3.10: Ионообменная хроматография

1. Подготовка образца и колонки

1. В этой демонстрации на катионообменной колонке будет разделена смесь из 2 белков: гемоглобина и цитохрома С. Добавьте 0,2 мл уравновешивающего буфера (pH 8,1) к образцу белка и сделайте вихрь для тщательного перемешивания. Центрифугируйте в течение 2 минут, чтобы удалить пену.
2. Поместите катионобменную колонку в пробирку на 5 минут, чтобы смола осела. Зажмите пробирку с колонкой на кольцевой подставке, чтобы убедиться в ее вертикальном положении.
3. Откройте верхнюю крышку столбца, а затем нижнюю крышку. Дайте буферу в колонке капнуть под действием силы тяжести в пробирку.
4. Дважды промыть колонку с помощью колонки-объема (в данном случае объем колонки составляет 0,3 мл) уравновешивающего буфера. Дайте первой колонке-объему (0,3 мл) уравновешивающего буфера капнуть в пробирку для отходов, прежде чем добавлять вторую колонку-объем. Этот шаг позволяет столбцу уравновеситься с буфером уравновешивания. Медленно добавляйте уравновешивающий буфер на этом этапе, чтобы не повредить смолу.

2. Прогон образца белка через катионообменную колонку

1. Поместите колонку в центрифужную пробирку объемом 2 мл с маркировкой «Unbound 1». Осторожно загрузите 0,1 мл образца белка в верхнюю часть колонки.
2. После того, как образец будет загружен в верхнюю часть колонки, промойте ее 0,3 мл уравновешивающего буфера, добавив буфер в верхней части колонки и дав ему капнуть насквозь. Повторите этот шаг 4 раза (всего 5 стирок) и соберите каждую промывку в отдельную центрифугу объемом 2 мл. Пометьте пробирки как «Без переплетения 1-5».
3. Для последних 2 промывок центрифугируйте в течение 10 с при давлении 1 000 x g, чтобы убедиться, что все несвязанные частицы оторвались от колонки. Любой образец, который привязывается к колонке, не должен находиться в этих смывках, но образец, который не связывается, будет смываться неудержанным. Центрифугирование обеспечивает большее усилие для смывания несвязанных материалов с колонны.
4. Поместите колонку в новую пробирку для сбора центрифуги объемом 2 мл с маркировкой «Bound 1». Нанесите 0,3 мл элюирующего буфера (с высоким содержанием соли, pH 5,5) на вершину колонки. Центрифугировать полученный элюент в течение 10 с при 1 000 x g.
5. Повторите этап элюирования еще 2 раза, поместив колонку в новую центрифужную пробирку, добавив 0,3 мл и центрифугируя в течение 10 с. Обозначьте их "Bound 2 и 3".
6. Записывайте любые изменения цвета или наблюдения за дробями. Гемоглобин — это окрашенный белок, который выглядит красновато-коричневым, в то время как цитохром С имеет красноватый цвет.

3. Результаты: катионный обмен гемоглобина и цитохрома С

1. Цитохром С имеет pI 10,5 и гемоглобин a pI 6,8. Таким образом, при использовании уравновешивающего буфера pH 8,1 гемоглобин не связывается с колонкой, потому что он отрицательно заряжен. Цитохром С положительно заряжен при этом pH и связывается с колонкой, потому что pH < pI.
2. Гемоглобин наблюдается в несвязанных фракциях, потому что он не связан с колонкой.
3. Цитохром С наблюдается в связанных фракциях, потому что он был связан с катионообменной колонкой.

Рисунок 1. Изображение несвязанной фракции (гемоглобина) и связанной фракции (цитохрома С).

Ионообменная хроматография широко используется для разделения и выделения заряженных соединений, особенно крупных биомолекул.

В этом типе жидкостной хроматографии используется колонка из упакованных шариков неподвижной фазы, называемых смолой. Этот метод разделяет аналиты на основе их сродства с заряженной смолой.

Существует два основных вида этой техники. В катионообменной хроматографии отрицательно заряженная смола используется для связывания положительно заряженных аналитов. Аналогично, при анионобмене отрицательно заряженные аналиты связываются с положительно заряженной смолой. Несвязанные соединения промываются через колонку, а затем аналит может быть собран в отдельную емкость.

В этом видео мы познакомимся с основами ионообменной хроматографии, а также продемонстрируем технику разделения белковой смеси в лабораторных условиях.

Неподвижная фаза является ключевым компонентом успешного разделения. Сильнокислотные смолы обычно имеют сильнокислотные функциональные группы, такие как сульфоновая кислота. Слабые катионообменные смолы имеют слабые группы, такие как карбоновые кислоты.

Аналогичным образом, в сильных анионообменных смолах используются сильные основания, такие как четвертичные амины, в то время как в слабых анионообменных смолах используются вторичные или третичные амины. Выбор смолы будет зависеть от свойств образца смеси, а также от интересующего аналита.

Используемые буферы, в совокупности называемые подвижной фазой, также важны для разделения, особенно с точки зрения pH. Для белков pH выбирается на основе их изоэлектрической точки, или pI. При pH, равном pI белка, белок является нейтральным. Выше pI он будет иметь чистый отрицательный заряд, в то время как ниже pI он будет иметь чистый положительный заряд. Буферный pH должен быть подобран таким образом, чтобы белок был правильно заряжен и мог связываться со стационарной фазой.

