Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры послеродовой мыши мозжечка гранул клеток-предшественников нейронов и нейронов

28.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/990

⸱

16 января 2009 г.

 ,  ,  , 
1Department of Genetics and Development, Columbia University , 2Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University , 3Department of Neuroscience, Columbia University , 4Department of Neurology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать и культуры мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников нейронов мозжечка и гранулы из послеродового мыши.

Аннотация

Коре мозжечка является хорошо описывается структура, которая предоставляет уникальные возможности для изучения свойств нейронов и развитие 1,2. Из мозжечка нейронов типов (зернистых клеток, клеток Пуркинье и тормозные интернейроны), гранулы нейроны являются на сегодняшний день самая многочисленная и наиболее распространенный тип нейронов в мозге млекопитающих. У грызунов, мозжечковые нейроны гранулы образуются в течение первых двух послеродовых недель из клеток-предшественников в наружный слой коры мозжечка, внешний слой гранул (EGL). Протокол, представленные здесь описываются методы обогащения и нейронов культуры гранул и их клеток-предшественников из послеродовой мыши мозжечка. Мы опишем процедуры получения культур повышения чистоты 3,4, которые могут быть использованы для изучения дифференциации пролиферирующих клеток-предшественников нейронов в гранулы 5,6. Как только клетки-предшественники дифференцировать, культур также обеспечить однородное население гранул нейронов для экспериментальных манипуляций и характеристику таких явлений, как синаптогенез, глутамат функции рецептора 7, взаимодействие с другими очищенные клетки мозжечка 8,9 или гибель клеток 7.

Протокол

Часть 1: Настройка (1-2 дней до вскрытия) (не показано на видео)

