Экстракция биомаркеров из отложений - ускоренная экстракция растворителем

Extraction of Biomarkers from Sediments – Accelerated Solvent Extraction

JoVE Science Education
Earth Science

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Earth Science

Extraction of Biomarkers from Sediments – Accelerated Solvent Extraction

3.8: An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

3.13: Conversion of Fatty Acid Methyl Esters by Saponification for U^k’₃₇ Paleothermometry

10,174 Views

•

06:42 min

•

February 27, 2015

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Overview

Источник: Лаборатория Джеффа Салакапа – Массачусетский университет в Амхерсте

Было обнаружено, что распределение группы органических биомаркеров, называемых глицерин-диалкилглицерин-тетраэфирами (GDGTs), продуцируемых свитой архей и бактерий, предсказуемо изменяется в ответ на температуру воздуха или воды^1,2. Таким образом, распределение этих биомаркеров в последовательности отложений известного возраста может быть использовано для реконструкции эволюции температуры воздуха и/или воды в масштабах десятилетий и тысячелетий (Рисунок 1). Создание длинных записей с высоким разрешением о прошлом климате, называемых палеоклиматологией, зависит от быстрого анализа сотен, а возможно, и тысяч образцов. Старые методы экстракции, такие как ультразвуковая обработка или Сокслет, слишком медленные. Тем не менее, новый метод ускоренной экстракции растворителем был разработан с учетом эффективности.

Рисунок 1. Пример палеоклиматической летописи, показывающей изменения температуры поверхности моря (ТПМ) в восточной части Средиземного моря за последние ~27 000 лет³. Эта запись содержит ~115 образцов и основана на изопреноидальном прокси TEX₈₆ SST на основе изопреноидала.

Principles

Ускоренная экстракция растворителем – это метод экстракции, зарегистрированный под торговой маркой (Thermo Scientific Dionex), который использует высокие температуры (~100 °C) и давления (~1,200 фунтов на квадратный дюйм) для увеличения кинетики процесса экстракции. Экстрактор, называемый ускоренным экстрактором растворителей (ASE) (рис. 2), может вмещать до 24 отдельных образцов. После загрузки ASE и его запуска он полностью автоматизирован. ASE позволяет осуществлять электронное управление всем процессом экстракции: температура экстракции, давление, объем растворителя, смесь растворителей, продолжительность, промывка и повторение регулируются от образца к образцу. Большинство лабораторий органической геохимии в настоящее время используют ASE в качестве стандартного метода экстракции растворителем.

Рисунок 2. Ускоренный экстрактор растворителей (ASE).

Ускоренная экстракция растворителем — это быстрый, эффективный и высокопроизводительный метод, используемый для отделения органических биомаркеров от большого количества образцов геологических отложений.

Традиционно используются методы экстракции, такие как ультразвуковая обработка или метод Сокслета, однако недостатком этих протоколов является то, что они слишком медленны для обработки достаточного количества материала для детальной палеоклиматической реконструкции. Более новая технология, метод ускоренной экстракции растворителем, или метод ASE, была разработана с учетом эффективности и высокой производительности.

Метод ASE использует комбинацию высоких температур и высокого давления для извлечения образцов и может выполнять несколько образцов за один относительно быстрый цикл подготовки.

Это видео является третьим в серии, подробно описывающей, как извлечь биомаркеры из отложений. В нем будет рассмотрена процедура и дано представление о преимуществах ASE по сравнению с ультразвуковой обработкой или экстракцией по методу Сокслета.

При ускоренной экстракции растворителем образцы загружаются в стальные ячейки, которые затем загружаются на карусель. Коллекционные флаконы для каждой ячейки с образцом также загружаются на отдельную карусель. Прибор загружает ячейку с образцом во внутреннюю печь. Растворитель перекачивается из бутылки с растворителем через ряд клапанов до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное давление.

Это давление поддерживается в течение времени, продиктованного образцом и анализируемым веществом. Затем растворитель вымывается из ячейки образца через стальную линию в соответствующую пробирку для сбора. Процесс можно повторять несколько раз. Температура, давление и продолжительность могут быть настроены в зависимости от образца.

