Забор крови I

1. Ретроорбитальное кровотечение

1. Оборудование
   1. Подготовьте баночку-колокол или камеру для индукции анестетика для введения анестетика, такого как изофлуран. При использовании банки с колокольчиком крайне важно, чтобы жидкий анестетик не контактировал с животным, чтобы избежать его впитывания через кожу. Можно использовать платформу с небольшими отверстиями.
   2. Предпочтительны пробирки с микрогематокритом, которые вмещают 50-75 микролитров. Трубки, обернутые майларом, с меньшей вероятностью сломаются между пальцами оператора и должны рассматриваться как мера безопасности.
   3. На рабочую поверхность кладут бумажные полотенца разной толщины, или другие изоляционные материалы, чтобы сохранить тепло тела животного во время процедуры.
2. Подготовка и позиционирование животного
   1. Животное обезболивают ингаляционным анестетиком, таким как изофлуран, в колокольчике или камере для индукции газовой анестезии.
   2. Как только животное полностью обезболивается, его снимают и помещают в боковое лежачее положение.
   3. Глаз выпячивается путем размещения пальца на макушке головы и вдоль линии подбородка, а также оттягивания кожи назад и вниз.
   4. Избегайте давления на трахею, так как это может разрушить или закупорить дыхательные пути, что приведет к смерти от асфиксии.
3. Забор крови
   1. Микрогематокрит помещается в медиальный кантус глаза и направляется каудально под углом 30-45° от плоскости носа.
   2. Надавливайте, осторожно вращая гематокритическую трубку. Это приведет к перерезанию конъюнктивальных оболочек и разрыву глазного сплетения.
   3. Кровь будет поступать в гематокритную трубку под действием капилляров.
   4. Избегайте нажатия настолько глубоко, чтобы не задеть кость в задней части глазной полости.
   5. Как только кровь начнет течь, поддерживайте давление, чтобы глаз оставался выпуклым.
   6. Чтобы собрать несколько пробирок с кровью, нет необходимости помещать следующую пробирку в глазное сплетение, так как кровь будет продолжать течь и может быть собрана по мере ее поступления из медиального кантуса.
   7. Чтобы остановить кровотечение, отпустите кожу и позвольте глазу вернуться в нормальное положение. Надавите на глазницу, чтобы обеспечить гемостаз.

Рисунок 1. Ретроорбитальный забор крови у мышей.

2. Процедуры обескровливания хвоста: нож хвоста и укус хвоста

1. Оборудование
   1. Стерильное лезвие скальпеля, предпочтительно лезвие под номером 11 или одностороннее лезвие бритвы, используется для проведения первоначальной ампутации по методу ножницы хвоста. Ножницы не следует использовать, потому что разрез, сделанный ножницами, является раздавливающим, что способствует свертыванию крови и снижению кровотока. Для процедуры надреза хвоста используется скальпельное лезвие под номером 11 или 15.
   2. Подготавливается удерживающая трубка, обеспечивающая доступ к хвосту мыши.
   3. В качестве субстрата для выполнения обрезки хвоста используются впитывающие бумажные полотенца или марля.
   4. Также требуются пробирки для сбора или пробирки с гематокритом.
   5. Кровоостанавливающий порошок должен быть доступен для помощи в гемостазе.
2. Сдержанность
   1. Животное помещают в трубку таким образом, чтобы хвост был доступен. Для ограничителей типа Брума животное сначала втягивается в трубку. Для других трубок животное помещают головой вперед.
   2. Животные закреплены в трубе таким образом, что они не могут поворачиваться или отводить хвост.
   3. Некоторые мыши позволяют срезать хвост и собирать кровь с минимальным ручным удержанием, если им позволено хвататься за шероховатую поверхность.
   4. Некоторым крысам потребуется ингаляционная анестезия для этого метода забора крови.
3. Забор крови
   1. Хвост протирают теплой водой, чтобы удалить мусор и вызвать небольшое расширение сосудов. НЕ используйте горячую воду.
   2. Для ножа хвоста хвост удлиняют, а лезвием скальпеля срезают самый конец хвоста (0,5-1 мм у мышей и до 2 мм у крыс).
   3. Для зазубрины хвоста хвост удлиняют, а лезвием скальпеля делают надрез примерно на 2/3 расстояния от крестца, непосредственно над боковой хвостовой жилкой.
   4. Хвост можно гладить от крупа к кончику, чтобы стимулировать кровоток; Однако это приведет к снижению качества образца.
   5. Кровь собирают с кончика или зазубрины с помощью пробирок с гематокритом или дают ей капнуть во флакон для сбора.

3. Забор сердечной крови

1. Оборудование
   1. Для мыши предпочтительнее использовать шприц объемом 3 куб. см с иглой 22-25 калибра x 1 дюйм. Шприцы меньшего размера не имеют такого же обратного давления и могут затруднить забор крови. Иглы калибра меньше 25 ограничивают приток крови, что приводит к увеличению свертываемости крови и повреждению клеток крови. Иглы короче 1" могут не достигать уровня сердца при приближении от диафрагмы.
   2. Для крысы предпочтительнее использовать шприц объемом 10-12 куб. см с иглой 18 калибра x 1,5 дюйма. В зависимости от размера крысы, меньший шприц может не вместить весь объем крови, который нужно собрать, и поэтому шприц придется менять во время процедуры. Иглы меньше 20 калибра ограничивают приток крови, что приводит к увеличению свертываемости. Иглы короче 1,5" могут не достигать уровня сердца при приближении от диафрагмы.
   3. Для удержания собранной крови используется пробирка для сбора крови достаточного размера.
2. Сдержанность
   1. Надлежащая сдержанность имеет важное значение для успеха этого метода. Животное удерживается за загривок при вертикальном свисании туловища. Важно, чтобы тело было прямым, чтобы не допустить искривления сердца или скручивания грудной клетки.
   2. Альтернативным положением является лежачее положение на спине при помещении иглы между ребрами с левой стороны животного. Это особенно полезно для очень крупных крыс или когда необходимо обескровить нескольких животных.

