3.14: Очистка общего липидного экстракта с помощью колоночной хроматографии

1. Настройка и подготовка материалов

1. Получить общий липидный экстракт (TLE) с помощью метода экстракции растворителем (Sonation, Soxhlet или Accelerated Solvent Extraction (ASE)).
2. Соберите следующее: сгоревшие боросиликатные стеклянные пипетки и лампочки, силикагель, гексан, дихлорметан (DCM) и метанол.
   1. Эти материалы можно приобрести в любом розничном магазине химической продукции. Реагенты должны быть чистыми и не содержать углеводородов.
3. Также приобретают сгоревшую стекловату и флаконы из боросиликатного стекла объемом 4 мл.
4. Убедитесь, что у вас есть средства для поддержки колонки и флаконов для сбора во время процедуры. Например, подставка с зажимами и мерзкая стойка. Многие лаборатории разработали специально изготовленные штативы, которые вмещают несколько колонок и коллекционных пробирок (Рисунок 2). Это позволяет одновременно запускать много столбцов.

2. Методы

1. Начните с сухого образца во флаконе объемом 4 мл. Если образец весит более ~ 10 мг в сухом виде, его может потребоваться разделить перед выполнением следующих шагов, поскольку силикагель может вступать в реакцию только с конечной массой органического вещества.
2. Суспендируйте образец в небольшом количестве гексана. Это первый и наименее полярный из трех растворителей, использованных в этом эксперименте.
3. Если образец прилип к внутренней части флакона, просните его ультразвуком в течение 5 минут.
4. Загрузите небольшое количество стекловаты в верхнюю часть пипетки с помощью набора чистых пинцетов. Осторожно прижмите стекловату к нижней части пипетки с помощью другой пипетки, чтобы получилась пробка.
5. Осторожно перелейте силикагель в пипетку, пока она не заполнится примерно наполовину.
6. Поместите под колонну флакон для сбора отходов объемом 4 мл.
7. Замочите силикагель в пипетке с 3 объемами гексана. Это кондиционирует колонку, удаляет пузырьки воздуха и смывает любые загрязнения с силикагеля.
8. После того, как окончательная промывка будет завершена, снимите флакон для сбора отходов и замените его флаконом для сбора аполярной фракции.
9. Осторожно перенесите весь образец в гексане на колонку с помощью пипетки. Промойте флакон с образцом еще два раза небольшими объемами гексана, и переложите в колонку. Дайте гексану, в который был перенесен образец, полностью впитаться в силикагель. Ни в коем случае во время процедуры силикагель не должен пересыхать.
10. Продолжайте добавлять гексан в верхнюю часть образца до тех пор, пока флакон для сбора под колонкой не станет почти полным (~4 мл).
    1. Дайте всему гексану войти в силикагель, прежде чем приступать к следующему растворителю.
11. Поместите пробирку для сбора средней полярности под колонку.
12. Добавляйте DCM в верхнюю часть столбца, пока пробирка для сбора не будет почти заполнена. Опять же, дайте всем DCM попасть во флакон для сбора перед началом следующего растворителя.
13. Поместите флакон для полярного сбора под колонну.
14. Добавляйте метанол в верхнюю часть колонки до тех пор, пока сбор мерзости не будет почти заполнен.

Колоночная хроматография является гибким методом очистки сложной смеси соединений, обнаруженных в осадке. Смеси разделяются по мере продвижения по колонне и собираются во фракции, каждая из которых содержит свой класс химических соединений. Поэтому колоночная хроматография часто используется в качестве дополнительной ступени очистки после первоначального выделения нужного соединения. Органические экстракты, такие как экстракты общих липидов, могут представлять собой сложные смеси многих соединений. Некоторые методы очистки, такие как омыление, вводят соединения, которые могут повредить аналитические приборы и поэтому должны быть удалены перед анализом. Это видео является частью серии статей об экстракции, очистке и анализе липидов из отложений. После того, как общий липидный экстракт собран из осадочного образца, используется колоночная хроматография для очистки как алкенонов, так и GDGT, в зависимости от желаемого анализа.

При колоночной хроматографии смесь химических соединений загружается в твердую неподвижную фазу, такую как силикагель. Затем подвижная фаза, такая как органический растворитель, используется для элюирования или удаления соединений из колонны. Порядок, в котором соединения элюируются, зависит от интенсивности взаимодействия соединений с силикагелем и с элюентом.

Элюат собирается во фракции, каждая из которых содержит различные соединения из смеси. В зависимости от свойств соединений один растворитель может обеспечить достаточное разделение и элюировать все интересующие соединения. В противном случае используется несколько растворителей для элюирования каждого интересующего соединения по очереди.

Полярные соединения, которые имеют неравномерное распределение заряда, сильно адсорбируются к полярному силикагелю, тогда как аполярные соединения адсорбируются слабо. Полярные растворители обладают большим сродством к силикагелю и поэтому являются более мощными элюентами, чем аполярные растворители. Таким образом, аполярные растворители элюируют только аполярные соединения, тогда как полярные растворители элюируют как аполярные, так и полярные соединения.

