Экстракция биомаркеров из отложений - ускоренная экстракция растворителем
Источник: Лаборатория Джеффа Салакапа - Массачусетский университет в Амхерсте
Было обнаружено, что распределение группы органических биомаркеров, назы…
1. Сбор необходимых материалов
- Извлеките образцы. Образцы (в данном случае осадок) замораживаются, лиофилизируются, измельчаются и гомогенизируются перед экстракцией, а также извлекаются группами для достижения максимальной эффективности.
- В зависимости от размера образца используют коллекционные флаконы объемом 40 или 60 мл. Для этого эксперимента используются флаконы из боросиликатного стекла (40 мл) и безопасные для растворителей колпачки. Перед этим сожгите флаконы, пипетки из боросиликатного стекла и весовые банки при температуре 550 °C в течение 6 часов, чтобы обеспечить удаление возможных органических загрязнений.
- Дихлорметан (DCM) и метанол широко распространены в большинстве лабораторий органической геохимии. Используйте их по отдельности (сначала метанол, а затем DCM) для ополаскивания лабораторных инструментов и стеклянной посуды перед использованием. Смесь дихлорметана и метанола (MeOH; 9:1) используется во многих лабораториях для эффективного извлечения биомаркеров с широким диапазоном полярностей. Растворители не должны содержать органических загрязнителей.
- Приобретите ускоренный экстрактор растворителей для использования в этом эксперименте.
2. Подготовка образцов клеток
- Соберите ячейку для каждого образца, который нужно извлечь, плюс одну заготовку.
- Для каждой ячейки прикрутите торцевую крышку к одному концу корпуса ячейки.
- Поместите фильтр из сгоревшего стекловолокна на верхнюю часть каждой ячейки с помощью пинцета, промытого растворителем. Затем аккуратно и медленно вдавите фильтр в ячейку с помощью поршня фильтра.
- Пометьте тела ячеек по номерам (, например, 1 - 22) для каждого образца и напишите "blank" на пустой ячейке.
- Заполните заготовку диатомовой землей (или песком) и накройте крышкой со вторым торцевым колпачком. Затяните вручную.
3. Подготовка образцов
- Положите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и держите в таре.
- Промойте лабораторный шпатель растворителем, затем используйте его для переноса соответствующей массы образца в банку для взвешивания и запишите массу.
- Масса образца варьируется в зависимости от содержания в нем органического вещества. Для относительно органического материала (морская грязь) может потребоваться несколько граммов, в то время как для материала, богатого органическим веществом (ткань листьев), может потребоваться гораздо меньше.
- Перенесите весь материал из весовой банки в подготовленную ячейку ASE.
- Поместите еще один фильтр из стекловолокна на верхнюю часть ячейки, затем медленно и осторожно надавите, пока он не достигнет верхней части образца с помощью поршня фильтра.
- Добавляйте в ячейку диатомовую землю (или песок) до тех пор, пока она почти не заполнится. Будьте осторожны, чтобы удалить любой мусор с нитей тела клетки.
- Закройте верхнюю часть ячейки еще одной торцевой заглушкой.
- Повторите шаги 3.1 - 3.6 для каждого образца.
4. Приготовление флаконов для сбора
- Пометьте каждый флакон номером соответствующей ячейки (, например, 1 - 22 или пустой) и накройте крышкой колпачка для сбора ASE.
5. Извлечение
- Поместите каждую ячейку образца в пронумерованный слот на верхнем лотке ASE.
- Поместите соответствующий флакон для сбора в слот с тем же номером на нижнем лотке ASE.
- Создайте метод извлечения с помощью клавиатуры на ASE. Экстрагируйте при 100 °C и давлении 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Извлеките каждый образец 3 раза со статической выдержкой в течение 10 минут и промойте тело клетки на 50% от его общего объема между статическими удержаниями.
- Убедитесь, что флакон с растворителем содержит достаточно растворителя для извлечения всех образцов.
- Промойте ASE 3 раза перед началом прогона, нажав кнопку «Промывка» на панели управления ASE.
- Нажмите «Пуск».
Ускоренная экстракция растворителем — это быстрый, эффективный и высокопроизводительный метод, используемый для отделения органических биомаркеров от большого количества образцов геологических отложений.
Традиционно используются методы экстракции, такие как ультразвуковая обработка или метод Сокслета, однако недостатком этих протоколов является то, что они слишком медленны для обработки достаточного количества материала для детальной палеоклиматической реконструкции. Более новая технология, метод ускоренной экстракции растворителем, или метод ASE, была разработана с учетом эффективности и высокой производительности.
Метод ASE использует комбинацию высоких температур и высокого давления для извлечения образцов и может выполнять несколько образцов за один относительно быстрый цикл подготовки.