Рисунок 2. Забор сердечной крови при вертикальном положении мыши.

3. Забор крови
   1. Подход с задней стороны, прокол диафрагмы легче осуществить, когда мышь или крыса удерживаются вертикально за загривок.
      1. Игла продвигается в выемке слева от мечевидной кости животного.
      2. Игла должна быть параллельна позвоночнику и располагаться прямо под ребрами.
      3. Сердце расположено примерно на уровне локтя.
      4. Поместите иглу со скосом вверх в грудную клетку и проколите сердце.
      5. Слегка надавите на спину шприцем. Если игла находится в сердце, кровь будет поступать в шприц.
      6. Подождите, пока кровь заполнит шприц, прежде чем оказывать дополнительное обратное давление на шприц.
   2. Боковой подход с левой стороны животного требует положения животного в спинном положении лежа.
      1. Точка входа измеряется относительно точки локтя на грудной стенке. Сердце расположено примерно на уровне локтя.
      2. Игла вводится перпендикулярно плоскости стола в точке посередине грудной стенки, измеренной дорсовентрально.
      3. Поместите иглу со скосом вверх в грудную клетку и проколите сердце.
      4. Слегка надавите на спину шприцем. Если игла находится в сердце, кровь будет поступать в шприц.
      5. Подождите, пока кровь заполнит шприц, прежде чем оказывать дополнительное обратное давление на шприц.

Рисунок 3. Забор сердечной крови у мыши в дорсальном положении лежа.

4. Технические советы
   1. Нормальное сердце расположено так, что его вершина направлена влево. В редких случаях сердце может быть перевернуто, что приводит к трудностям при проколе сердца.
   2. Чрезмерное обратное давление на шприц может привести к коллапсу сердца, закупориванию скоса иглы и остановке притока крови к шприцу.
   3. Применение обратного давления и его многократное ослабление инициирует свертывание крови в шприце.
   4. Мягкое давление на печень может привести к увеличению объема крови в кровеносной системе, делая ее доступной для вывода.

4. Забор крови из задней полой вены

4. Оборудование
   1. Для забора крови у мышей используется противотуберкулезный шприц с иглой 25-29 калибра. Для крыс требуется шприц объемом 10-12 куб. см с иглой 22-25 калибра x 1 дюйм.
   2. Необходима хирургическая платформа, лоток для вскрытия или другая поверхность для фиксации животного, а также стяжки, лента или булавки для фиксации конечностей на месте.
   3. Необходима инъекционная анестезия или ингаляционная анестезия. При использовании ингаляционной анестезии желательно, чтобы анестетик вводился через прецизионный вапорайзер с носовым конусом. Продолжительность процедуры такова, что использование индукционной камеры без дополнительной подачи анестезирующего газа не обеспечит достаточного времени для завершения забора крови до того, как животное оживет.
   4. Требуются ножницы для радужной оболочки глаза для мыши или острые тупые ножницы для крысы в операционной, а также небольшие атравматичные щипцы для большого пальца и марлевая губка размером 2 x 2 дюйма.
5. Сдержанность
   1. Когда животное полностью обезболивается, что определяется путем защемления пальца ноги или хвоста, животное помещают в лежачее положение на спине.
   2. Конечности крепятся к платформе с помощью ленты или штифтов. Конечности должны быть вытянуты в сторону от тела.
6. Изъятие
   1. Кожа приподнимается и делается небольшой поперечный разрез через кожу чуть выше таза у женщин или чуть выше крайней плоти у мужчин.
   2. Острие ножниц помещается в разрез, и через кожу делается разрез по средней линии от таза/крайней плоти до мечевидной кости.
   3. Кожа отражается латерально в каждую сторону. Может потребоваться тупое рассечение, чтобы освободить его от основной мышцы.
   4. Мышца подтягивается, и через мышцу делается небольшой поперечный разрез прямо над разрезом кожи.
   5. Острие ножниц помещается в живот и делается разрез по средней линии через мышцу к мечевидной кости. Обязательно наклоните ножницы острием вверх, чтобы не порезать органы.
   6. Разрежьте поперечно по изгибу ребер с каждой стороны. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не проколоть печень.
   7. Осторожно сдвиньте кишки влево от животного, чтобы обнажить заднюю полую вену.
   8. Положите марлевую салфетку на печень, а указательный и средний пальцы положите на печень.
   9. Другой рукой введите иглу, скошенную вверх, в полую вену на полости промежутка между соединением почечных сосудов и бифуркацией подвздошной кости.
   10. Медленно выводите кровь, оказывая давление на печень.

Рисунок 4. Забор крови из задней полой вены.