Анализ Физиологические E-селектин-опосредованной лейкоцитов Роллинг на микрососудистой эндотелия

В данном видео демонстрируется анализ в камере с параллельными пластинами для изучения факторов, вызывающих роллинг лейкоцитов на поверхности эндотелиальных клеток. Монослои эндотелиальных клеток стимулируют провоспалительным цитокином IL-1β для повышения экспрессии S-селектина. Затем камера с параллельными пластинами помещается поверх эндотелиальных клеток, и через монослой вводят лейкоциты, экспрессирующие S-селектин.

Таким образом, клеточные взаимодействия в камере подвергаются напряжению сдвига, которое аналогично напряжению при адгезии лейкоцитов в посткапиллярных венозлах. Процессы роллинга регистрируются и подсчитываются с помощью элементов NIS для анализа зависимости от E-селектина. Здравствуйте, я Джордж Вайс из лаборатории доктора Чарльза де Нитро на кафедре дерматологии в больнице Бригхэм и женщин при Гарвардской медицинской школе.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа роли E-селектина и лигандов E-селектина в адгезии лейкоцитов человека к эндотелиальным клеткам костного мозга человека в условиях физиологического кровотока. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения роли молекул клеточной поверхности, которые инициируют адгезию лейкоцитов или метастатических раковых клеток к эндотелиальным клеткам, выстилающим внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Данный процесс адгезии характеризуется поведением в виде «качения», напоминающим движение шара по дорожке для боулинга.

Итак, приступим. Первым этапом данной процедуры является подготовка эндотелиальных клеток, которые будут выстилать камеру для потока. В этом протоколе используются клетки H-B-M-E-C 60, полученные из костного мозга человека.

Чашки для культивирования микрососудистого русла должны быть предварительно покрыты фибронектином. Для этого инкубируют 35-миллилитровые чашки для культивирования тканей с PBS, содержащим 20 µg/ml фибронектина. Инкубацию можно проводить в течение ночи при 4 °C или в течение трех часов при 37 °C. Клетки H-B-M-E-C 60 суспендируют в среде 1 99 и высевают из расчета 10⁵ клеток на чашку, выращивая культуры до достижения более 90% конфлюэнтности.

Для повышения экспрессии E-селектина потребуется около двух дней. Аспирируйте ростовую среду и добавьте свежую среду, содержащую 50 нг/мл IL-1β; инкубируйте в течение четырех-шести часов. Теперь монослои клеток готовы к анализу в проточной камере. Дополнительные планшеты с клетками HBMEC можно стимулировать IL-1β и обработать нейтрализующими антителами к человеческому E-селектину в концентрации 20 мкг/мл в течение одного часа при 37 °C.

Это позволит контролировать функциональную экспрессию e-селектина. Далее подготовьте лейкоциты, положительные по e-селектину. Это клетки KG-1, предшественники гемопоэтических клеток человека.

Их выращивают в суспензии до достижения конфлюэнтности или до плотности 6*10⁵ клеток/мл в среде RPMI 1640. Клетки KG-1A можно переносить пипеткой непосредственно из культуры и подсчитывать с помощью гемоцитометра. Ресуспендируйте клетки до концентрации 6*10⁵ клеток/мл в растворе HBSS с 10 мМ HEPES или в HH-буфере, содержащем 2 мМ хлорида кальция.

Храните клетки на льду до начала анализа. Следующие этапы включают подготовку микроскопа, параллельной пластинчатой проточной камеры и шприцевого насоса. Для проведения анализа включите микроскоп и шприцевой насос.

Выберите объектив с увеличением 10x на микроскопе. Поместите коническую пробирку объемом 50 миллилитров в держатель и наполните ее буфером HH с 2 мМ хлорида кальция. Затем установите ниже в держатель пластиковые пробирки объемом пять миллилитров.

Затем поместите шприц объемом 60 мл в шприцевой насос. Убедитесь, что both plunger и корпус шприца надежно зафиксированы. Присоедините трехходовой кран к концу шприца объемом 60 мл, а затем к этому крану подсоедините шприц объемом 5 мл.