Используемая высокая температура увеличивает кинетику экстракции, в то время как высокое давление предотвращает испарение растворителя. Флакон для сбора теперь содержит общий липидный экстракт, а то, что осталось в ячейке образца, называется остатком. Он включает в себя неорганические материалы, а также органические материалы, которые не экстрагируются растворителями, называемые керогенами.

Теперь, когда мы знакомы с принципами ускоренной экстракции растворителем, давайте рассмотрим, как это осуществляется в лаборатории.

После сбора интересующих образцов сублимационную сушку, гомогенизацию и обеззараживание, как показано в другом видео этой серии.

После того, как все образцы будут подготовлены, соберите по ячейке для каждого из них, который нужно извлечь, и еще одну для заготовки. Для этого на корпус клетки накручивают торцевую крышку. Используя пинцет, промытый растворителем, поместите фильтр из сгоревшего стекловолокна поверх каждого из них. Медленно и осторожно надавите на фильтр с помощью поршня.

Пометьте тела клеток по номерам для каждого образца, а бланк промаркируйте отдельно. Поместите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и тару. Промойте шпатель растворителем, затем с его помощью переложите от 5 до 10 г образца в форму для взвешивания и запишите массу.

Перенесите весь материал из весовой банки в соответствующую ячейку. Поместите сверху еще один фильтр из стекловолокна и осторожно утрамбуйте, пока он не достигнет верхней части образца.

Добавляйте диспергатор, такой как диатомовая земля или песок, пока он почти не заполнится, стараясь не допустить попадания мусора в нити тела клетки. Закройте верхнюю часть ячейки еще одной торцевой заглушкой. Повторите эти действия для каждого образца и заготовки.

Пометьте каждый флакон для сбора номером соответствующей ячейки образца или заготовки, а также накройте крышкой флакона. Поместите каждую ячейку в пронумерованный слот на верхнем лотке ASE. Задайте параметры метода экстракции с помощью клавиатуры на ASE для экстракции при температуре 100 °C и давлении 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Извлеките каждый образец 3 раза со статической фиксацией в течение 10 минут и промойте тело клетки на 50% от его общего объема между статическими удержаниями.

Затем убедитесь, что флакон с растворителем содержит достаточно для извлечения всех образцов. Промойте трубопроводы инструментов 3 раза перед началом прогона. Наконец, нажмите «Пуск».

Извлеките флакон из ASE. Теперь, когда биомаркеры извлечены, они должны быть очищены перед анализом.

Ускоренная экстракция растворителем — это универсальный метод, который может быть использован для различных применений, некоторые из которых рассмотрены здесь.

Ускоренная экстракция растворителем также может быть использована на других типах образцов, включая пищевые. Анализ остатков для проверки на загрязнение пестицидами часто проводится на регулирующих и промышленных предприятиях для определения безопасности и качества пищевых продуктов, таких как фрукты или овощи. ASE может быть использован для извлечения хлорорганических пестицидов из образцов пищевых продуктов и определения типов или уровней остатков, присутствующих в продуктах. Эта информация затем может быть использована для определения того, пригодна ли продукция для потребления человеком или животными. Например, дильдрин должен содержаться в пище в диапазоне от 0 до 0,1 частей на миллион, в зависимости от продукта.

Пищевые питательные компоненты также могут быть экстрагированы с помощью ASE. Например, можно экстрагировать такие продукты, как шоколад, которые могут иметь высокое гравиметрическое содержание жира. Используя ASE с петролейным эфиром в качестве растворителя, жир может быть отделен от образцов шоколада и подвергнут количественному анализу для определения точного процентного содержания жира на известное количество шоколада. Используя эту информацию, регулирующие органы могут проверить заявления производителей шоколада, или производители могут получить информацию для создания точных этикеток на продуктах питания.

Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию липидных биомаркеров с помощью ускоренной экстракции растворителем, или ASE. С методами дальнейшей обработки и анализа можно ознакомиться в последующих видеороликах.

Спасибо за просмотр!

