Анализ Физиологические E-селектин-опосредованной лейкоцитов Роллинг на микрососудистой эндотелия

В этом видео демонстрируется анализ проточной камеры с параллельными пластинами для изучения факторов, вызывающих скручивание лейкоцитов на поверхности эндотелиальных клеток. Монослои эндотелиальных клеток стимулируются провоспалительным цитокином IL one beta для повышения экспрессии S-селектина. Затем проточная камера с параллельной пластиной помещается над эндотелиальными клетками, и S-селектин-положительные лейкоциты вводятся поверх монослоя.

Таким образом, клеточные взаимодействия в камере сопровождаются чистым напряжением, аналогичным тому, которое происходит при посткапиллярной и лейкоцитарной адгезии. Скользящие события захватываются и перечисляются с помощью элементов NIS и анализа на независимость выбора E. Здравствуйте, я Джордж Вайс в лаборатории доктора Чарльза де Нитро в отделении дерматологии в женской больнице Бригмана, Гарвардская медицинская школа.

Сегодня мы покажем вам методику анализа роли e-селектина, Е-селектиновых лигандов в адгезии лейкоцитов человека к эндотелиальным клеткам костного мозга человека в физиологических условиях кровотока. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения роли молекул клеточной поверхности, которые инициируют адгезию белых кровяных телец или метастатических раковых клеток к эндотелиальным клеткам, выстилающим внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Это адгезивное событие характеризуется такими же свойствами, как шар для боулинга, катящийся по дорожке.

Итак, приступим. Первым шагом в этой процедуре является подготовка эндотелиальных клеток, которые будут выстилать проточную камеру. В этом протоколе используются клетки H-B-M-E-C 60, полученные из костного мозга человека.

Чашки для культивирования микроциркуляторного русла должны быть предварительно покрыты фибронектином для приготовления этих инкубационных 35-миллилитровых культур тканей с PBS, содержащим 20 микрограммов фибронектина на миллиметр. Их можно инкубировать в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение трех часов при 37 градусах Цельсия. Суспендируйте H-B-M-E-C 60 клеток в среде 1:99 и засейте от 10 до пятой клетки на чашку, вырастите культуры до более чем 90%-го слияния.

Потребуется около двух дней, чтобы повысить регуляцию и экспрессию, аспирировать питательную среду и добавить свежую среду с 50 нанограммами на мил IL, одну бета-инкубацию в течение четырех-шести часов. Монослои клеток теперь готовы к анализу в проточной камере. Дополнительные планшеты с клетками H-B-M-E-C 60 могут быть стимулированы IL one beta и обработаны нейтрализующими антителами против человеческого e-селектина в дозе 20 мкг/мил в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Это будет контролировать функциональную экспрессию селектина e. Далее приготовьте е селектин-положительные лейкоциты. Речь идет о KG и человеческих кроветворных прогениторных клетках.

Они выращиваются в суспензии до слияния или имеют тенденцию к шести клеткам на милл в RPMI 1640. Клетки KG one A могут быть дозированы непосредственно из культуры и подсчитаны на гемоцитометре. Реактивная суспензия клеток в соотношении от 10 до шести клеток на милл в HBSS с 10 миллимолярным HEP или HH-буфером, который содержит два миллимоляра хлорида кальция.

Храните клетки на льду до тех пор, пока они не будут проанализированы. Следующие шаги включают подготовку микроскопа, проточной камеры с параллельными пластинами и шприцевого насоса. Для проведения анализа включите микроскоп и шприц-насос.

Выберите объектив с 10-кратным увеличением на микроскопе. Поместите коническую трубку объемом 50 миллилитров в держатель и заполните ее буфером HH с двумя миллимолярами хлорида кальция. Затем поместите пять миллилитровых пластиковых пробирок в держатель внизу.

Далее поместите шприц объемом 60 миллилитров в шприцевую помпу. Убедитесь, что и поршень, и корпус шприца надежно закреплены. Прикрепите трехсторонний стопорный кран к концу шприца 60 мил, а затем пятисторонний стопорный кран к трехпозиционному стопорному крану.