Ионообменная хроматография, как правило, представляет собой четырехступенчатый процесс. Во-первых, насадочная колонка, содержащая анионную или катионообменную смолу, уравновешивается с помощью буфера. Для анионообменных колонок это включает в себя протонирование смолы, обеспечивающее ее положительный заряд.

Далее образец загружается в колонку. Буфер должен иметь низкую проводимость, так как заряженные вещества могут конкурировать с образцом за взаимодействие со смолой. Соединения с противоположным зарядом связываются со смолой. Молекулы, которые не заряжены или несут тот же заряд, остаются несвязанными.

На третьем этапе колонка промывается дополнительным буфером, чтобы удалить несвязанные компоненты из колонки, оставляя связанные.

Наконец, четвертым этапом является элюирование связанного аналита. Это достигается либо за счет использования градиента соли, при котором концентрация соли постепенно увеличивается, либо за счет использования буфера с высоким содержанием соли.

Молекулы, которые слабо связаны, будут элюированы в первую очередь, так как с низким содержанием соли легче всего нарушить их ионную связь со смолой. Соединения, которые более прочно связаны, будут элюироваться с более высокими концентрациями солей.

Теперь, когда мы разобрались с основами ионообменной хроматографии, давайте рассмотрим ее использование при разделении двух белков.

Во-первых, чтобы подготовить белковую смесь к отделению, добавьте 0,2 мл связующего буфера, и вортекс тщательно перемешать. Затем центрифугируйте смесь, чтобы удалить пену. Чтобы подготовить катионитановую колонну, зажмите ее вертикально на кольцевой подставке и дайте смоле отстояться.

Откройте верхнюю крышку колонны, а затем нижнюю. Дайте буферу капнуть под действием силы тяжести в трубку внизу.

Чтобы подготовить колонку, уравновесьте ее, загрузив колонку-объем буфера, в данном случае 0,3 мл. Дайте буферу капнуть из колонки в пробирку для отходов. После того, как объем столбца буфера выйдет, повторите шаг уравновешивания.

Чтобы провести эксперимент, поместите под колонку центрифужную пробирку объемом 2 мл с надписью «Unbound 1». Осторожно загрузите 0,1 мл образца белка в верхнюю часть колонки.

После того, как образец будет загружен, промойте его с помощью буферной колонки и дайте ей пройти. Повторите в общей сложности 5 стирок. Соберите каждую стирку в отдельную пробирку с пометками от "Unbound 1" до "5".? Для последних 2 промывок центрифугируйте колонку в течение 10 с, чтобы убедиться, что все несвязанные вещества смываются с колонны. Поместите колонку в новую пробирку для сбора центрифуги объемом 2 мл и пометьте ее "Bound 1". Загрузите 1 столбец-объем элюирующего буфера поверх столбца. Центрифуга в течение 10 с при 1 000 x g.

Повторите шаг элюирования еще 2 раза, чтобы обеспечить сбор связанного аналита. Пометьте пробирки "Bound 2" и "3".? Записывайте любые изменения цвета или наблюдения за дробями.

В этом примере гемоглобин и цитохром С были разделены. Гемоглобин имеет pI 6,8, в то время как цитохром C имеет pI 10,5. В буфере pH 8,1 гемоглобин отрицательно заряжен и не связывается с колонкой. И наоборот, цитохром С положительно заряжен при pH 8,1 и связывается с колонкой.

Гемоглобин, белок коричневатого цвета, был обнаружен в несвязанных фракциях, в то время как цитохром С, белок красноватого цвета, наблюдался в связанной фракции.

Существует множество форм жидкостной хроматографии, каждая из которых обладает различными способностями разделять компоненты смеси.

В этом примере использовалась колоночная хроматография для разделения смеси одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. Гидроксиапатит, или ГК, представляет собой кристаллическую форму фосфата кальция, обычно используемую в качестве стационарной фазы из-за положительно заряженных ионов кальция. В этом случае колонка HA была идеальной для разделения ДНК, поскольку она может связываться с отрицательно заряженным остовом ДНК.

Другой формой колоночной хроматографии, часто используемой для разделения белков, является иммобилизованная аффинная хроматография металлов, или IMAC. В IMAC стационарная фаза обладает лигандом с ионом металла, который связывается с меткой гистидина на интересующем белке.

Все остальные компоненты смеси выходят из колонны. Затем белок элюируют раствором имидазола, который имеет структуру, сходную с гистидином, и сильнее связывается с ионом металла.

Распространенным применением колоночной хроматографии является высокоэффективная жидкостная хроматография, или ВЭЖХ. ВЭЖХ широко используется в аналитической химии как для идентификации, так и для разделения биологических и небиологических соединений в смеси.

ВЭЖХ похожа на колоночную хроматографию, показанную в этом видео, за исключением того, что она автоматизирована и работает при очень высоком давлении. Это позволяет использовать шарики неподвижной фазы меньшего размера с более высоким отношением площади поверхности к объему. Таким образом, возможно улучшенное взаимодействие между неподвижной фазой и компонентами в подвижной фазе.

Вы только что посмотрели введение JoVE в ионообменную хроматографию. Теперь вы должны понять концепции, стоящие за этим, 4 шага и некоторые связанные с ними техники.

Спасибо за просмотр!