Метод стандартного сложения

Метод стандартного сложения — это метод количественного анализа, используемый для минимизации матричных эффектов, которые создают помехи для сигналов измерения аналита.

Неизвестные концентрации компонентов часто выясняются с помощью ряда аналитических методов, таких как световая спектроскопия, масс-спектрометрия и электрохимия. Однако на измерение могут влиять другие компоненты выборки, называемые матрицей, и вызывать непреднамеренное уменьшение или усиление сигнала, называемые матричными эффектами. Эти эффекты могут исказить результаты и привести к значительным ошибкам в анализе.

Метод стандартного сложения может быть использован для минимизации влияния матрицы на измерительные сигналы. Это осуществляется путем добавления в образец точных объемов известного раствора аналита.

В этом видео мы познакомим вас с основами метода сложения стандартов, а также продемонстрируем, как выполнить эту методику в лабораторных условиях с помощью флуоресцентного измерения.

Матричные эффекты могут возникать в сложных образцах, где ряд других молекул взаимодействует с анализируемым веществом. Например, это может произойти, когда молекулы связываются или агломерируются с анализируемым веществом, тем самым изменяя его способность флуоресцировать. Или же матрица может изменять ионную силу всего раствора, изменяя специфические свойства анализируемого раствора.

Для смягчения этих эффектов с помощью метода стандартного присоединения к равным объемам образца прибавляют диапазон объемов стандартного раствора аналита. Затем объемы раствора выравнивают с помощью растворителя.

Затем измеряется сигнал для образцов со стандартным добавлением и без него. Данные отображаются в виде зависимости интенсивности от количества стандарта, добавленного в образец, а не в виде классической калибровочной кривой. Фактическая концентрация аналита в любой данной колбе определяется следующим уравнением. Инструментальная реакция будет равна концентрации анализируемого лита в нескольких константных величинах. Полученное уравнение принимает линейный вид y=mx+b. Таким образом, когда график экстраполируется на нулевое поглощение, пересечение равно неизвестной концентрации образца.

График сигнала должен быть линейным в рассматриваемом диапазоне концентраций. Кроме того, интерференция не должна изменяться при изменении соотношения аналита к матрице образца. Наконец, сама матрица не должна генерировать никаких измерительных сигналов сама по себе.

В следующем эксперименте алюминий, нефлуоресцентное вещество, изучается путем его реакции с 8-гидроксихинолином, или 8HQ, с образованием флуоресцентного комплекса ALQ3.

Измеряется флуоресценция алюминиевого комплекса в органическом растворителе, а затем соотносится с концентрацией исходного алюминиевого раствора. Такой подход распространен при анализе ионов металлов.

Теперь, когда основы метода стандартного сложения изложены, а основы эксперимента объяснены, давайте выполним методику в лабораторных условиях.

Сначала приготовьте алюминиевый стоковый раствор с концентрацией 100 ppm в воде, а затем используйте его для приготовления стандартного раствора с концентрацией 1 ppm.

Затем добавьте 2 г 8-гидроксихинолина, или 8HQ, в мерную колбу объемом 100 мл.

Осторожно добавьте 5,74 мл ледяной уксусной кислоты, затем разбавьте до отметки 100 мл деионизированной водой. Этот этап позволяет 8HQ раствориться в водной фазе.

Затем приготовьте буфер, добавив 20 г ацетата аммония и 7 мл 30% гидроксида аммония в бутылку с маркировкой объемом 100 мл и разбавьте. Проверьте pH с помощью индикаторной палочки. Этот буфер помогает нейтрализовать кислоту в растворе 8HQ при соединении.

Другие необходимые реагенты включают безводный сульфат натрия и спектрофотометрический хлороформ.

Теперь подготовьте образцы, в данном случае путем экстракции водного образца в органическую фазу с помощью жидкостно-жидкостной экстракции. Поместите шесть разделительных воронок объемом 125 мл на кольца подставки внутри колпака. Убедитесь, что вся стеклянная посуда тщательно чистая, так как грязная стеклянная посуда может исказить результаты. Последовательно обозначьте воронки «пустой», «0», «1», «2», «3» и «4».

С помощью пипетки добавьте по 25 мл неизвестного алюминиевого раствора в каждую из пяти разделительных воронок с маркировкой от «0» до «4». Приготовьте заготовку, добавив 25 мл деионизированной воды в воронку с надписью «заготовка».

Затем добавьте 1, 2, 3 и 4 мл стандартного раствора 1 ppm в соответствующие пронумерованные воронки. Не добавляйте стандартное решение в пустую воронку или 0.

Добавьте по 1 мл раствора 8HQ и по 3 мл буферного раствора в каждую из 6 воронок.

Проведите экстракцию жидкость-жидкость, добавив по 10 мл хлороформа в каждую колбу. Энергично встряхивайте воронку и время от времени продувайте воронку, чтобы сбросить нарастающее давление. Поместите воронку обратно в кольцо и дайте слоям жидкости разойтись.