  1. ПОДГОТОВКА КУЛЬТУРА РЕШЕНИЯ И СМИ:
    • 4X CMF-PBS-ЭДТА (кальция и магния свободной фосфатным буферным физиологическим раствором ЭДТА для разведения Перколла): на литр, добавьте 32 г хлористого натрия, 1,2 г хлорида калия, 8 г сахара, 2 г NaH 2 PO 4, 1 г KH 2 PO 4, 8 мл 2% NaHCO 3 акции, 10 мл 1М ЭДТА (рН 8,0), к дистиллированной / деионизированной водой. Регулировка громкости на 1 л и рН до 7,4. Фильтры стерилизовать.
    • HBSS-глюкозы: Добавить глюкозы (6 г / л) с кальцием и магнием баланс свободного Хэнка солевом растворе (HBSS) и стерильный фильтр. 500 мл можно хранить при температуре 4 ° С не более месяца.
    • КУЛЬТУРА СМИ: бессывороточной среде (SFM) и 10% FBS среду. Для 48 мл Neurobasal-Medium добавить 500 мкл 100X GlutaMAX I, 500 мкл 100X Пенициллин-Стрептомицин (конечная 100 единиц пенициллина и 100 мкг стрептомицина), 6,25 мкл 2 М KCl (конечная 250 мкм). Раскол в 2 аликвоты 9 мл и 40 мл. Для подготовки 10% FBS среду, добавить 1 мл тепла инактивированной FBS к 9 мл аликвоту. Для подготовки УЛ, добавьте 800 мкл сыворотки бесплатное приложение B-27 на 40 мл аликвоту. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель. Для достижения наилучших результатов сделать новые средства массовой информации для каждого эксперимента.
  2. ПОДГОТОВКА Перколла разведения:
    • Перколла поставляется в виде жидкости, и она должна быть подкисленной перед использованием. Для подготовки акции, добавить 1 н мало-помалу Перколла решение за 1-2 часа до периода рН 7,4 будет достигнута. Добавление HCl слишком быстро приведет Перколла к агрегации. Примерно 6.5ml 1 н соляной кислоты, необходимые для каждого литра Перколла. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.
    • 35% и 60% (по объему: объем) Перколла разведения будут использоваться в шаге градиента Перколла. Подготовка 100 мл Перколла разведения, содержащего 35 или 60 мл Перколла акций, 25 мл 4 раза CMF-PBS-ЭДТА и дистиллированной / деионизированной H2O до конечного объема. Добавить несколько капель толуидиновым синим к 60%-ный раствор, это поможет визуализировать интерфейс и клеток. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.
    • 4X CMF-PBS-ЭДТА не должен быть старше 3 месяцев, как неадекватные буферизации будет вызывать повышенную гибель клеток во время процедуры.
  3. ПОДГОТОВКА покровные: Стекло покровные (лучше всего, если от Каролины Биологические Компания питания) промывают 10% HCl ночь при комнатной температуре с легким волнением, тщательно промыть дистиллированной / deonized водой и хранят в 70% этанола. Перед использованием одного покровные являются огненно-стерилизовать кратко удерживая их пинцетом над открытым огнем (горелки Бунзена) до этанола испаряется. 12-мм покровные стекла могут быть размещены в 4-х и культуре тарелки и 25-мм покровные в 6-луночных культуры.
  4. ПОКРЫТИЕ КУЛЬТУРА СУДОВ с подложкой: Для иммунофлуоресцентного метода или препарата покровные стекла лечение более приемлемым, поскольку они легко могут быть установлены на стеклах для визуализации под микроскопом. Когда большое количество клеток, необходимых для сбора белка или РНК, образцы, клетки можно культивировать на пластиковых культуры dishes.The ночь перед рассечение, стекла покровные или пластиковой посуды для культуры должна быть покрыта поли-D-лизин (500 мкг / мл; 800 мкл / лунку для 6-луночных или 350 мкл / лунку для 4-луночных). 5 мг / мл маточного раствора поли-D-лизин хранится при температуре -20 ° С, затем разводят в стерильной дистиллированной / deonized воды и стерильно фильтруют непосредственно перед использованием. Культура судов инкубируют при 37 ° С в течение ночи (или, по крайней мере за 2 часа до покрытия) и дважды промывают стерильной дистиллированной / deonized воду прямо перед покрытием.
  5. ПОДГОТОВКА PREPLATING БЛЮДА: Эти блюда будет использоваться для предварительного покрытия изолированных клетках мозжечка до культуры для удаления глиальных загрязняющих веществ, которые придерживаются более легко в более низкой концентрации субстрата. Пальто два 60-мм пластиковой посуды культуры с 4 мл на чашку поли-D-лизин (100 мкг / мл; Обратите внимание, это 1 / 5 от концентрации используются для культивирования). Инкубировать при 37 ° С в течение ночи (или, по крайней мере за 2 часа до вскрытия). Прямо перед рассечение, удалить поли-D-лизин решение, мыть посуду в два раза стерильной водой и дать высохнуть в капюшоне.
  6. Стерилизовать рассечение инструментов в автоклаве или в день вскрытия, погрузить инструменты в 70% этаноле в течение 20 минут. Необходимые инструменты: Permaset ножницы, ножницы microdissecting, четыре Дюмон # 5 рассекает щипцами.

Часть 2: Подготовка к Dissection (день вскрытия) - (Продемонстрированный в видео)

Все последующие процедуры проводятся в капюшоне культуры ткани, если не указано.

  1. Протрите рассекает район с 70% этанола. Теплый СМИ до 37 ° С на водяной бане или в 5% СО 2 37 ° C инкубатора.
  2. При запуске новой системы Папаин Диссоциация Kit (Уортингтон), приготовьте раствор альбумина-ovomucoid ингибитора. Добавить 32 млиз EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла, при условии, в комплект), чтобы альбумин-ovomucoid ингибитор смеси и позволяют растворить содержимое при подготовке других компонентов. Развести для первого использования, а затем сохранить оставшийся раствор при температуре 2-8 ° С и использовать до пяти выделений разрешено каждом комплекте будут завершены.
  3. Добавьте 5 мл EBSS одному папаин флакон из Диссоциация Kit (каждого флакона достаточно для диссоциации от 4 до 15 cerebella от послеродовой 5-й день мышей). Место папаин флакона в 5% СО 2 37 ° C инкубатора или 37 ° С на водяной бане 5 до 10 минут, пока папаин полностью не растворится и решение представляется ясным. Поддерживать растворе при комнатной температуре в течение рассечение.
  4. Добавить 500 мкл EBSS одному ДНКазы флакон из пакета диссоциации. Осторожно перемешать, нажав флакон с ДНКазы чувствителен к сдвигу денатурации. Добавить 250 мкл этого раствора флакон, содержащий папаин (конечная концентрация составляет 20 ед / мл папаин и 0,005% ДНКазы). Сохранить оставшиеся флакон ДНКазы для использования в шаге 5.1 или 6.1.