Procedure

1. Сбор необходимых материалов

Извлеките образцы. Образцы (в данном случае осадок) замораживаются, лиофилизируются, измельчаются и гомогенизируются перед экстракцией, а также извлекаются группами для достижения максимальной эффективности.
В зависимости от размера образца используют коллекционные флаконы объемом 40 или 60 мл. Для этого эксперимента используются флаконы из боросиликатного стекла (40 мл) и безопасные для растворителей колпачки. Перед этим сожгите флаконы, пипетки из боросиликатного стекла и весовые банки при температуре 550 °C в течение 6 часов, чтобы обеспечить удаление возможных органических загрязнений.
Дихлорметан (DCM) и метанол широко распространены в большинстве лабораторий органической геохимии. Используйте их по отдельности (сначала метанол, а затем DCM) для ополаскивания лабораторных инструментов и стеклянной посуды перед использованием. Смесь дихлорметана и метанола (MeOH; 9:1) используется во многих лабораториях для эффективного извлечения биомаркеров с широким диапазоном полярностей. Растворители не должны содержать органических загрязнителей.
Приобретите ускоренный экстрактор растворителей для использования в этом эксперименте.

2. Подготовка образцов клеток

Соберите ячейку для каждого образца, который нужно извлечь, плюс одну заготовку.
1. Для каждой ячейки прикрутите торцевую крышку к одному концу корпуса ячейки.
2. Поместите фильтр из сгоревшего стекловолокна на верхнюю часть каждой ячейки с помощью пинцета, промытого растворителем. Затем аккуратно и медленно вдавите фильтр в ячейку с помощью поршня фильтра.
3. Пометьте тела ячеек по номерам (, например, 1 – 22) для каждого образца и напишите “blank” на пустой ячейке.
4. Заполните заготовку диатомовой землей (или песком) и накройте крышкой со вторым торцевым колпачком. Затяните вручную.

3. Подготовка образцов

Положите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и держите в таре.
Промойте лабораторный шпатель растворителем, затем используйте его для переноса соответствующей массы образца в банку для взвешивания и запишите массу.
1. Масса образца варьируется в зависимости от содержания в нем органического вещества. Для относительно органического материала (морская грязь) может потребоваться несколько граммов, в то время как для материала, богатого органическим веществом (ткань листьев), может потребоваться гораздо меньше.
Перенесите весь материал из весовой банки в подготовленную ячейку ASE.
Поместите еще один фильтр из стекловолокна на верхнюю часть ячейки, затем медленно и осторожно надавите, пока он не достигнет верхней части образца с помощью поршня фильтра.
Добавляйте в ячейку диатомовую землю (или песок) до тех пор, пока она почти не заполнится. Будьте осторожны, чтобы удалить любой мусор с нитей тела клетки.
Закройте верхнюю часть ячейки еще одной торцевой заглушкой.
Повторите шаги 3.1 – 3.6 для каждого образца.

4. Приготовление флаконов для сбора

Пометьте каждый флакон номером соответствующей ячейки (, например, 1 – 22 или пустой) и накройте крышкой колпачка для сбора ASE.

5. Извлечение

Поместите каждую ячейку образца в пронумерованный слот на верхнем лотке ASE.
Поместите соответствующий флакон для сбора в слот с тем же номером на нижнем лотке ASE.
Создайте метод извлечения с помощью клавиатуры на ASE. Экстрагируйте при 100 °C и давлении 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Извлеките каждый образец 3 раза со статической выдержкой в течение 10 минут и промойте тело клетки на 50% от его общего объема между статическими удержаниями.
Убедитесь, что флакон с растворителем содержит достаточно растворителя для извлечения всех образцов.
Промойте ASE 3 раза перед началом прогона, нажав кнопку «Промывка» на панели управления ASE.
Нажмите «Пуск».

Ускоренная экстракция растворителем — это быстрый, эффективный и высокопроизводительный метод, используемый для отделения органических биомаркеров от большого количества образцов геологических отложений.

Традиционно используются методы экстракции, такие как ультразвуковая обработка или метод Сокслета, однако недостатком этих протоколов является то, что они слишком медленны для обработки достаточного количества материала для детальной палеоклиматической реконструкции. Более новая технология, метод ускоренной экстракции растворителем, или метод ASE, была разработана с учетом эффективности и высокой производительности.