Поместите аппарат с параллельной камерой на предметный столик микроскопа с входной трубкой справа, выходной трубкой слева и вакуумной трубкой сзади. После того, как трубка будет подключена к вакууму, откройте воздушный клапан, чтобы позволить устройству с параллельной пластиной прилипнуть к столику. Это позволит проверить, является ли вакуумная юбка на проточной камере герметичной.

Когда уплотнение будет подтверждено, закройте воздушный клапан. Теперь прикрепите линию выходной трубки к трехстороннему стопорному крану, который уже подключен к шприцу. Теперь аппарат готов к размещению над элементами H-B-M-E-C 60

Включите вакуум, аккуратно опустите проточную камеру аппарата на пластину и дайте аппарату отсосать вниз. Не должно быть никаких звуков выхода воздуха, и в этот момент вам может потребоваться приложить давление к камере, чтобы сжать резиновую прокладку. Как только вакуум будет создан, поместите входную трубку в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Откройте трехходовой стопорный кран к шприцу 60 мил и переведите насос в режим помпы, чтобы удалить воздух из трубопроводов без подъема ячеек на пластине. Используйте набор шприцевых насосов со скоростью два мила в минуту, чтобы наполнить впускную трубку. Затем быстро установите на 0,5 мил в минуту.

Непосредственно перед тем, как жидкость попадет в устройство, очень важно тщательно загрунтовать установку и не допускать появления пузырьков воздуха, которые могут оторвать монослой от пластины. Как только жидкость поступает в шприц 60 мил, проточная камера и шприцевой насос заполняются. Теперь закрепите поток в камере на сцене с помощью куска ленты над каждой из входных, выходных и вакуумных линий.

Это гарантирует, что поле зрения остается постоянным при визуализации и сборе данных. Теперь проточная камера готова к работе. Эти шаги следует повторять для каждого прогона входа ячейки и для каждой новой пластины.

Чтобы запечатлеть события Lucas Site Rolling, откройте элементы NIS на рабочем столе, нажмите значок воспроизведения для просмотра живого изображения. Автоматическая экспозиция позволит вам увидеть пластину и сфокусировать изображение. Убедитесь, что микроскоп правильно сфокусирован на монослое клетки, регулируя фокус на микроскопе вручную.

Как только изображение будет сфокусировано, сбросьте экспозицию до одного кадра в секунду и отрегулируйте свет на микроскопе. Изображение должно появиться на компьютере и больше не должно быть видно в микроскопе. Затем можно отрегулировать световую гистограмму Чтобы удалить фоновую экспозицию или улучшить четкость ячейки, нажмите на корзину «два на два» или «живая корзина», чтобы получить изображение, которое идеально подходит для видеосъемки.

Нажмите на макрос в строке меню и выберите правый порт, выберите порт com три и откройте. Это открывает порт для координации со шприцевым насосом. Теперь проточная камера готова к вливанию пипетки KG one A cells, одного мила KG и одной суспензии A S в пятимиловую пробирку рядом с входной линией трубки.

Затем поместите входную линию на дно пробирки. Перейдите в строку меню и нажмите на «Захват и замедленная съемка». Выберите протокол длительностью 210 секунд.

Это длина программы для прокатки на ячейках H-B-M-E-C 60. Каждая фаза запрограммирована на съемку снимка каждую секунду в течение всего протокола накачки. Он также настроен на отправку команды через порт связи три для запуска насоса.

Установите шприцевой насос в режим программирования, который позволяет вручную программировать определенные скорости потока. Это позволит определить уровни напряжения в камере и продиктовать взаимодействие клеток KG one A с клетками H-B-M-E-C 60. Настройки для этих взаимодействий составляют 4,2 дина на квадратный сантиметр в течение 45 секунд.

Точка три обеда на квадратный сантиметр в течение 60 секунд и шаг в сторону увеличивается каждые 15 секунд до максимума 4,2 обеда на квадратный сантиметр. Теперь микроскоп и компьютер готовы к съемке с интервальной съемкой. Нажмите кнопку запуска на компьютере, чтобы начать сбор данных во время работы программы.