Часть 3: Разбор и мозговых оболочек удаление

  1. Оптимальный возраст для гранул культуре клеток мышей C57BL/6J является послеродовая день 4-6, когда число прародителей ЗК в EGL peaks1, 10. Рассеките щенков по одному за раз и, как вы более подробно ознакомиться с мозжечковой рассечение попытаться уменьшить время вскрытия не более 6 минут на щенка. Скорость имеет сущности.
    Если шаг Перколла градиент обходится, восемь послеродовых дней-5 щенков мыши может дать достаточное количество клеток для одного 6-и культуру пластину (или шесть 25-мм покровные) или в течение шести 4-а культуры пластин (или двадцать четыре 12 - мм покровные). Приблизительное количество составляет от 4 до 5x106 клеток на щенка и покрытие плотность может варьироваться от 1 до 5X105 cells/cm2. Так как 15-20% клетки теряются во время Перколла step4, больше животных, необходимое для получения желаемого же плотность клеток.
  2. Внесите 15 мл HBSS-глюкозы в 60-мм пластиковыми блюдо культуры тканей и 10 мл в стерильный Сокол 15 мл коническую пластиковую трубку. Положите на льду.
  3. Вне капот, протрите глава щенка с 70% этанола. Используйте Permaset ножницы, чтобы отрубить голову щенка. (Обезглавливание не будет показано в видео.)
  4. В капоте, удерживая голову щипцами Дюмон, чтобы вы могли ясно видеть заднюю часть черепа. Доступ мозга, вставив microdissecting ножницы в затылочное отверстие и резки прямо к глазам. Использование щипцов, очистить от кожи и поднимите череп подвергать мозга. Использование Дюмон щипцы, отщипывать мозжечка и окружающих среднего мозга и передать его на блюдо с HBSS-глюкозы. (Это легче манипулировать мозжечка и удалить мозговых оболочек, если мозжечок еще привязаны к окружающим тканям).
  5. Под микроскопом рассекает, мягко кожуры мозговых оболочек от мозжечка, а также между долями с одним прекрасным Дюмон # 5 щипцов во время использования других пинцетом, чтобы закрепить вниз мозжечка к пластине. Вы заметите, кровеносные сосуды на поверхности мозжечка. Эти кровеносные сосуды, это хороший способ выявить мозговые оболочки. Удалить мозговых оболочек до мозжечка приобретает матовый белый цвет. Отдельные мозжечка от остальной части мозга. Включите его в брюшную сторону и снять сосудистого сплетения, которая выглядит как красноватый ленты между вентральной мозжечка и смежных мозга. Место каждого мозжечка в холодной HBSS-глюкозы в 15 мл коническую трубку на льду, как только расчленены. Изменение рассекает решение на свежий HBSS-глюкозы после вскрытия 3 мозги.