Метод ASE использует комбинацию высоких температур и высокого давления для извлечения образцов и может выполнять несколько образцов за один относительно быстрый цикл подготовки.

Это видео является третьим в серии, подробно описывающей, как извлечь биомаркеры из отложений. В нем будет рассмотрена процедура и дано представление о преимуществах ASE по сравнению с ультразвуковой обработкой или экстракцией по методу Сокслета.

При ускоренной экстракции растворителем образцы загружаются в стальные ячейки, которые затем загружаются на карусель. Коллекционные флаконы для каждой ячейки с образцом также загружаются на отдельную карусель. Прибор загружает ячейку с образцом во внутреннюю печь. Растворитель перекачивается из бутылки с растворителем через ряд клапанов до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное давление.

Это давление поддерживается в течение времени, продиктованного образцом и анализируемым веществом. Затем растворитель вымывается из ячейки образца через стальную линию в соответствующую пробирку для сбора. Процесс можно повторять несколько раз. Температура, давление и продолжительность могут быть настроены в зависимости от образца.

Используемая высокая температура увеличивает кинетику экстракции, в то время как высокое давление предотвращает испарение растворителя. Флакон для сбора теперь содержит общий липидный экстракт, а то, что осталось в ячейке образца, называется остатком. Он включает в себя неорганические материалы, а также органические материалы, которые не экстрагируются растворителями, называемые керогенами.

Теперь, когда мы знакомы с принципами ускоренной экстракции растворителем, давайте рассмотрим, как это осуществляется в лаборатории.

После сбора интересующих образцов; Сублимационная сушка, гомогенизация и обеззараживание, как показано в другом видео этой серии.

После того, как все образцы будут подготовлены, соберите по ячейке для каждого из них, который нужно извлечь, и еще одну для заготовки. Для этого на корпус клетки накручивают торцевую крышку. Используя пинцет, промытый растворителем, поместите фильтр из сгоревшего стекловолокна поверх каждого из них. Медленно и осторожно надавите на фильтр с помощью поршня.

Пометьте тела клеток по номерам для каждого образца, а бланк промаркируйте отдельно. Поместите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и тару. Промойте шпатель растворителем, затем с его помощью переложите от 5 до 10 г образца в форму для взвешивания и запишите массу.

Перенесите весь материал из весовой банки в соответствующую ячейку. Поместите сверху еще один фильтр из стекловолокна и осторожно утрамбуйте, пока он не достигнет верхней части образца.

Добавляйте диспергатор, такой как диатомовая земля или песок, пока он почти не заполнится, стараясь не допустить попадания мусора в нити тела клетки. Закройте верхнюю часть ячейки еще одной торцевой заглушкой. Повторите эти действия для каждого образца и заготовки.

Пометьте каждый флакон для сбора номером соответствующей ячейки образца или заготовки, а также накройте крышкой флакона. Поместите каждую ячейку в пронумерованный слот на верхнем лотке ASE. Задайте параметры метода экстракции с помощью клавиатуры на ASE для экстракции при температуре 100 °C и давлении 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Извлеките каждый образец 3 раза со статической фиксацией в течение 10 минут и промойте тело клетки на 50% от его общего объема между статическими удержаниями.

Затем убедитесь, что флакон с растворителем содержит достаточно для извлечения всех образцов. Промойте трубопроводы инструментов 3 раза перед началом прогона. Наконец, нажмите «Пуск».

Извлеките флакон из ASE. Теперь, когда биомаркеры извлечены, они должны быть очищены перед анализом.

Ускоренная экстракция растворителем — это универсальный метод, который может быть использован для различных применений, некоторые из которых рассмотрены здесь.

Ускоренная экстракция растворителем также может быть использована на других типах образцов, включая пищевые. Анализ остатков для проверки на загрязнение пестицидами часто проводится на регулирующих и промышленных предприятиях для определения безопасности и качества пищевых продуктов, таких как фрукты или овощи. ASE может быть использован для извлечения хлорорганических пестицидов из образцов пищевых продуктов и определения типов или уровней остатков, присутствующих в продуктах. Эта информация затем может быть использована для определения того, пригодна ли продукция для потребления человеком или животными. Например, дильдрин должен содержаться в пище в диапазоне от 0 до 0,1 частей на миллион, в зависимости от продукта.

