Забор крови I

Забор крови является общим требованием для нескольких научных исследований с участием мышей и крыс. Выбор метода забора крови у этих животных зависит от многих факторов, таких как необходимый объем крови, частота забора крови, состояние здоровья животного, которое будет обескровлено, и уровень квалификации техника.

Здесь мы рассмотрим эти соображения и опишем процедуры забора крови, включая ретроорбитальное кровотечение из глаз, хвостовые ножи и порезы, а также забор внутрисердечной крови. О других способах смотрите во втором видео этой серии.

Прежде чем углубиться в протоколы забора крови, давайте сначала рассмотрим некоторые общие соображения, включая тип образца, выбор иглы и максимальный объем крови, который можно собрать. Перед сбором крови у мыши или крысы необходимо определить тип необходимого образца крови. Для экспериментальных процедур может потребоваться цельная кровь, плазма или сыворотка.

При сборе цельной крови в образец необходимо добавить антикоагулянт для предотвращения свертывания. Обычно используемые антикоагулянты включают гепарин, цитрат натрия и этилендиамин тетрауксусную кислоту, сокращенно ЭДТА. Антикоагулянты можно загружать непосредственно в шприц для нанесения покрытия на поверхности. Это позволяет антикоагулянту контактировать непосредственно во время забора крови, что способствует предотвращению свертывания. Поскольку кровь грызунов быстро сворачивается, важно использовать правильное соотношение антикоагулянта и крови. Для сбора плазмы необходимо центрифугировать цельную кровь с антикоагулянтом. После вращения полупрозрачная жидкость над лейкоцитами и слоем тромбоцитов является плазмой. Он содержит фибриноген и другие факторы свертывания. С другой стороны, сыворотка собирается из образца цельной крови БЕЗ антикоагулянтов. А поскольку образец свернулся, сыворотка, которая является основным игроком, не содержит фибриногена или других факторов свертывания.

Выбор иглы основывается на размерах животного и месте проведения венепункции. В целом, иглы с большим отверстием наносят меньший вред клеткам крови и позволяют быстрее собирать кровь; но с большей вероятностью нанесут ущерб судну. Также следует учитывать длину иглы. Если игла слишком длинная, ее использование может быть неудобным, или кровь может начать сворачиваться, пока она еще находится внутри иглы. Выбор размеров варьируется от 18 до 29 калибра и от 0,5 до 1,5 дюймов в длину. Подходящий размер иглы для каждого метода будет обсуждаться в разделе «Процедуры».

Наконец, из-за небольших размеров грызунов существует максимальное количество крови, которое можно собрать из одного забора крови, что не нанесет серьезного вреда организму. Забор крови может быть без или с заменой жидкости - обычно это делается с использованием 0,9% физиологического раствора. Верхний предел в каждом конкретном случае указан в текстовом протоколе ниже. Кроме того, некоторые эксперименты требуют многократного сбора образцов, и в таких случаях, наряду с заменой жидкости, животным потребуется время между промежутками для пополнения клеток крови. Опять же, существует максимальная сумма, которая может быть собрана во время серийного сбора, а верхние пределы указаны в протоколе ниже.

Рассмотрев некоторые общие соображения, давайте перейдем к конкретным методам забора крови, начиная с ретроорбитального кровотечения - метода, используемого учеными для сбора небольших объемов из сосудов рядом с глазом. Обратите внимание, что анатомическое строение орбитальной области у мыши и крысы отличается. У крыс есть сплетение сосудов, которые протекают за глазом, тогда как у мыши есть набор сосудов, которые создают ретро-орбитальный синус, что облегчает выполнение этой процедуры у мышей.

Начните с захвата пробирки для сбора крови. Предпочтительны микрогематокритные пробирки, вмещающие 50-75 микролитров. Постелите на рабочую поверхность несколько бумажных полотенец или других изоляционных материалов. Это необходимо для поддержания тепла тела животного во время процедуры. Теперь обезболите животное с помощью ингаляционного анестетика, такого как изофлуран. Как только животное будет полностью обезболито, извлеките его из камеры и положите на бок, который находится в боковом лежачем положении. Затем поместите палец на макушку головы и вдоль линии челюсти и потяните кожу назад и вниз, чтобы вызвать выпячивание глаза. Избегайте давления на трахею, так как это может привести к смерти от асфиксии. Затем поместите микрогематокритическую трубку в медиальный кантус глаза и направьте ее каудально под углом от 30 до 45 градусов от плоскости носа. Надавливайте, осторожно вращая трубку. Это приведет к перерезанию конъюнктивальных оболочек и разрыву глазного сплетения или синуса. Кровь будет поступать в гематокритную трубку за счет капиллярного действия. Избегайте проталкивания трубки настолько глубоко, чтобы не задеть кость в задней части глазной полости. Как только кровь начнет течь, поддерживайте давление, чтобы глаз оставался выпуклым. Чтобы остановить кровотечение, отпустите кожу и позвольте глазу вернуться в нормальное положение. Надавливайте для стимулирования гемостаза. При повторном сборе образцов дайте не менее 10 дней между сбросами пробы. Это дает тканям некоторое время для заживления.