Часть 4: Сотовый подвески

  1. После того как все вскрытия закончите, удалите HBSS-глюкозы из трубы и заменить его папаин решения сделали в шаге 2.4. Хотя комплект рекомендует резки ткани в мелкие кусочки, мы находим, что не стоит резать или рубить cerebella в этом возрасте. Место ткань + папаин решение (в 15 мл коническую трубку) в 37 ° С водяной бане или 5% СО 2 37 ° C инкубаторе в течение 15 до 20 минут. За 4 до 8 cerebella, 15 минут при 37 ° C достаточно, а для большего числа cerebella 20 до 30 минут, тем лучше. Аккуратно агитировать трубку каждые 3 до 4 минут.
  2. Измельченного в порошок смеси с стерильных P1000 аэрозоля пипетки, которая была покрыта FBS. Делайте это осторожно шаг, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков. Пожар полированного стекла пипеток можно использовать, но мы обнаружили, что сыворотка покрытием стерильной P1000 советы аэрозоля работать так же хорошо. Для пальто пипетки с ФБС, ФБС пипетку вверх и вниз в два раза непосредственно перед употреблением. Около 10 вверх и вниз, движения с пипетку, достаточно, чтобы отделить ткани. Решение будет облачно. Разрешить подвески сидеть в течение 30-60 секунд, так что любые большие куски ткани недиссоциированных осядет на дно трубы.
  3. Удаление взвешенных клеток (осторожны, чтобы не удалить недиссоциированных частей ткани на бottom) в свежем 15 мл коническую трубку с сывороткой покрытием кончика пипетки. Центрифуга примерно 200xg в течение 5 минут при комнатной температуре. Подготовка ресуспензии среды. Для этого смешайте 2,7 мл EBSS 300 мкл восстановленного альбумин-ovomucoid раствора ингибитора в стерильную пробирку. Добавить 150 мкл раствора ДНКазы с шагом 2.4.
  4. После центрифугирования супернатант отказаться и сразу ресуспендируют осадок клеток в разбавленных ДНКазы / раствор альбумина ингибитор подготовлен в шаге 4.3 с сывороткой покрытием P1000 аэрозоля пипетки.
  5. Подготовка разрывным градиентом плотности следующим образом. Добавьте 5 мл альбумина ovomucoid ингибитор решение 15 мл коническую трубку. Тщательно слой клеточной суспензии на вершине. Центрифуга примерно 70xg в течение 6 минут при комнатной температуре. Расхождение между клетками гранул на дне пробирки, мембранные фрагменты остаются на границе раздела.
  6. Если вы хотите получить культур, которые обогащены зернистых клеток, обойти разделения Перколла градиент шаг (что и дает чистый культурах мозжечка ЗК), и перейдем к части 6. Если вы хотите еще больше изолировать зернистых клеток из глии и крупных интернейронов разделением градиент Перколла, переходите к Части 5. Использование шаг градиента Перколла позволит снизить выход клеток. В наших руках, снижение урожайности примерно на 20-35%. Однако, есть увеличение обогащения гранул нейронов и клеток-предшественников, примерно с 90% до 95-99%.

Часть 5: Перколла Градиент Разделение

  1. Удалите супернатант и сразу ресуспендируют осадок в 2 мл HBSS-глюкозы с 50 мкл ДНКазы с шагом 2.4. Фильтры клеточной суспензии хотя нейлоновая сетка (размер пор 70 мкм) под действием силы тяжести. Этот шаг приводит к удалению большого не-нервных клеток и обеспечивает лучшую суспензии отдельных клеток.
  2. Приготовьте два пожарных полированного стекла Пастера пипеток. Чтобы сделать это, мягко пламени кончик стеклянной пипетки, пока край шлифуется и пипетки отверстия составляет 40-50% от первоначального размера. Заботьтесь, чтобы не сделать открытия слишком мал.
  3. Подготовка Перколла градиента. Место 10 мл 35% раствора в Перколла 50 мл стерильного коническую трубку. 60% Перколла (10 мл) загружается в 10 мл стерильного шприца с иглой стерильной спинного прилагается. Аккуратно слоя 60% Перколла решение под 35% раствора, путем добавления 60%-ный раствор в нижней части трубки с иглой спинного. Позаботьтесь, чтобы сохранить резкой границы между двумя слоями. Добавить клеткам в верхней части градиент, используя огневой полировкой пипетки, аккуратно складывая их вдоль боковой трубкой, не нарушая интерфейс.
  4. Аккуратно положите трубку в центрифуге и центрифуге при 1800xg. Нарастить скорость на один шаг каждые 20 секунд (с шагом скорости следующим образом: приблизительно 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), так что она занимает около 2 минут, чтобы достичь желаемой скорости. Начало таймер до 10 мин, когда 1800xg будет достигнута. Когда закончите, уменьшают скорость постепенно один шаг каждые 20 секунд.
  5. Снимите верхнюю интерфейс градиент (содержащих большое глия, клетки Пуркинье и интернейроны) и выбросьте.
  6. Осторожно удалите клетки на границе между 35% и 60% Перколла с огневой полировкой пипетки и трансфер в 50 мл коническую трубку. Ресуспендируют в 3-х томов HBSS-глюкозы и перемешать путем обращения в несколько раз. Центрифуга течение 5 минут при 1100xg.
  7. Удалить супернатант и добавьте 4 мл 10%-средний ФПС с 50 мкл ДНКазы. Ресуспендируют гранулы мягко использованием огневой полировкой пипетки в единое клеточной суспензии. Переходите к пункту 6.2.