Затем соберите хлороформную фазу в чистый, сухой и маркированный стакан объемом 100 мл. Так как хлороформ имеет более высокую плотность, чем вода, он является нижним слоем воронки.

Перелейте экстракт хлороформа в мерную колбу объемом 25 мл и закройте каждую колбу крышкой, чтобы предотвратить испарение.

Проведите вторую экстракцию жидкость-жидкость на оставшемся водном растворе, добавив по 10 мл хлороформа в каждую воронку. Встряхните воронку, как и раньше, чтобы перевести оставшийся аналит в хлороформную фазу. В верхней водной фазе желтого цвета не должно остаться.

Повторите вторую экстракцию для каждой воронки, затем соберите фазы хлороформа в соответствующие маркированные стаканы. Разлейте собранный хлороформ по соответствующим мерным колбам, и разбавьте до отметки свежим хлороформом.

Чтобы удалить следы воды, добавьте около 1 г безводного сульфата натрия в каждый из шести стаканов объемом 100 мл. Переложите растворы обратно в соответствующие стаканы и перемешайте, чтобы облегчить обезвоживание образца.

Сцедите экстракт хлороформа в кварцевую ячейку флуориметра.

Настройте флуориметр в соответствии с инструкциями производителя и установите напряжение на 400 В. Далее откройте программу сбора данных на компьютере.

Используйте образец 2 для определения наилучших длин волн возбуждения и излучения. Установите длину волны излучения равной 500 нм и запустите сканирование возбуждения с длиной волны 335?435 нм со скоростью сканирования 2 нм/с.

Исходя из графика флуоресценции, определите максимальную длину волны для возбуждения. Установите прибор на это значение длины волны возбуждения, в данном случае 399 нм.

Далее определите длину волны излучения, выполнив сканирование с длиной волны от 450×550 нм. Из полученного графика флуоресценции определите максимальную длину волны и установите длину волны излучения, в данном случае 520 нм.

Измерьте каждый образец, включая бланк, на выбранной длине волны возбуждения и излучения. Запишите каждое показание интенсивности флуоресценции.

Вычтите измеренную флуоресценцию пустого образца из каждого из остальных 5 образцов.

Нанесите график зависимости интенсивности флуоресценции каждого из пяти образцов от количества алюминия, добавленного в образец. Определите значение метода наименьших квадратов результирующего графика, а также запишите уклон и пересечение.

График зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного алюминия дал линию наименьшего квадрата, как показано на рисунке. Количество алюминия в образце затем можно рассчитать с помощью этой линии. Поскольку количество добавленного неизвестного вещества составило 25 мл, то определенное значение, 2,916 мкг, делится на 25 мл. Это дает конечный результат 0,117 г/мл или 0,117 ppm. Это довольно близко к известному значению 0,110 ppm.

Теперь давайте рассмотрим некоторые другие аналитические методы, которые могут иметь искаженные результаты из-за матричных эффектов.

Атомно-абсорбционная спектроскопия — это аналитический метод, который измеряет поглощение света анализом-мишенью в газообразной фазе. Для большинства образцов простая калибровочная кривая, связывающая поглощение с концентрацией образца, может служить надежным методом количественного определения неизвестной концентрации.

Однако этот метод может потерять точность, если другие компоненты смеси взаимодействуют с целевым аналитом и подавляют или усиливают абсорбцию. В этом случае для учета эффектов этих взаимодействий может быть использован стандартный метод сложения, особенно в образцах, где матрица не может быть удалена до анализа.

Калибровка прибора играет решающую роль в точности измерения. Метод сложения стандартов часто используется для помощи в калибровке таких приборов, как ICP-MS. ИСП-МС является сравнительным методом, что означает, что измерение неизвестного образца основано на измерении химического стандарта.

Таким образом, неопределенность измерения неизвестного не может быть лучше, чем неопределенность калибровки. Таким образом, метод стандартного сложения может быть использован для создания калибровочной кривой, которая является более точной, чем стандартный метод, и учитывает матричные взаимодействия в образце.

Многие биологические молекулы анализируются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ — это метод, который разделяет и анализирует сложные смеси на основе свойств молекул, таких как полярность, заряд и размер. Время, в которое аналит покидает колонку, позволяет пользователю идентифицировать каждый компонент в смеси.

Биологические молекулы часто могут взаимодействовать в смеси, и на них сильно влияет матрица, в которой они находятся во взвешенном состоянии. Часто метод сложения стандартов используется для создания калибровочной кривой, которая учитывает эти эффекты.

Вы только что посмотрели введение JoVE в метод стандартного сложения. Теперь вы должны понять, как использовать метод учета матричных эффектов при анализе выборки.

Спасибо за просмотр!