Пищевые питательные компоненты также могут быть экстрагированы с помощью ASE. Например, можно экстрагировать такие продукты, как шоколад, которые могут иметь высокое гравиметрическое содержание жира. Используя ASE с петролейным эфиром в качестве растворителя, жир может быть отделен от образцов шоколада и подвергнут количественному анализу для определения точного процентного содержания жира на известное количество шоколада. Используя эту информацию, регулирующие органы могут проверить заявления производителей шоколада, или производители могут получить информацию для создания точных этикеток на продуктах питания.

Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию липидных биомаркеров с помощью ускоренной экстракции растворителем, или ASE. С методами дальнейшей обработки и анализа можно ознакомиться в последующих видеороликах.

Спасибо за просмотр!

Results

В конце экстракции для каждого образца определяется общий липидный экстракт (TLE). Каждый флакон теперь содержит извлекаемое органическое вещество из осадка, почвы или растительной ткани. Эти TLEs могут быть проанализированы, а их химические составляющие идентифицированы и количественно определены.

Applications and Summary

The TLEs of the extracted samples contain a wide spectrum of different organic compounds, including the GDGTs to be used to reconstruct ancient temperatures. Glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers are a large suite of biomarkers that show sensitivity to growth temperatures. There are two groups of GDGTs, branched and isoprenoid, which differ in the character of the branching patterns on the core alkyl groups (Figure 3). In the ocean, a cosmopolitan group of archaea, called Thaumarchaeota, produce isoprenoidal GDGTs⁴. Branched GDGTs are produced on land in soils⁵, lakes, and in lake sediments⁶ by as yet unidentified bacteria, likely Acidobacteria⁷. Both archaea and bacteria adjust the number of methyl branches and ring structures in the core alkyl group according to growth temperature, and because GDGTs are stable in sediments for millions of years, long high resolution records of climate change are generated using them.

The TEX₈₆paleo water temperature proxy is based on the ratio of certain isoprenoidal GDGTs, each containing 86 carbon atoms in its core alkyl group (Figure 3):

TEX₈₆ = (GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4') /
(GDGT-1 + GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4')

Paleo water temperature is then inferred using a calibration, such as the original equation:

TEX₈₆ = 0.015T + 0.28 (R² = 0.92)

Proposed by Schouten et al.¹, where T is paleotemperature. Several other regional and local calibrations have been developed to further refine the proxy for use in large lakes or in the tropics, for example.

Figure 3. Chemical structures of isoprenoidal and branched GDGTs. Please click here to view a larger version of this figure.

Transcript

Ускоренная экстракция растворителем — это быстрый, эффективный и высокопроизводительный метод, используемый для отделения органических биомаркеров от большого количества образцов геологических отложений.

Традиционно используются методы экстракции, такие как ультразвуковая обработка или метод Сокслета, однако недостатком этих протоколов является то, что они слишком медленны для обработки достаточного количества материала для детальной палеоклиматической реконструкции. Более новая технология, метод ускоренной экстракции растворителем, или метод ASE, была разработана с учетом эффективности и высокой производительности.

Метод ASE использует комбинацию высоких температур и высокого давления для извлечения образцов и может выполнять несколько образцов за один относительно быстрый цикл подготовки.

Это видео является третьим в серии, подробно описывающей, как извлечь биомаркеры из отложений. В нем будет рассмотрена процедура и дано представление о преимуществах ASE по сравнению с ультразвуковой обработкой или экстракцией по методу Сокслета.

При ускоренной экстракции растворителем образцы загружаются в стальные ячейки, которые затем загружаются на карусель. Коллекционные флаконы для каждой ячейки с образцом также загружаются на отдельную карусель. Прибор загружает ячейку с образцом во внутреннюю печь. Растворитель перекачивается из бутылки с растворителем через ряд клапанов до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное давление.

Это давление поддерживается в течение времени, продиктованного образцом и анализируемым веществом. Затем растворитель вымывается из ячейки образца через стальную линию в соответствующую пробирку для сбора. Процесс можно повторять несколько раз. Температура, давление и продолжительность могут быть настроены в зависимости от образца.

