Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод полного окрашивания антител горе в Чик

15.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/956

⸱

2 февраля 2009 г.

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Center for Environmental and Genetic Medicine, Texas A&M University (TAMU)

В этой статье

Краткое содержание

Это видео демонстрирует весь горе иммуногистохимии, метод, которым пространственной и временной экспрессии антигена могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell.

Аннотация

Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для исследования антител выражение в развитии мозга, нервной трубки и сомитов. Это видео демонстрирует различные этапы в целом монтажа антител окрашивания использования HRP сопряженных вторичными антителами; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эндогенной пероксидазы инактивированная; эмбрион затем подвергаются первичного антитела. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали с вторичными антителами конъюгированных с ПХ. Пероксидазы активность обнаруживаются с помощью реакции с диаминобензидина подложки. Наконец, зародыш фиксируется и обрабатывается для фотографирования и секционирования. Преимущество этого метода по сравнению с использованием флуоресцентных антител является то, что эмбрионы могут быть обработаны для воска секционирования, что позволяет изучать антигена сайтов в поперечном сечении. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell

Протокол

I. Схема Обзор:

Это видео демонстрирует различные этапы в целом иммуногистохимии монтирования в куриных эмбрионах. Во-первых, эмбрион закрепляется в PFA [IHC1]. Затем, эндогенной активности пероксидазы гасится [IHC2]. Эмбрион затем инкубировали в первичных антител [IHC3]. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали в вторичными антителами [IHC4]; Цветная реакция проявляется использования DAB [IHC5] и антитела окрашивания цвет на оранжевый [IHC6].

figure-protocol-1

Часть 1: Крепление эмбрионов

  1. Для выполнения целого иммуногистохимии крепление на куриных эмбрионах, сначала откройте яйца, нажав оболочки с пинцетом и удаление части корпуса.
  2. Удалить толстые альбумина с щипцами, и наклон желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
  3. Использование тонких ножниц, вырезать квадратный желточного мешка вокруг эмбриона. Удалить из эмбриона желток с ложкой, и место в блюдо с PBS.
  4. Под микроскопом рассечение, осторожно удалите мембраны и желток и перенос эмбрионов в свежем блюдо с PBS.
  5. Pin эмбриона вниз щипцами и насекомых булавками, и аспирата PBS. Замените это с 4% PFA в ФБР, и позволить эмбриону исправить 1 час при комнатной температуре.

Часть 2: Подготовка эмбрионы на наличие антител шаг

  1. Чтобы свести к минимуму возможное загрязнение микробов, использования DDH 2 O во всех следующих шагов.
  2. После эмбриона фиксировано, аспирация фиксирующий раствор и распоряжаться надлежащим образом как химические отходы. Заполните блюдо с PBS.
  3. Далее, используя микродиссекции ножом, вырезать квадрат вокруг эмбриона, чтобы удалить экстраэмбриональных мембран. Удалить насекомых булавками с щипцами.
  4. После контакты были удалены, используйте тупым концом пипетки Пастера перенести эмбрион сцинтилляционный флакон с PBT (PBS рН 7,4, 0,5% Triton X).
  5. Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза в течение 10 минут каждый.
  6. Удалить из PBT сцинтилляционный флакон, и заменить PBTx, содержащие 0,3% H 2 O 2, чтобы инактивировать потенциал эндогенной пероксидазы.
  7. Инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре на nutator.
  8. Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза по 10 минут каждый, а затем 3 раза по 30 минут каждый.

Часть 3: Антитела инкубации

  1. Для окраски эмбриона с антителами, начните с стиральной эмбрионов в течение одного часа в блокирующем буфере или 1% BSA / 1% NGS / PBT (мы используем NGS потому вторичными антителами возникает в козла). Инкубировать на nutator в течение одного часа при комнатной температуре.
  2. Развести первичного антитела 1:1 в блокирующий буфер, и инкубировать эмбриона в этом растворе в течение 2 дней при температуре 4 ° С на nutator. Первичный фактор разведения антител зависит от выбора первичного антитела. Здесь мы используем антитела из Развития Исследований Гибридома банка, который предоставляется в качестве supernatent. Мы разбавить его 1:1 в блокирующем буфере.
  3. Следующая, выполнять три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.
  4. После мытья, разбавленных вторичных антител 1:2500 в блокирующем буфере (в данном случае пероксидазы сопряженным-антимышиного IgG (H + L) и инкубировать эмбриона в этом растворе O / N при температуре 4 ° С на nutator.
  5. Выполните три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.

