Колоночная хроматография

Колоночная хроматография – это универсальный метод очистки, используемый для разделения соединений в растворе. Растворительная смесь проносится растворителем через колонку, содержащую твердое вещество адсорбента, называемое стационарной фазой. Комбинированная смесь растворителя и образца называется подвижной фазой.

Молекулы в подвижной фазе перемещаются по колонке с разной скоростью в зависимости от их химических свойств и сродства к стационарной фазе. Таким образом, каждое соединение выходит из колонны в разное время. После того, как соединения были отделены и очищены, они могут быть подвергнуты дальнейшей обработке или готовы к распределению. В этом видео мы познакомим с основами колоночной хроматографии, затем продемонстрируем методику с очисткой органических соединений.

В колоночной хроматографии молекулы обратимо адсорбируются к неподвижной фазе, когда они протекают через колонку, тем самым замедляя свой прогресс. Соединения, которые слабо взаимодействуют со стационарной фазой, быстрее выходят из колонки, или элюируются. Соединения, которые сильно взаимодействуют со стационарной фазой, медленнее элюируются. Стационарная фаза представляет собой адсорбирующий порошок или гель, такой как силикагель или оксид алюминия. Силикагель и оксид алюминия сильно полярны, поэтому они сильно взаимодействуют с полярными соединениями и растворителями, а с неполярными молекулами — слабо. Неподвижная фаза загружается в колонну в виде суспензии вместе с растворителем, а затем упаковывается протекающим растворителем через стационарную фазу. При правильной упаковке неподвижная фаза однородна сверху донизу и не содержит пузырьков воздуха или сухих участков, так как неравномерный поток, вызванный этими неровностями, препятствует разделению соединений. Растворитель, или элюент, обычно представляет собой органический растворитель, поступающий из резервуара. В целом, неполярные растворители элюируют только неполярные соединения, в то время как полярные растворители элюируют как полярные, так и неполярные соединения. Если смесь содержит соединения значительно отличающейся полярности, то для элюирования всех интересующих соединений может быть использован ряд все более поляризующих растворителей. Расход подвижной фазы обычно контролируется запорным краном в нижней части колонны. Паузы в потоке сведены к минимуму, чтобы избежать диффузии состава. Подвижная фаза, выходящая из колонны, называемая элюатом, собирается во фракции для сохранения разделения соединений. Теперь, когда вы разобрались с принципами работы колоночной хроматографии, давайте пройдемся по процедуре очистки смеси органических соединений.

Чтобы начать процедуру, приобретите оборудование, как указано в тексте. Взвесьте колбу с круглым дном для каждого выделяемого соединения и запишите массу. Далее взвесьте образец и растворите его в минимально необходимом объеме растворителя. Подходящий растворитель должен быть заранее определен с помощью тонкослойной хроматографии. Значение Rf должно быть в пределах 0,2?0,3. Затем определите необходимое количество силикагеля для стационарной фазы на основе сухой массы образца и разницы в расстоянии миграции интересующих соединений на основе предварительного скрининга TLC. Налейте соответствующее количество силикагеля в колбу Эрленмейера. Добавляйте растворитель в силикагель до тех пор, пока суспензия не станет полупрозрачной и не будет свободно перемещаться при закручивании колбы. Далее выберите столбец достаточно большого размера, чтобы силикагель заполнил его наполовину. Если колонна не имеет стеклянной фритты, поместите в колонну стекловату и плотно прижмите ее к дну длинным стержнем. Посыпьте стекловату примерно 2 см песком, чтобы предотвратить прохождение кремнезема через стекловату. В вытяжном шкафу колонна прикреплена к кольцевой стойке, оставляя внизу достаточно места для размещения пробирок.

Поместите воронку в колонну и убедитесь, что запорный кран закрыт. Налейте кашицу в колонну, слегка постукивая по бокам по мере оседания кашицы, чтобы исключить пузырьки воздуха. Промойте воронку, колбу и стенки колонки растворителем, чтобы перенести весь гель в колонку.

Поставьте под колонну колбу Эрленмейера. Откройте запорный кран и дайте растворителю стечь в колбу, пока уровень растворителя не будет чуть выше силикагеля, а затем закройте запорный кран. Насыпьте на гель около 2 см песка. Аккуратно промойте растворителем любой песок, прилипший к бокам колонки. Слейте растворитель по мере необходимости, чтобы песок был в основном сухим, но кремнезем оставался полностью покрытым.

Чтобы начать сепарацию, добавьте пробу в колонку, не потревожив песок. С помощью небольших порций растворителя смойте пробу, прилипшую к стенкам колонны, и промойте емкость с образцом. Осторожно слейте воду из растворителя до тех пор, пока уровень не будет чуть выше диоксида кремния. Затем с помощью пипетки аккуратно добавьте 4,5 мл растворителя, не нарушая слой песка. Поместите воронку в колонну и медленно заполните растворителем. Снимите колбу и замените ее пробиркой с маркировкой. Когда первая пробирка на месте, откройте запорный кран и собирайте элюат, пока пробирка не заполнится почти до полного заполнения.

Продолжайте собирать фракции до тех пор, пока не будут вымыты все нужные соединения, последовательно проходя по пробиркам с маркировкой. Когда закончите, закройте запорный кран.

Для каждого изолированного соединения соедините чистые фракции в предварительно взвешенной колбе с круглым дном. Удалите растворитель из колбы на ротационном испарителе, а затем взвесьте колбу с круглым дном, содержащую сухой состав. Для получения дополнительной информации см. видео о ротационном испарении из этой коллекции.

Этот образец содержал смесь тетрафенилпорфирина, или ТТП, и флуоренона. Сначала был элюирован темно-красновато-фиолетовый TPP, за ним последовал желтый флуренон. Чистота каждого выделенного соединения была подтверждена методом ЯМР-спектроскопии.

Колоночная хроматография используется для очистки и анализа в различных научных областях.

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или ВЭЖХ, — это форма колоночной хроматографии, которая обеспечивает превосходное разделение между соединениями и может включать в себя специализированные детекторы, такие как детектор излучения для молекул с радиоактивной меткой. С помощью ВЭЖХ меченый радиоактивными веществами фосфолипид может быть легко выделен из смеси многих других, даже если он составляет небольшой процент смеси. Эта информация может помочь пролить свет на производство, регуляцию и функции многих важных биомолекул.

Флэш-хроматография — это вариант колоночной хроматографии, в котором подвижная фаза движется через колонку под давлением воздуха или газа, а не только под действием силы тяжести.

Это создает более высокую скорость потока, сводя к минимуму диффузию для лучшего разделения. Нужное соединение собирается в несколько чистых, концентрированных фракций, как показано с помощью тонкослойной хроматографии, что приводит к отличному выходу и чистоте после очистки.

Обычный колонный аппарат не подходит для разделения небольших объемов, но некоторые смеси не совместимы со специализированными методами, такими как ВЭЖХ. Мелкомасштабная очистка выполняется с помощью стеклянных колонок для пипеток, при этом колба для пипетки используется для мелкомасштабной флэш-хроматографии. Это особенно полезно при подготовке образца для специализированных методов очистки или в качестве заключительного этапа после крупномасштабной очистки.

Вы только что посмотрели введение в колоночную хроматографию от JoVE. Теперь вы должны быть знакомы с принципами колоночной хроматографии, процедурой колоночной хроматографии с силикагелем и некоторыми областями применения этого метода.

Спасибо за просмотр!