Используемая высокая температура увеличивает кинетику экстракции, в то время как высокое давление предотвращает испарение растворителя. Флакон для сбора теперь содержит общий липидный экстракт, а то, что осталось в ячейке образца, называется остатком. Он включает в себя неорганические материалы, а также органические материалы, которые не экстрагируются растворителями, называемые керогенами.

Теперь, когда мы знакомы с принципами ускоренной экстракции растворителем, давайте рассмотрим, как это осуществляется в лаборатории.

После сбора интересующих образцов; Сублимационная сушка, гомогенизация и обеззараживание, как показано в другом видео этой серии.

После того, как все образцы будут подготовлены, соберите по ячейке для каждого из них, который нужно извлечь, и еще одну для заготовки. Для этого на корпус клетки накручивают торцевую крышку. Используя пинцет, промытый растворителем, поместите фильтр из сгоревшего стекловолокна поверх каждого из них. Медленно и осторожно нажмите на фильтр с помощью поршня.

Пометьте тела клеток по номерам для каждого образца, а бланк пометьте отдельно. Поместите сгоревшую форму для взвешивания на лабораторные весы и держите их в таре. Промойте шпатель растворителем, затем с его помощью переложите от 5 до 10 г образца в форму для взвешивания и запишите массу.

Перенесите весь материал из весовой банки в соответствующую ячейку. Поместите сверху еще один фильтр из стекловолокна и осторожно утрамбуйте, пока он не достигнет верхней части образца.

Добавляйте диспергатор, такой как диатомовая земля или песок, пока он почти не заполнится, стараясь не допустить попадания мусора в нити тела клетки. Закройте верхнюю часть ячейки еще одной торцевой заглушкой. Повторите эти действия для каждого образца и заготовки.

Пометьте каждый флакон для сбора номером соответствующей ячейки образца или заготовки, а также накройте крышкой флакона. Поместите каждую ячейку в пронумерованный слот на верхнем лотке ASE. Установите параметры метода извлечения с помощью клавиатуры на ASE для извлечения при 100 ? С и 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Извлеките каждый образец 3 раза со статической фиксацией в течение 10 минут и промойте тело клетки на 50% от его общего объема между статическими удержаниями.

Затем убедитесь, что флакон с растворителем содержит достаточно для извлечения всех образцов. Промойте трубопроводы приборов 3 раза перед началом бега. Наконец, нажмите «Пуск».

Извлеките флакон из ASE. Теперь, когда биомаркеры извлечены, они должны быть очищены перед анализом.

Ускоренная экстракция растворителем — это универсальный метод, который может быть использован для различных применений, некоторые из которых рассмотрены здесь.

Ускоренная экстракция растворителем также может быть использована на других типах образцов, включая пищевые. Анализ остатков для проверки на загрязнение пестицидами часто проводится на регулирующих и промышленных предприятиях для определения безопасности и качества пищевых продуктов, таких как фрукты или овощи. ASE может быть использован для извлечения хлорорганических пестицидов из образцов пищевых продуктов и определения типов или уровней остатков, присутствующих в продуктах. Эта информация затем может быть использована для определения того, пригодна ли продукция для потребления человеком или животными. Например, дильдрин должен содержаться в пище в диапазоне от 0 до 0,1 частей на миллион, в зависимости от продукта.

Пищевые питательные компоненты также могут быть экстрагированы с помощью ASE. Например, можно экстрагировать такие продукты, как шоколад, которые могут иметь высокое гравиметрическое содержание жира. Используя ASE с петролейным эфиром в качестве растворителя, жир может быть отделен от образцов шоколада и подвергнут количественному анализу для определения точного процентного содержания жира на известное количество шоколада. Используя эту информацию, регулирующие органы могут проверить заявления производителей шоколада, или производители могут получить информацию для создания точных этикеток на продуктах питания.

Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию липидных биомаркеров с помощью ускоренной экстракции растворителем, или ASE. С методами дальнейшей обработки и анализа можно ознакомиться в последующих видеороликах.

Спасибо за просмотр!