Хотя ретроорбитальное кровотечение является распространенной процедурой, существует много опасений по поводу ее гуманности. К ним относится отек из-за чрезмерного движения гематокритной трубки. Это, в свою очередь, может вызвать выпячивание глазного яблока и затруднить смыкание века, что приведет к высыханию роговицы, повреждению и боли, что может спровоцировать расчесывание и членовредительство. Неправильное размещение гематокритической трубки может привести к разрыву зрительного нерва, что приведет к слепоте. Еще одно возможное осложнение заключается в том, что глаз может быть вытеснен из орбиты, что позволит векам опуститься за глазное яблоко. Кроме того, проблемы могут возникнуть из-за перелома хрупких костей орбиты, проникновения глазного яблока, приводящего к потере стекловидного тела, или образования гематомы за глазом, что может привести к сильной боли. Несмотря на все эти опасения, если процедуру проводит квалифицированный техник и животное полностью обезболивается, ретроорбитальное кровотечение является эффективным методом забора крови у грызунов.

Теперь рассмотрим соображения и процедуры по обескровливанию хвоста, что позволяет собирать серийные образцы небольших объемов. Оборудование, необходимое для проведения этой процедуры, включает в себя стерильный скальпель No 11. Ножницы не следует использовать, потому что разрез, сделанный ножницами, является раздавливанием, что может способствовать свертыванию крови и снижению кровотока. Другими инструментами являются удерживающая трубка, которая обеспечивает доступ к хвосту животного; впитывающие бумажные полотенца; Сбор гематокрита по пробиркам и кровоостанавливающий порошок - для помощи в гемостазе.

Начните с фиксации животного в удерживающей трубке. Затем протрите хвост теплой водой, чтобы удалить мусор и вызвать небольшое расширение сосудов. НЕ используйте горячую воду. Вытяните хвост и лезвием скальпеля отрежьте самый конец хвоста, чтобы собрать кровь с помощью гематокрита или пробирок для сбора. Хвост можно гладить или «доить» от крупа до кончика, чтобы стимулировать кровоток. Однако это приведет к снижению качества образца.

Чтобы остановить кровотечение, надавите на кончик хвоста марлевой салфеткой. Кровоостанавливающий порошок может быть использован для достижения гемостаза. Проверяйте животных каждые 5-10 минут, чтобы убедиться, что гемостаз достигнут, который может быть отложен после повторного отбора проб. Образец, взятый из хвостового ножа, может содержать как артериальную, так и венозную кровь, а также загрязнение тканевых продуктов. Тем не менее, эта процедура забора крови позволяет проводить серийные сборы путем разрушения струпа или сгустка первоначального разреза на конце хвоста.

Альтернативным методом забора крови после хвостового ножа является зазубрин хвостового сосуда, который является относительно менее инвазивным. Для этого с помощью того же лезвия скальпеля сделайте небольшой надрез непосредственно над боковой хвостовой жилой, примерно на две трети расстояния от крестца. Как и при хвостовых ножницах, кровь может быть собрана в сборные или гематокритные пробирки. И обязательно нужно обеспечить гемостаз, надавливая на участок и повторно проверяя животное каждые 5-10 минут. Однако, как и в случае с ножом хвоста, образцы могут быть загрязнены тканевыми продуктами.

Часто исследования, которые требуют большого объема образца крови, который проводится путем обескровливания через внутрисердечное кровотечение или каудальную полую вену.

Для внутрисердечного метода у мышей вам понадобится шприц объемом 3 куб. см с иглой 22-25 калибра 1 дюйм. А для крыс предпочтительнее шприц объемом 10-12 куб. см с иглой 18 калибра 1,5 дюйма. Ознакомьтесь с протоколом ниже, чтобы понять, почему эти потребности и шприцы являются идеальными.

Начните с усыпления животного с использованием углекислого газа. После эвтаназии держите грызуна за загривок так, чтобы тело висело вертикально. Это ограничение имеет решающее значение, так как тело должно быть прямым, чтобы предотвратить искривление сердца или скручивание грудной клетки. Обратите внимание, что сердце расположено примерно на уровне локтя. Сторона введения находится в выемке слева от мечевидной кости, параллельно позвоночнику и под ребрами.

