$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
I. Схема Обзор:
Это видео демонстрирует различные этапы в целом иммуногистохимии монтирования в куриных эмбрионах. Во-первых, эмбрион закрепляется в PFA [IHC1]. Затем, эндогенной активности пероксидазы гасится [IHC2]. Эмбрион затем инкубировали в первичных антител [IHC3]. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали в вторичными антителами [IHC4]; Цветная реакция проявляется использования DAB [IHC5] и антитела окрашивания цвет на оранжевый [IHC6].
Часть 1: Крепление эмбрионов
- Для выполнения целого иммуногистохимии крепление на куриных эмбрионах, сначала откройте яйца, нажав оболочки с пинцетом и удаление части корпуса.
- Удалить толстые альбумина с щипцами, и наклон желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
- Использование тонких ножниц, вырезать квадратный желточного мешка вокруг эмбриона. Удалить из эмбриона желток с ложкой, и место в блюдо с PBS.
- Под микроскопом рассечение, осторожно удалите мембраны и желток и перенос эмбрионов в свежем блюдо с PBS.
- Pin эмбриона вниз щипцами и насекомых булавками, и аспирата PBS. Замените это с 4% PFA в ФБР, и позволить эмбриону исправить 1 час при комнатной температуре.
Часть 2: Подготовка эмбрионы на наличие антител шаг
- Чтобы свести к минимуму возможное загрязнение микробов, использования DDH 2 O во всех следующих шагов.
- После эмбриона фиксировано, аспирация фиксирующий раствор и распоряжаться надлежащим образом как химические отходы. Заполните блюдо с PBS.
- Далее, используя микродиссекции ножом, вырезать квадрат вокруг эмбриона, чтобы удалить экстраэмбриональных мембран. Удалить насекомых булавками с щипцами.
- После контакты были удалены, используйте тупым концом пипетки Пастера перенести эмбрион сцинтилляционный флакон с PBT (PBS рН 7,4, 0,5% Triton X).
- Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза в течение 10 минут каждый.
- Удалить из PBT сцинтилляционный флакон, и заменить PBTx, содержащие 0,3% H 2 O 2, чтобы инактивировать потенциал эндогенной пероксидазы.
- Инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре на nutator.
- Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза по 10 минут каждый, а затем 3 раза по 30 минут каждый.
Часть 3: Антитела инкубации
- Для окраски эмбриона с антителами, начните с стиральной эмбрионов в течение одного часа в блокирующем буфере или 1% BSA / 1% NGS / PBT (мы используем NGS потому вторичными антителами возникает в козла). Инкубировать на nutator в течение одного часа при комнатной температуре.
- Развести первичного антитела 1:1 в блокирующий буфер, и инкубировать эмбриона в этом растворе в течение 2 дней при температуре 4 ° С на nutator. Первичный фактор разведения антител зависит от выбора первичного антитела. Здесь мы используем антитела из Развития Исследований Гибридома банка, который предоставляется в качестве supernatent. Мы разбавить его 1:1 в блокирующем буфере.
- Следующая, выполнять три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.
- После мытья, разбавленных вторичных антител 1:2500 в блокирующем буфере (в данном случае пероксидазы сопряженным-антимышиного IgG (H + L) и инкубировать эмбриона в этом растворе O / N при температуре 4 ° С на nutator.
- Выполните три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.
Часть 3: Цветная реакция
- Разработать цвет реакция окрашенных эмбриона, сначала выполнить две 20-минутные моется в трис-буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4).
- Тем временем растворяются DAB субстрата (3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride) в трис-буфере на 500μg/ml под вытяжным шкафом; держать раствор в темноте, на льду.
- Удаление последнего буфера Трис вымыть из флакона эмбриона и заменить 5 мл раствор DAB с шагом 3.2. Хранить в темном на nutator на 20 млн. Утилизировать Эппендорф чаевые в емкость, содержащую 10% гипохлоритом натрия для того, чтобы обеззараживать DAB.
- Тем временем подготовить 0,3% акций H 2 O 2 в дН 2 O на льду.
- Добавить 50 мкл акции H 2 O 2 на флакон, содержащий эмбрионов в DAB. Имейте в темноте. Через 1-2 минут, контролировать реакции под микроскопом.
Часть 4: Эмбрион обработки фотографий и гистологии
- Когда цветная реакция завершена, распоряжаться DAB в отбеливатель ведро. Заменить на 5 мл водопроводной воды.
- Выполните 2 10-минуте моется в PBS.
- Для обработки для фотографии и воска секционирования, обезвоживаются в серии этанола (25%, 50%, 75% и 100%) в течение 10 минут каждый.
- Замените этанола с 0,5 - 1 мл масла кедрового дерева (это сделает эмбриона полупрозрачные). Процесс фотографии в масле кедрового дерева.
- После фотографии, вернуть эмбрион флакон и заменить масло кедрового дерева со 100% этанола. Повторите этанола шаг.
- Замените электроннойthanol с 5% Быстрый зеленый FCF в 100% этанола, и инкубировать в течение 3 минут (этот шаг сделает эмбрионов видимым для гистологии). Замените Быстрый зеленый раствор FCF со 100% этанола и процесс гистологии.
Представитель Результаты:
В примерах, приведенных ниже, эмбрионы расчлененный на этапах HH 10 (А), 12 (Б) и 11 (С); Эмбрионы показать выражение PAX 7 на развивающихся нейронных crestas также в сомитов и нервной трубки (А, В); В (С), хорда помечена 15.3B9 (Не-1) (Антитела предоставляемые развитием исследований Гибридома банк).