotics Inc. | для управления моторизованным предметным столиком |
Ссылки
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