Поместите аппарат с камерой параллельного потока на предметный столик микроскопа так, чтобы входная трубка находилась справа, выходная трубка — слева, а вакуумная трубка — сзади. После подключения трубок к вакуумному насосу откройте воздушный клапан, чтобы аппарат с параллельными пластинами плотно прилегал к столику. Это позволит проверить герметичность вакуумного уплотнения камеры потока.

После подтверждения герметичности закройте воздушный клапан. Теперь подсоедините выходную трубку к трехходовому крану, который уже подключен к шприцу. Теперь аппарат готов к установке над клетками H-B-M-E-C 60.

Включите вакуум, аккуратно опустите установку с потоковой камерой на планшет и дождитесь создания вакуума. Звуков утечки воздуха быть не должно; на этом этапе может потребоваться приложить давление к камере, чтобы сжать резиновую прокладку. После установления вакуума поместите входную трубку в коническую пробирку объемом 50 мл.

Откройте трехходовой кран, ведущий к шприцу объемом 60 мкл, и переведите насос в режим перекачки (pump mode), чтобы удалить воздух из линий, не поднимая клетки на планшете. Используйте шприцевой насос, установив скорость 2 мкл/мин, для заполнения заборной трубки. Затем быстро переключите скорость на 0,5 мкл/мин.

Непосредственно перед подачей жидкости в аппарат крайне важно тщательно подготовить установку и избежать появления пузырьков воздуха, которые могут привести к отрыву монослоя от пластины. Как только жидкость поступит в шприц объемом 60 мил, проточная камера и шприцевой насос будут считаться заполненными. Теперь закрепите проточную камеру на предметном столике, приклеив кусочек скотча поверх каждой из входных, выходных и вакуумных линий.

Это гарантирует постоянство поля зрения при визуализации и сборе данных. Теперь проточная камера готова к использованию. Эти шаги следует повторять для каждого цикла подачи клеток и для каждого нового планшета.

Для регистрации событий перекатывания в сайтах Лукаса откройте программу NIS elements на рабочем столе и нажмите значок воспроизведения для получения изображения в реальном времени. Автоматическая экспозиция позволит вам увидеть планшет и сфокусировать изображение. Убедитесь, что микроскоп правильно сфокусирован на монослое клеток, отрегулировав фокус вручную на микроскопе.

Как только изображение будет сфокусировано, установите экспозицию на один кадр в секунду и отрегулируйте освещение микроскопа. Изображение должно появиться на компьютере и больше не быть видимым в окуляре микроскопа. Затем можно настроить гистограмму света. Чтобы устранить фоновую засветку или повысить четкость клеток, нажмите «two by two bin» или «live bin», чтобы получить изображение, оптимальное для записи видео.

Нажмите «macro» на панели меню, выберите «right to port», затем выберите порт «com three» и нажмите «open». Это откроет порт для синхронизации с шприцевым насосом. Теперь проточная кювета готова к инфузии клеток KG-1A. Перенесите пипеткой 1 mL суспензии KG-1A в пробирку объемом 5 mL, расположенную рядом с входной трубкой.

Затем опустите входную линию на дно пробирки. Перейдите в строку меню и выберите «capture» (захват), а затем «time lapse acquisition» (регистрация в режиме таймлапс). Выберите протокол продолжительностью 210 секунд.

Это длительность программы для анализа адгезии клеток H-B-M-E-C 60. На каждой фазе запрограммирована съемка одного кадра каждую секунду в течение всего протокола работы насоса. Также программа настроена на отправку команды через порт COM3 для запуска насоса.

Переведите шприцевой насос в режим программирования, который позволяет вручную задавать определенную скорость потока. Это определит уровень напряжения сдвига в камере и продиктует взаимодействие клеток KG one A с клетками H-B-M-E-C 60. Параметры для этих взаимодействий составляют 4,2 dines per centimeter squared в течение 45 секунд.

Значение 3 дина на квадратный сантиметр удерживается в течение 60 секунд, после чего каждые 15 секунд происходит ступенчатое увеличение до максимума 4,2 дина на квадратный сантиметр. Теперь микроскоп и компьютер готовы к проведению таймлапс-съемки. Нажмите «start run» на компьютере, чтобы начать сбор данных во время выполнения программы.

