$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ультрафиолетовая спектроскопия или УФ-видимая спектроскопия является одним из самых популярных аналитических методов в лаборатории.
При УФ-ВИД спектроскопии свет пропускается через образец на определенной длине волны в УФ-или видимом спектре. Если образец поглощает часть света, не весь свет будет пропускаться или пропускаться. Пропускание — это отношение интенсивности проходящего света к падающему свету, которое коррелирует с поглощением. Абсорбция может быть использована количественным образом, чтобы получить концентрацию образца. Он также может быть использован в качественном качестве для идентификации соединения путем сопоставления измеренного поглощения в диапазоне длин волн, называемого спектром поглощения, с опубликованными данными. В этом видеоролике будет представлена УФ-ВИД спектроскопия и продемонстрировано ее использование в лаборатории для определения концентрации образца и кинетики реакции.
Когда фотон попадает на молекулу и поглощается, молекула переходит из основного состояния в состояние с более высокой энергией. Разница энергий между ними и есть запрещенная зона. Энергия фотона должна точно соответствовать запрещенной зоне, чтобы фотон был поглощен. Химическая структура определяет запрещенную зону; Таким образом, каждая молекула обладает уникальными спектрами поглощения.
Поглощение следует закону Бира, который гласит, что поглощение равно молярному коэффициенту затухания, умноженному на длину пути и концентрацию. Молярный коэффициент затухания связан со способностью отдельного соединения поглощать свет определенной длины волны. Длина пути относится к расстоянию, пройденному светом через образец, которое обычно составляет 1 см для стандартных кювет. Закон Бира может быть использован для расчета концентрации пробы, если известна поглощающая способность, или может быть использована калибровочная кривая.
УФ-ВИД часто называют общим методом, так как большинство молекул поглощают свет в УФ-видимом диапазоне длин волн. Ультрафиолетовый диапазон простирается от 100х400 нм, а видимый спектр – от 400х700 нм. Однако большинство спектрофотометров не работают в глубоком ультрафиолетовом диапазоне 100-200 нм, так как источники света в этом диапазоне дорогие. Большинство УФ-ВИД спектрофотометров используют дейтериевую лампу для УФ-диапазона, которая дает свет от 170-375 нм, и лампу с вольфрамовой нитью для видимого диапазона, которая дает свет от 350-2500 нм.
Так как источником света обычно является лампа с широким диапазоном длин волн, то удельная длина волны поглощения подбирается с помощью фильтров или монохроматора. Монохроматор — это устройство, которое разделяет длины волн света пространственно, а затем размещает выходную щель там, где находится желаемая длина волны света. Монохроматор может быть отсканирован в диапазоне длин волн для получения полного спектра поглощения. Это делает метод полезным для количественной оценки и идентификации широкого спектра молекул.
Теперь, когда мы разобрались с основами УФ-ВИД спектроскопии, давайте рассмотрим простой эксперимент с УФ-ВИД спектроскопии в лаборатории.
Перед началом измерения включите спектрофотометр и дайте лампам прогреться в течение соответствующего периода времени для их стабилизации.
Подготовьте заготовку, заполнив чистую кювету образцом растворителя, а затем протрите ее снаружи безворсовой бумагой, чтобы удалить отпечатки пальцев.
Убедитесь, что кювета правильно выровнена со всеми рифлеными сторонами за пределами пути луча, и вставьте ее в спектрофотометр. Закройте крышку, чтобы предотвратить попадание окружающего света в систему.
Измерьте поглощение заготовки на одной длине волны или в диапазоне длин волн. Запишите или сохраните абсорбцию, так как она должна быть вычтена из абсорбции образца.
Далее выбросьте заготовку и дважды промойте кювету с образцом. Затем заполните кювету о ? полный с образцом. Еще раз протрите внешнюю сторону кюветы, чтобы убедиться, что она чистая и на ней нет отпечатков пальцев.
Поместите кювету в спектрофотометр в правильную ориентацию и закрепите крышку.
Соберите данные об измерении поглощения или спектре на той же длине волны или в том же диапазоне длин волн, что и бланк. Вычтите пустой спектр или измерение, если прибор не делает этого автоматически.
По собранному спектру поглощения определите максимум поглощения, или ?max.
Чтобы количественно оценить количество аналита в образце, создайте калибровочную кривую, используя диапазон известных концентраций аналита. Для получения дополнительной информации о том, как построить и использовать калибровочную кривую, посмотрите видео из этой коллекции "Калибровочные кривые".
Измерение абсорбционной способности также может быть использовано для расчета кинетики реакции путем измерения увеличения или уменьшения концентрации соединений на протяжении всей реакции. Начните со снятия первоначального считывания образца, в данном случае синего красителя, на максимуме поглощения перед реакцией.
Далее быстро добавьте реагент, в данном случае отбеливатель, чтобы запустить химическую реакцию. Хорошенько перемешайте, чтобы он смешался с образцом.
Измерьте поглощение на максимальном уровне поглощения с течением времени.
Показан начальный спектр поглощения образца синего красителя. Цвета фона показывают цвета света в видимом спектре. Синий краситель имеет максимум поглощения на длине волны около 630 нм.
Кинетика реакции между синим красителем и отбеливателем измерялась с течением времени. Впитывающая способность синего красителя со временем снижается, так как он вступает в реакцию с отбеливателем. Поглощение достигает почти нуля через 300 с, что указывает на то, что реакция близка к завершению. Для получения дополнительной информации о кинетике и реакциях, пожалуйста, посмотрите обучающее видео JoVE «Законы скорости реакции».
УФ-ВИД спектроскопия широко используется во многих различных областях исследований для идентификации или количественной оценки образца.
Например, УФ-ВИД спектроскопия широко используется в биологических областях для количественной оценки количества белка в образце. Брадфордский анализ часто используется для количественного определения белков с помощью красителя. Сначала составляется калибровочная кривая известных концентраций белка, обычно с использованием бычьего сывороточного альбумина или БСА. Затем к каждому из стандартов и к образцу добавляется синее морилка Кумасси. Затем измеряют абсорбцию комплекса белок-краситель на длине волны 595 нм.
В качестве альтернативы, белки можно измерить непосредственно по их поглощению при длине волны 280 нм. В этом примере концентрация белка количественно определена с помощью спектрофотометра сверхмалого объема. Для многих белков абсорбция 1 коррелирует с концентрацией 1 мг/мл.
УФ-ВИД спектроскопия также используется для количественной оценки количества бактериальных клеток в клеточной культуре. Для этого измерения поглощающая способность, или оптическая плотность, измеряется на длине волны 600 нм. Как правило, измерение OD600 равным 1 указывает на наличие 8 x 108 бактериальных клеток на мл. Измерение плотности клеток на протяжении всего роста культуры позволяет определить кривую роста бактерий и может помочь определить, когда культура находится в фазе экспоненциального роста.
Оксид азота и диоксид азота, или NOx, являются побочным продуктом автомобильных выхлопов и могут быть вредны для окружающей среды, поскольку они образуют разрушительный тропосферный озон. NOx можно измерить, прореагировав с раствором сульфаниловой кислоты и наптилэтилендиамина. Полученный раствор представляет собой молекулу азокрасителя розового цвета, интенсивность которой напрямую коррелирует с концентрацией NOx. Затем эту концентрацию можно определить с помощью УФ-ВИД спектрофотометра.
Вы только что посмотрели введение JoVE в УФ-видимую спектроскопию. Теперь вы должны понять основы работы с УФ-ВИД излучением, как измерить образец с помощью УФ-ВИД и как соотнести поглощение с концентрацией образца.
Спасибо за просмотр!
