Ионообменная хроматография

1. Подготовка образца и колонки

1. В этой демонстрации на катионообменной колонке будет разделена смесь из 2 белков: гемоглобина и цитохрома С. Добавьте 0,2 мл уравновешивающего буфера (pH 8,1) к образцу белка и сделайте вихрь для тщательного перемешивания. Центрифугируйте в течение 2 минут, чтобы удалить пену.
2. Поместите катионобменную колонку в пробирку на 5 минут, чтобы смола осела. Зажмите пробирку с колонкой на кольцевой подставке, чтобы убедиться в ее вертикальном положении.
3. Откройте верхнюю крышку столбца, а затем нижнюю крышку. Дайте буферу в колонке капнуть под действием силы тяжести в пробирку.
4. Дважды промыть колонку с помощью колонки-объема (в данном случае объем колонки составляет 0,3 мл) уравновешивающего буфера. Дайте первой колонке-объему (0,3 мл) уравновешивающего буфера капнуть в пробирку для отходов, прежде чем добавлять вторую колонку-объем. Этот шаг позволяет столбцу уравновеситься с буфером уравновешивания. Медленно добавляйте уравновешивающий буфер на этом этапе, чтобы не повредить смолу.

2. Прогон образца белка через катионообменную колонку

1. Поместите колонку в центрифужную пробирку объемом 2 мл с маркировкой «Unbound 1». Осторожно загрузите 0,1 мл образца белка в верхнюю часть колонки.
2. После того, как образец будет загружен в верхнюю часть колонки, промойте ее 0,3 мл уравновешивающего буфера, добавив буфер в верхней части колонки и дав ему капнуть насквозь. Повторите этот шаг 4 раза (всего 5 стирок) и соберите каждую промывку в отдельную центрифугу объемом 2 мл. Пометьте пробирки как «Без переплетения 1-5».
3. Для последних 2 промывок центрифугируйте в течение 10 с при давлении 1 000 x g, чтобы убедиться, что все несвязанные частицы оторвались от колонки. Любой образец, который привязывается к колонке, не должен находиться в этих смывках, но образец, который не связывается, будет смываться неудержанным. Центрифугирование обеспечивает большее усилие для смывания несвязанных материалов с колонны.
4. Поместите колонку в новую пробирку для сбора центрифуги объемом 2 мл с маркировкой «Bound 1». Нанесите 0,3 мл элюирующего буфера (с высоким содержанием соли, pH 5,5) на вершину колонки. Центрифугировать полученный элюент в течение 10 с при 1 000 x g.
5. Повторите этап элюирования еще 2 раза, поместив колонку в новую центрифужную пробирку, добавив 0,3 мл и центрифугируя в течение 10 с. Обозначьте их "Bound 2 и 3".
6. Записывайте любые изменения цвета или наблюдения за дробями. Гемоглобин — это окрашенный белок, который выглядит красновато-коричневым, в то время как цитохром С имеет красноватый цвет.

3. Результаты: катионный обмен гемоглобина и цитохрома С

1. Цитохром С имеет pI 10,5 и гемоглобин a pI 6,8. Таким образом, при использовании уравновешивающего буфера pH 8,1 гемоглобин не связывается с колонкой, потому что он отрицательно заряжен. Цитохром С положительно заряжен при этом pH и связывается с колонкой, потому что pH < pI.
2. Гемоглобин наблюдается в несвязанных фракциях, потому что он не связан с колонкой.
3. Цитохром С наблюдается в связанных фракциях, потому что он был связан с катионообменной колонкой.

Рисунок 1. Изображение несвязанной фракции (гемоглобина) и связанной фракции (цитохрома С).