Обязательно добавьте среду в пробирку с клетками KG one A, чтобы входные и выходные трубки оставались заполненными средой и чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в систему. Если таймлапс будет прерван, насос не остановится автоматически и потребует сброса. Нажмите «Отмена», чтобы вернуться к изображению в реальном времени.

Нестимулированный монослой эндотелиальных клеток служит отрицательным контролем для данного эксперимента. Для этого проведите инфузию лейкоцитов KG-1A в проточную камеру поверх необработанных клеток HBMEC-60 для контроля независимости от E-селектина, затем стимулируйте монослой эндотелиальных клеток IL-1β и проведите инфузию лейкоцитов поверх этих клеток для дополнительного контроля независимости от эффекта. Обработайте клетки HBMEC-60 с помощью IL-1β, а затем с помощью антител к человеческому P-селектину.

Затем проанализируйте события роллинга лейкоцитов на этих клетках. Роллинг клеток определяется не только S-селектином, но и остатками сиаловой кислоты на поверхности лейкоцитов. Чтобы продемонстрировать это, обработайте клетки KG one A нейраминидазой в концентрации 0.1 units per mil в течение одного часа при 37 °C.

Затем проанализируйте события роллинга на стимулированных клетках H-B-M-E-C 60. Гликопротеины на поверхности лейкоцитов также имеют важное значение для роллинга клеток. Это можно продемонстрировать, обработав клетки KG one A 0.2 units per mil бромелина в течение одного часа при 37 °C с последующим введением их в проточную камеру.

После получения временной последовательности данные готовы к анализу. Сохраните данные, перейдите на вкладку «Measure» (Измерение) на панели меню и выберите «Defined Threshold» (Заданный порог). Перемещайте ползунки так, чтобы нужные клетки окрасились в красный цвет, выберите все изображения и нажмите «OK»; теперь вся последовательность таймлапса должна быть изменена, и на ней будут видны перемещающиеся красные клетки.

Перейдите в раздел measure и выберите restrictions. Это позволяет пользователю исключить пороговые объекты, которые не представляют собой катящиеся клетки. В первую очередь это фоновый шум, создаваемый монослоем H-B-M-E-C 60; выделите область и введите минимальные и максимальные значения, которые являются оптимальными для катящихся лейкоцитов.

Повторите этот шаг для определения удлинения и округлости: выберите measure, затем выберите create binary using restrictions. Те же значения ограничений, которые были установлены на предыдущем этапе, теперь будут использованы для оптимизации программного обеспечения NIS elements с целью распознавания катящихся лейкоцитов на монослое эндотелиальных клеток. Вернитесь в measure, выберите field data, а затем выберите reset data.

Закройте меню, вернитесь к измерению и выбору поля сканирования, откройте данные о поле измерения и выберите количество объектов. Затем выберите все поля и экспортируйте данные в Microsoft Excel. В завершение выберите команду очистки данных.

Элементы NIS теперь готовы к дальнейшему сбору данных. Эти репрезентативные данные демонстрируют, как взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными клетками реагируют на физиологическое напряжение сдвига, в частности, при проверке роли адгезивного лиганда E-селектина.

Интенсивный роллинг лейкоцитов наблюдается при предварительной стимуляции эндотелиальных клеток IL-1β. При сравнении этого результата с нестимулированным контролем становится очевидно, что роллинг клеток зависит от стимуляции цитокинами. Обработка клеток HBMEC-60 IL-1β с последующим применением антител к человеческому E-селектину показывает, что роллинг клеток специфически зависит от E-селектина.

Данный анализ может быть использован и для проверки других параметров. Например, при предварительной обработке стимулированных клеток сиалидазой или бролином результаты становятся менее выраженными. Эти данные подчеркивают важность терминальных остатков сиаловой кислоты, а также гликопротеинов клеточной поверхности.

Что касается активности лигандов S-селектина, мы только что продемонстрировали вам способ анализа адгезивных взаимодействий с участием E-селектина между лейкоцитами и эндотелиальными клетками в условиях, имитирующих силы, действующие в пост capillaрях венул — области системы кровообращения, где лейкоциты покидают кровяное русло и проникают в ткани. При выполнении данной процедуры важно не забывать использовать соответствующий блокирующий антитело или контроль с ферментативной обработкой, чтобы подтвердить необходимость участия соответствующего селектина и его лиганда в данной системе анализа. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.