Когда желаемые соединения являются умеренно полярными, аполярные соединения следует смыть с колонки аполярным растворителем, прежде чем использовать полярный растворитель. Чтобы избежать элюирования нежелательных высокополярных соединений, таких как кислоты, полярный элюент не должен обладать большей элюирующей способностью, чем это необходимо для наиболее полярного желаемого соединения.

Теперь, когда вы понимаете принципы колоночной хроматографии, давайте пройдемся по процедуре очистки липидных биомаркеров из общего липидного экстракта с помощью силикагелевой колоночной хроматографии.

Для удаления органических загрязнений сожгите боросиликатные стеклянные пипетки, флаконы из боросиликатного стекла и стекловату в течение 6 ч при температуре 550 °C. Когда стеклянная посуда будет готова к использованию, установите штатив для хранения пипеток и флаконов. Возьмите луковицы для пипетки, чистый пинцет, лабораторный шпатель, силикагель, гексан, дихлорметан и метанол. Чистым пинцетом поместите небольшой пучок стекловаты в горловину пипетки. Аккуратно прижмите стекловату ко дну пипетки ножкой другой пипетки, чтобы образовалась неплотная пробка. Осторожно загрузите силикагель в пипетку до полного наполовину. Закрепите пипетку вертикально на штативе. Закрепите флакон из боросиликатного стекла объемом 4 мл под кончиком пипетки для сбора отходов. В другой флакон из боросиликатного стекла суспендируйте до 10 мг сухого образца в процессе омыления в гексане. Если образец прилип к стенкам флакона, просните флакон ультразвуком в течение 5 мин. Теперь можно начинать процедуру хроматографии.

Чтобы начать хроматографию, промойте колонку с силикагелем 3 объемами гексана, чтобы удалить пузырьки воздуха и загрязнения. Затем замените отработанный флакон пустым флаконом для аполярной фракции. С помощью стеклянной пипетки загрузите образец на колонку и дайте суспензии впитаться в силикагель. Работайте быстро, чтобы столбик не пересох во время процедуры. Дважды промойте флакон с образцом небольшими порциями гексана и переложите каждую полоскание в колонку. Продолжайте добавлять гексан в колонку, пока флакон для сбора не заполнится почти полностью. Дайте всему гексану закончить попадание в силикагель. Затем замените заполненный флакон на пустой флакон на среднеполярную фракцию. Далее промойте флакон с образцом DCM и добавьте его в колонку 3 раза. Продолжайте добавлять DCM в столбец, пока пробирка для сбора не будет почти заполнена. Дайте DCM закончить впитывание в силикагель, а затем замените заполненный флакон пустым флаконом на полярную фракцию. Повторите этот процесс с метанолом.

Когда флакон будет почти заполнен, дайте метанолу закончить капать в флакон, а затем закройте все флаконы крышкой. Среднеполярная фракция содержит желаемые алкеноны, в то время как ГДГТ находятся в полярной фракции. Для особо загрязненных или сложных образцов алкенонов среднеполярная фракция должна быть дополнительно очищена с помощью аддукции мочевины перед анализом.

Колоночная хроматография широко используется в химии в качестве аналитического и очистительного метода.

Углеродные нанотрубки, или УНТ, все чаще используются во многих отраслях промышленности, но растет обеспокоенность по поводу их влияния на здоровье человека. Изменение свойств УНТ изменяет их поведение в воде и почве. Чтобы исследовать, насколько хорошо пористые среды, такие как песок и грязь, удерживают УНТ, была подготовлена колонна с пористым грунтом в качестве стационарной фазы. Во-первых, фракции были собраны во время загрузки раствора УНТ на колонну для анализа транспортировки УНТ через почву. Затем все еще адсорбированные в почве УНТ элюировали, а фракции анализировали на предмет количества УНТ, оставшегося в почве. Полученные результаты дают представление о взаимосвязи между функционализацией поверхности УНТ и механизмами их переноса в окружающей среде.

Колоночная хроматография может работать как в больших, так и в малых масштабах, поэтому используется при проектировании синтезаторов для промышленного применения. Паучий шелк обладает отличной прочностью на разрыв и пластичностью, но его нельзя собирать в промышленных масштабах. После синтеза белка шелка рекомбинантные белки шелка очищаются с помощью аффинной хроматографии, в которой стационарная фаза предназначена для захвата только нужной молекулы. Тщательная промывка и элюирование дают чистые белковые фракции, необходимые для прядения паучьего шелка в больших масштабах.

Для колоночной хроматографии доступно множество стационарных фаз. Одна стационарная фаза может быть непригодна для всех потенциальных продуктов синтеза с широкой областью заместителей, таких как синтез йодоазиридина. Сырой продукт смешивают с различными стационарными фазами и разлагают с помощью протонного ЯМР. Поскольку протонный ЯМР обладает высокой чувствительностью, многие стационарные фазы могут быть проверены на предмет разложения продукта с использованием небольшого количества сырого продукта. Затем проводится колоночная хроматография с оптимальной стационарной фазой, позволяющей очищать новые и высокореакционноспособные соединения.

Вы только что посмотрели введение JoVE в колоночную хроматографию для очистки общего липидного экстракта. В следующем видео будет показано, как дополнительно очистить сложные смеси, содержащие алкеноны.

Спасибо за просмотр!