Обязательно добавьте фильтрующий материал в трубку, содержащую ячейки KG one A, чтобы входная выходная трубка была заполнена средой и предотвратить попадание пузырьков воздуха в систему. Если таймлапс прерван, насос не остановится сам по себе и должен быть сброшен. Нажмите «Отмена», чтобы вернуться к текущему изображению.

В качестве отрицательного контроля для этого эксперимента служит нестимулированный монослой эндотелиальных клеток. Для этого введите лейкоциты KG one A в проточную камеру над необработанными клетками H-B-M-E-C 60 для контроля независимости e, стимуляции монослоя эндотелиальных клеток с помощью IL one beta и инфузии лейкоцитов над этими клетками для дальнейшего контроля независимости eect. Обрабатывайте клетки H-B-M-E-C 60 одним бета-антителом IL, а затем антителом против человеческого S-селектина.

Затем проанализируйте события перекатывания лейкоцитов на этих клетках. Скручивание клеток определяется не только селектином S, но и остатками слизичной кислоты на поверхности клеток лейкоцитов. Чтобы продемонстрировать это, расщепляйте KG one A клетки с 0,1 единицами нейраминидазы в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.

Затем проанализируйте события перекатывания на стимулированных клетках H-B-M-E-C 60. Гликопротеины на поверхности лейкоцитов также важны для скручивания клеток. Это можно продемонстрировать, обработав клетки KG one A 0,2 единицами на миллиметровую полосу в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, а затем введя их в проточную камеру.

После того, как временная последовательность получена, данные готовы к анализу. Сохраните данные и перейдите на вкладку измерения в строке меню и выберите определенный порог. Переместите полосы так, чтобы нужные ячейки были окрашены в красный цвет, выберите все изображения, а затем окей, теперь вся последовательность покадровой съемки должна быть изменена видимыми красными подвижными ячейками.

Перейдите к измерению и выберите ограничения. Это позволяет пользователю исключить пороговые объекты, которые не представляют подвижные ячейки. В первую очередь это фон, создаваемый монослоем H-B-M-E-C 60 для выбора области и ввода минимальных и максимальных значений, которые идеально подходят для катящихся лейкоцитов.

Повторите этот шаг для удлинения и круглости: Выберите измерение, а затем выберите Создать двоичный файл с ограничениями. Те же значения ограничения, которые были установлены на предыдущем шаге, теперь будут использоваться для оптимизации программного обеспечения NIS elements для распознавания катящихся лейкоцитов на монослое эндотелиальных клеток. Вернитесь к измерению, выберите данные поля, а затем выберите сброс данных.

Закройте меню, вернитесь к измерению и выберите поле сканирования, откройте данные поля измерения и выберите количество или объекты. Затем выберите все поля и экспортируйте данные в Microsoft Excel. Наконец, выберите «Очистить данные».

Элементы NIS теперь готовы к сбору дополнительных данных. Эти репрезентативные данные показывают, как взаимодействия эндотелиальных клеток лейкоцитов реагируют на физиологический стресс, в частности, проверяя роль адгезивного лиганда. E selectin.

Сильное скручивание лейкоцитов происходит, когда эндотелиальные клетки предварительно стимулируются IL one beta. При сравнении этого результата с нестимулированным контролем становится ясно, что перекатывание клеток зависит от стимуляции цитокинов. При обработке клеток H-B-M-E-C 60 одним бета-излучением IL, а затем антителом к человеческому Е-селектину, становится ясно, что скручивание клеток зависит именно от е-селектина.

Этот анализ может быть использован и для проверки других параметров. Например, когда стимулированные клетки предварительно обрабатываются сасе или бролином, результаты менее надежны. Эти данные подчеркивают важность остатков концевых слизиковых кислот, а также гликопротеинов клеточной поверхности.

Что касается активности S-селектинового лиганда, мы только что показали вам, как анализировать адгезивные взаимодействия на основе селектина между лейкоцитами и эндотелиальными клетками в условиях, которые имитируют силы, присутствующие в посткапиллярном вениале, области системы циркуляции, где лейкоциты покидают кровь и попадают в ткани. При выполнении этой процедуры важно помнить об использовании соответствующего блокирующего антитела или ферментативного контроля для подтверждения необходимости соответствующего селектина и его лиганда в этой системе анализа. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.