Часть 3: Цветная реакция

  1. Разработать цвет реакция окрашенных эмбриона, сначала выполнить две 20-минутные моется в трис-буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4).
  2. Тем временем растворяются DAB субстрата (3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride) в трис-буфере на 500μg/ml под вытяжным шкафом; держать раствор в темноте, на льду.
  3. Удаление последнего буфера Трис вымыть из флакона эмбриона и заменить 5 мл раствор DAB с шагом 3.2. Хранить в темном на nutator на 20 млн. Утилизировать Эппендорф чаевые в емкость, содержащую 10% гипохлоритом натрия для того, чтобы обеззараживать DAB.
  4. Тем временем подготовить 0,3% акций H 2 O 2 в дН 2 O на льду.
  5. Добавить 50 мкл акции H 2 O 2 на флакон, содержащий эмбрионов в DAB. Имейте в темноте. Через 1-2 минут, контролировать реакции под микроскопом.

Часть 4: Эмбрион обработки фотографий и гистологии

  1. Когда цветная реакция завершена, распоряжаться DAB в отбеливатель ведро. Заменить на 5 мл водопроводной воды.
  2. Выполните 2 10-минуте моется в PBS.
  3. Для обработки для фотографии и воска секционирования, обезвоживаются в серии этанола (25%, 50%, 75% и 100%) в течение 10 минут каждый.
  4. Замените этанола с 0,5 - 1 мл масла кедрового дерева (это сделает эмбриона полупрозрачные). Процесс фотографии в масле кедрового дерева.
  5. После фотографии, вернуть эмбрион флакон и заменить масло кедрового дерева со 100% этанола. Повторите этанола шаг.
  6. Замените электроннойthanol с 5% Быстрый зеленый FCF в 100% этанола, и инкубировать в течение 3 минут (этот шаг сделает эмбрионов видимым для гистологии). Замените Быстрый зеленый раствор FCF со 100% этанола и процесс гистологии.

Представитель Результаты:

figure-protocol-2

В примерах, приведенных ниже, эмбрионы расчлененный на этапах HH 10 (А), 12 (Б) и 11 (С); Эмбрионы показать выражение PAX 7 на развивающихся нейронных crestas также в сомитов и нервной трубки (А, В); В (С), хорда помечена 15.3B9 (Не-1) (Антитела предоставляемые развитием исследований Гибридома банк).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это видео демонстрирует различные этапы в выполнении целого монтажа антител окрашивания у молодых куриных эмбрионов. Этот протокол существенно используется пространственная и временная характеристика новых антител в куриных 2,3, а также для использования известных маркеров для определения антигенных эмбриональных пороков следующие оскорбления 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Моноклональных антител (15.3B9, Pax7), разработанная (Дж. Додд, ТМ Jessell и А. Каваками) были получены из исследований развитием Гибридома Банке разработана под эгидой NICHD и поддерживается университете штата Айова, Отделение биологических наук , штат Айова. DP является получателем Рут Kirschstein премии 1F32-01A1 DA021977 из Национального института по злоупотреблению наркотиками. Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЯйцаCharles River LaboratoriesPremium FertileОплодотворенные, HH4 (16 ч)
СтереомикроскопМикроскопLeica MicrosystemsMZ9.5 или аналогичный
Автоматический инкубатор MarshПрочееLyonRX
Изогнутый пинцет (1)ИнструментElectron Microscopy Sciences72991-4C
Пинцет (2)ИнструментFine Science Tools11002-13
Тонкие ножницыИнструментFine Science Tools14161-10
Пластиковые чашкиИнструментFalcon BD353001
Резиновая грушаИнструментElectron Microscopy Sciences70980
Капиллярная пипетка ПастераИнструментElectron Microscopy Sciences70950-12скруглить конец над пламенем
Микродиссекционный ножИнструментFine Science Tools10056-12Используется для отделения эмбриона от окружающих мембран после фиксации
Силиконовый эластомер Sylgard 184, отвердитель и основаРеагентDow Corning0001986475Смешать 1 часть отвердителя и 9 частей основы; оставить на ночь при 37C
16% PFAРеагентElectron Microscopy Sciences15710
30% H2O2РеагентSigma-AldrichH1009
BSAРеагентSigma-AldrichA3803
NGSРеагентJackson ImmunoResearch005-000-121
Первичные антителаРеагентDevelopmental Studies Hybridoma Bank4G11, 15.3B9, PAX7Для этих антител исследователи использовали мышиных доноров
Конъюгированные с пероксидазой антитела козы к IgG мыши (H+L)РеагентJackson ImmunoResearch115-035-003
3,3’-диаминобензидин тетрагидрохлоридРеагентPierce, Thermo Scientific34001Хранить при -20; перед использованием дать флакону нагреться до RT.
Кедровое маслоРеагентSigma-AldrichW522503
Fast green FCFРеагентSigma-AldrichF7252
Булавки Minuten, диам. 0.2mmFine Science Tools26002-20

Ссылки

  1. Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
  2. Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
  3. Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
  4. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Иммуногистохимия целого препаратаэмбрион цыпленкаантителаконъюгированные с HRPфиксация параформальдегидоминактивация эндогенной пероксидазыинкубация с первичными антителамиинкубация со вторичными антителамиреакция с субстратом DABизготовление парафиновых срезов
Метод полного окрашивания антител горе в Чик
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.