Метод стандартного сложения

1. Подготовка реагентов

1. 100 ppm стандартный раствор Al³⁺: Растворите 0,9151 г нитрата алюминия (Al(NO₃)₃•9H₂O) в мерной колбе объемом 1 л с деионизированной водой.
2. Раствор 8HQ в 1 М уксусной кислоте (2% мас./об.): Добавьте 2,0 г 8-гидроксихинолина в волюметрическую колбу объемом 100 мл.
3. Осторожно добавьте 5,74 мл ледяной уксусной кислоты в колбу объемом 100 мл, затем разбавьте до отметки деионизированной водой. Это позволяет 8-гидроксихинолину растворяться в водной фазе.
4. 1 M NH₄⁺/NH₃ buffer (pH~8): Добавьте 20 г ацетата аммония (NH₄OAc) в бутылку объемом 100 мл.
5. Добавьте 7 мл 30% гидроксида аммония в этот флакон объемом 100 мл и разбавьте до отметки деионизированной водой. Это помогает нейтрализовать кислоту в растворе 8HQ при соединении.
6. Другие реагенты включают безводный сульфат натрия (Na,₂,_SO4) и хлороформ (класс Spec).

2. Подготовка образцов

1. Приготовьте стандартный раствор Al³⁺ с концентрацией 1,00 ppm, добавив 1,0 мл из 100 ppm исходного раствора Al³⁺ с помощью пипетки в мерную колбу объемом 100 мл.
2. Поместите шесть разделительных воронок объемом 125 мл на кольца, которые находятся на большой кольцевой подставке, расположенной в колпаке. Они должны иметь следующую маркировку: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Убедитесь, что вся стеклянная посуда тщательно чистая, так как трудно получить количественные результаты, если к стенкам стеклянной посуды прилипают мелкие шарики хлороформа.
3. Добавьте 25,00 мл неизвестного раствора Al³⁺ в пять разделительных воронок, помеченных 0, 1, 2, 3 и 4. В этом примере неизвестная концентрация составляет 0,110 ppm.
4. Добавьте 0, 1,00, 2,00, 3,00 и 4,00 мл стандартного раствора Al³⁺ с концентрацией 1,00 ppm соответственно в 5 воронок с помощью пипетки объемом 1 мл.
5. Приготовьте ЗАГОТОВКУ, добавив 25,00 мл дистиллированной воды в разделительную воронку с маркировкой BL.
6. Добавьте по 1,0 мл раствора 8-гидроксихинолина с помощью пипетки в каждый из шести растворов.
7. Добавьте по 3,0 мл буферного раствора с помощью пипетки в каждый из шести растворов.
8. Извлеките каждый раствор дважды с 10 мл хлороформа, каждый раз энергично встряхивая в течение 1 минуты. Не забывайте время от времени проветривать сепарирующую воронку, чтобы выпустить нарастающее давление. (ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая экстракция происходит только при сильном контакте жидкости и жидкости между фазами).
9. Соберите хлороформ в чистую сухую мензурку с этикеткой объемом 100 мл. Хлороформ имеет плотность близкую к 1,5 г/см³ , поэтому он является нижним слоем. В водной фазе после полной экстракции не должно остаться и следа желтого цвета.
10. Перелейте объединенный экстракт хлороформа из каждого стакана в соответствующую мерную колбу объемом 25 мл и разбавьте хлороформом до метки. Обязательно поместите пробки в каждую мерную колбу, чтобы предотвратить испарение хлороформа.
11. Добавьте ~1 г безводного сульфата натрия (Na₂SO₄) в каждый из шести стаканов объемом 100 мл из шага 2.9. Сульфат натрия помогает удалить любые следы воды, которые могут присутствовать в экстракте хлороформа.
12. Перенесите растворы обратно в их уважаемые мензурки. Осторожно перемешивайте, чтобы облегчить обезвоживание любой воды в образце.
13. Сцедите экстракты хлороформа в кварцевую ячейку флуориметра (Примечание: хлороформ растворит пластиковую ячейку из полистирола).

3. Выбор длины волны возбуждения

Определите длины волн возбуждения и излучения с помощью сканирования, затем просто считайте и запишите интенсивность флуоресценции всех образцов при этих значениях. Ширина полосы возбуждения и излучения предварительно установлена на уровне 5 нм. Комплекс поглощает в ближнем ультрафиолете, поэтому длина волны возбуждения должна составлять около 385 нм. Первоначально контролируйте флуоресценцию на длине волны 500 нм в эмиссионной ветви.

1. На флуориметре убедитесь, что внутренний и внешний вентиляторы флуориметра включены перед включением ксеноновой лампы. Ксеноновая лампа сильно нагревается и требует постоянного охлаждения.
2. Включите высоковольтный (HV) датчик ФЭУ на 400 В.
3. Откройте обе жалюзи.
4. Откройте программу сбора данных на компьютере, вот она "100nmFluorScan".
5. Поместите раствор «Образец + добавлено 2 мл» (2) в кварцевую ячейку для определения наилучших длин волн возбуждения и излучения.
6. Если длина волны излучения изначально установлена на 500 нм, запустите сканирование возбуждения от 335-435 нм со скоростью сканирования 2 нм/с.
7. Исходя из полученного графика флуоресценции, определите максимальный длина волны возбуждения флуоресценции (EXλ_max) и установите прибор на это значение.

4. Выбор длины волны излучения

1. Установите длину волны излучения флуориметра на 450 нм.
2. Установите диапазон длин волн излучения для сканирования с длиной волны 100 нм от 450 до 550 нм.
3. Чтобы начать сканирование, нажмите кнопку «Начать пробную версию» в программе одновременно с нажатием кнопки «СТАРТ» на передней панели флуориметра.
4. Исходя из полученного графика флуоресценции, определите максимальную флуоресценцию длина волны излучения (EMλ_max) и установите прибор на это значение (рис. 2).

Рисунок 2. Определение оптимальных EXλ_max и EMλ_max Wavelengths.

5. Измерение флуоресценции образцов

1. Все образцы прогоняются при EMλ_max и EXλ_max. Сканирование требуется не для каждого образца, а только для определения значения флуоресценции в этих условиях. Начиная с максимально разбавленного образца (заготовки), поместите в кварцевую ячейку, а затем в прибор. Запишите интенсивность флуоресценции в лабораторный блокнот.
2. Повторите для всех остальных образцов.
3. Помните, что относительная интенсивность пустого поля должна быть вычтена из относительных интенсивностей каждого раствора перед созданием калибровочной таблицы.

6. Создание стандартного графика сложения

1. Построить график зависимости интенсивности флуоресценции от μг добавленного Al³⁺.
2. Определите значение метода наименьших квадратов результирующего графика и запишите наклон и пересечение.
3. Определить μg Al³⁺ в неизвестном образце по уравнению μg Al³⁺ = -b/m
4. Зная, что неизвестный алюминий имеет объем 25,0 мл, добавленный в каждый образец, определить концентрацию алюминия в неизвестном.