Это видео является третьим в серии, подробно описывающей, как извлечь биомаркеры из отложений. В нем будет рассмотрена процедура и дано представление о преимуществах ASE по сравнению с ультразвуковой обработкой или экстракцией по методу Сокслета.
При ускоренной экстракции растворителем образцы загружаются в стальные ячейки, которые затем загружаются на карусель. Коллекционные флаконы для каждой ячейки с образцом также загружаются на отдельную карусель. Прибор загружает ячейку с образцом во внутреннюю печь. Растворитель перекачивается из бутылки с растворителем через ряд клапанов до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное давление.
Это давление поддерживается в течение времени, продиктованного образцом и анализируемым веществом. Затем растворитель вымывается из ячейки образца через стальную линию в соответствующую пробирку для сбора. Процесс можно повторять несколько раз. Температура, давление и продолжительность могут быть настроены в зависимости от образца.
Используемая высокая температура увеличивает кинетику экстракции, в то время как высокое давление предотвращает испарение растворителя. Флакон для сбора теперь содержит общий липидный экстракт, а то, что осталось в ячейке образца, называется остатком. Он включает в себя неорганические материалы, а также органические материалы, которые не экстрагируются растворителями, называемые керогенами.
Теперь, когда мы знакомы с принципами ускоренной экстракции растворителем, давайте рассмотрим, как это осуществляется в лаборатории.
После сбора интересующих образцов; Сублимационная сушка, гомогенизация и обеззараживание, как показано в другом видео этой серии.
После того, как все образцы будут подготовлены, соберите по ячейке для каждого из них, который нужно извлечь, и еще одну для заготовки. Для этого на корпус клетки накручивают торцевую крышку. Используя пинцет, промытый растворителем, поместите фильтр из сгоревшего стекловолокна поверх каждого из них. Медленно и осторожно нажмите на фильтр с помощью поршня.
Пометьте тела клеток по номерам для каждого образца, а бланк пометьте отдельно. Поместите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и держите их в таре. Промойте шпатель растворителем, затем с его помощью переложите от 5 до 10 г образца в форму для взвешивания и запишите массу.
Перенесите весь материал из весовой банки в соответствующую ячейку. Поместите сверху еще один фильтр из стекловолокна и осторожно утрамбуйте, пока он не достигнет верхней части образца.
Добавляйте диспергатор, такой как диатомовая земля или песок, пока он почти не заполнится, стараясь не допустить попадания мусора в нити тела клетки. Закройте верхнюю часть ячейки еще одной торцевой заглушкой. Повторите эти действия для каждого образца и заготовки.
Пометьте каждый флакон для сбора номером соответствующей ячейки образца или заготовки, а также накройте крышкой флакона. Поместите каждую ячейку в пронумерованный слот на верхнем лотке ASE. Установите параметры метода извлечения с помощью клавиатуры на ASE для извлечения при 100 ? С и 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Извлеките каждый образец 3 раза со статической фиксацией в течение 10 минут и промойте тело клетки на 50% от его общего объема между статическими удержаниями.
Затем убедитесь, что флакон с растворителем содержит достаточно для извлечения всех образцов. Промойте трубопроводы приборов 3 раза перед началом бега. Наконец, нажмите «Пуск».
Извлеките флакон из ASE. Теперь, когда биомаркеры извлечены, они должны быть очищены перед анализом.
Ускоренная экстракция растворителем — это универсальный метод, который может быть использован для различных применений, некоторые из которых рассмотрены здесь.
Ускоренная экстракция растворителем также может быть использована на других типах образцов, включая пищевые. Анализ остатков для проверки на загрязнение пестицидами часто проводится на регулирующих и промышленных предприятиях для определения безопасности и качества пищевых продуктов, таких как фрукты или овощи. ASE может быть использован для извлечения хлорорганических пестицидов из образцов пищевых продуктов и определения типов или уровней остатков, присутствующих в продуктах. Эта информация затем может быть использована для определения того, пригодна ли продукция для потребления человеком или животными. Например, дильдрин должен содержаться в пище в диапазоне от 0 до 0,1 частей на миллион, в зависимости от продукта.
Пищевые питательные компоненты также могут быть экстрагированы с помощью ASE. Например, можно экстрагировать такие продукты, как шоколад, которые могут иметь высокое гравиметрическое содержание жира. Используя ASE с петролейным эфиром в качестве растворителя, жир может быть отделен от образцов шоколада и подвергнут количественному анализу для определения точного процентного содержания жира на известное количество шоколада. Используя эту информацию, регулирующие органы могут проверить заявления производителей шоколада, или производители могут получить информацию для создания точных этикеток на продуктах питания.
Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию липидных биомаркеров с помощью ускоренной экстракции растворителем, или ASE. С методами дальнейшей обработки и анализа можно ознакомиться в последующих видеороликах.
Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.