Введите иглу, скошенную вверх, в грудную клетку и проколите сердце. Надавите шприцем на небольшой уровень обратного давления. Если игла находится в сердце, кровь будет поступать в шприц. Подождите, пока кровь заполнит бочку, прежде чем добавлять дополнительное противодавление. Примерно половина общего объема крови может быть собрана у мыши или крысы с помощью пункции сердца. Это эквивалентно примерно 1 мл крови средней мыши и примерно 10 мл крови средней крысы

Альтернативным положением является лежачее положение в спине при использовании бокового доступа. В этом случае поместите иглу между ребрами с левой стороны животного. Точка входа измеряется относительно точки локтя на грудной стенке. Введите иглу скосом вверх, перпендикулярно плоскости стола в точке посередине грудной стенки. Слегка надавите на спину шприцем. Если игла находится в сердце, кровь будет поступать в шприц. Опять же, подождите, пока кровь заполнит бочку, прежде чем добавлять дополнительное обратное давление. Обратите внимание, что в любом положении чрезмерное обратное давление может разрушить сердце, закупоривая скос иглы и остановив приток крови к шприцу.

Другой метод сбора сердечной крови осуществляется через каудальную полую вену. Оборудование, необходимое для этой процедуры, включает в себя подходящий шприц с прикрепленной иглой правильного размера; ножницы для вскрытия брюшной полости, небольшие атравматичные щипцы для большого пальца и марлевая губка. Эта техника требует, чтобы животное было глубоко обезболено и находилось под наркозом на протяжении всей процедуры. Наркоз СО2 не является вариантом, так как для этой процедуры сердце животного должно биться. Поместите животное в положение лежа на спине и закрепите конечности на платформе. Конечности должны быть вытянуты в сторону от тела.

Теперь приподнимите кожу с помощью щипцов и с помощью ножниц сделайте небольшой поперечный надрез кожи чуть выше таза у женщин или крайней плоти у самцов. Далее поместите острие ножниц в разрез и сделайте разрез по средней линии через кожу от таза или крайней плоти до мечевидной кости. С боковым отражением кожи поднимите мышцу и сделайте небольшой поперечный разрез через мышцу, чуть выше среза кожи.

Поместите острие ножницы в область живота и сделайте разрез по средней линии через мышцу к мечевидной кости. Обязательно наклоните ножницы острием вверх, чтобы предотвратить порез органов. Разрежьте поперечно по изгибу ребер с каждой стороны. Будьте осторожны, чтобы не проколоть печень. Осторожно сдвиньте кишки влево от животного, чтобы обнажить заднюю полую вену. Положите марлевую салфетку на печень и положите на нее указательный и средний пальцы. Другой рукой введите иглу, скошенную вверх в полую вену, на полости промежутка между соединением почечных сосудов и бифуркацией подвздошной кости. Медленно выводите кровь, оказывая давление на печень.

Избегайте движений рукой, так как это может привести к разрыву сосуда. Кроме того, слишком быстрый забор крови может привести к тому, что сосуд схлопнется на скос, закупоривающий отверстие и препятствующий сбору крови. Основным преимуществом данной методики является возможность сбора стерильного образца, поскольку игла не проходит через кожу.

Наконец, давайте рассмотрим некоторые применения этих методов забора крови. Иммуноонкология является развивающейся областью, и исследователи в этой области часто проводят забор крови для изучения иммунных клеток на разных стадиях развития рака. Например, здесь исследователи собрали сердечную кровь у мышей-носителей рака, чтобы изолировать и количественно определить нейтрофилы через десять, двадцать и тридцать дней после приживления опухоли.

С другой стороны, состав крови также часто изучается физиологами. Как и в этом исследовании, ученые были заинтересованы в оценке функции почек у животных с диабетом. Чтобы сделать это, эти ученые сначала ввели краситель в животную модель с диабетом. Затем они использовали метод хвостового ножа для сбора крови в нескольких временных точках для оценки концентрации красителя в крови, который в конечном итоге был использован для расчета скорости клубочковой фильтрации, которая выявила разницу в функции почек после индукции диабета.

Наконец, исследователи стволовых клеток используют образцы крови для оценки успешности включения донорских клеток в организм реципиента. Здесь исследователи сначала пересадили клетки костного мозга самца мыши дикому типу и генетически модифицированному животному с помощью инъекции в хвостовую вену. Затем они собрали кровь из ретроорбитального синуса мыши-реципиента для изучения геномной ДНК клеток крови с помощью полимеразной цепной реакции. Это позволило определить процент приживления донорских клеток у двух видов животных.

Вы только что посмотрели первую часть JoVE о методах забора крови. Пожалуйста, посмотрите следующее видео из серии, чтобы узнать, как выполнять другие часто используемые методы сбора крови у лабораторных животных. Как всегда, спасибо за просмотр!