Часть 6: Pre-покрытие и покрытие

  1. Удалите супернатант и сразу ресуспендирования окатышей в 4 мл 10%-средний ФПС с 50 мкл ДНКазы с шагом 2.4. Фильтры клеточной суспензии хотя нейлоновая сетка (размер пор 70 мкм) под действием силы тяжести. Этот шаг приводит к удалению большого не-нервных клеток и обеспечивает лучшую суспензии отдельных клеток.
  2. Пластина собранных клеток на поли-D-лизин покрытием предварительно покрытие блюдо в течение 20 минут в 5% СО 2 37 ° C инкубатора. Повторите с свежим блюдом. Астроглией и более тяжелые клетки успокоиться и придерживаться посуду и оставить небольшие гранулы нейроны и клетки предшественники нейронов плавающим. После инкубации, свободно придерживаться гранул нейроны и клетки предшественники нейронов являются легко смещаются и ослабил с мягким нажатием пластины.
  3. Сбор гранул нейроны и клетки предшественники нейронов в 15 мл коническую трубку и центрифуге при 200xg течение 5 минут. Ресуспендируют гранул в 1 мл бессывороточной среде и считать Аликвоту 10 мкл использованием гемоцитометра.
  4. Добавить бессывороточной среде для достижения желаемой плотности клеток. Примерные инструкции для количества клеток, чтобы пластина для средней плотности: для 6-луночный, от 3,5 до 4 миллионов клеток, а для 4-луночных, 650000 клеток. Для 6-луночный культуры, я пластины 1,5 мл / хорошо, и в течение 4 хорошо плаTES, я пластины 0,5 мл / лунку. Клетки сохраняются в 5% СО 2 37 ° C инкубатора. Изменение среды полностью через 24 часа с последующими изменениями каждые два-три дня.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол основан на модификации процедуры, которые были описаны в прошлом 3,7,11. Есть несколько важных моментов, как описано ниже.

Гранулы нейронов и клеток-предшественников, придерживаются в течение 2 часов обшивки. Здоровые клетки имеют морфологию круглые под фазово-контрастным микроскопом 4. В течение 24 часов после покрытия, здоровые клетки будут распространяться равномерно вокруг покровные или пластиковой хорошо и сформирует процессов. Во время первого изменения среды, после 24 часов, там будет неско...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Мы благодарим Барбара Carletti и Анна Мари Кенни за неоценимую предложения. HYL поддерживается Обучение Грант "Гормоны: биохимии и молекулярной биологии", DK07328. При частичной поддержке гранта NIH 5R01 NS16951 (CAM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточный фильтр с размером пор 70μmBD Biosciences352350
Спинальная иглаBD Biosciences40518220G x 3-1/2 дюйма
Поли-D-лизин, мол. масса >300,000Sigma-AldrichP1024Каждая новая партия поли-D-лизина должна быть протестирована.
PercollSigma-AldrichP-1644
Пенициллин-стрептомицин (100X)Sigma-AldrichP4333
HBSSInvitrogen14175-103Должен быть без кальция и магния.
Среда Neurobasal AInvitrogen10888-022
Добавка Glutamax IInvitrogen35050-061
Безсывороточная добавка B-27 (50x)Invitrogen17504-044
Круглые покровные стекла 12 ммCarolina Biological63-3029Производятся в Германии компанией Deckgluder.
Круглые покровные стекла 25 ммCarolina Biological63-3037Производятся в Германии компанией Deckgluder.
Система диссоциации папаиномWorthington BiochemicalLK 003150Набора достаточно для пяти выделений.
Ножницы PermasetRoboz Surgical Instruments Co.RS6782
Пинцет Dumont №5 (Dumostar)Roboz Surgical Instruments Co.RS4978
Культуральная чашка на 4 лункиNalge Nunc international176740
Культуральная чашка на 6 лунокNalge Nunc international140685

Ссылки

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
  2. Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
  3. Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).
  4. Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).
  5. Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).
  6. Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).
  7. Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).
  8. Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).
  9. Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).
  10. Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).
  11. Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).
  12. Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).
  13. Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
  14. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
  15. Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
  16. Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
  17. Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
  18. Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
  19. Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).
  20. Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

L
Выделение и культуры послеродовой мыши мозжечка гранул клеток-предшественников нейронов и нейронов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.