Анализ для нейронных Индукция в куриных эмбрионах

В данном видео продемонстрированы этапы анализа нейральной индукции в эмбрионе курицы. Сначала эмбрион-реципиент эксплантируют в новую культуру, затем эмбрион-донор эксплантируется в физиологический раствор, и узел Хенсона маркируется флуоресцентным красителем. Узел Хенсона иссекают из эмбриона-донора и трансплантируют в эмбрион-реципиент.

Эмбрион-хозяин культивируют в течение 24 часов, затем фиксируют и подвергают фотоокислению при флуоресцентном освещении с использованием DAB. Далее эмбрион обрабатывают для проведения гибридизации in situ с использованием нейронального маркера.

Здравствуйте, я Дельфин из лаборатории Феннелл Центра экологической и геномной медицины Университета Техаса A&M в Хьюстоне. Сегодня мы продемонстрируем вам методику проведения анализа нейральной индукции в эмбрионе цыпленка. В нашей лаборатории эта процедура используется для изучения влияния противоэпилептических препаратов на нейральные индукционные свойства узла Гензена.

Итак, приступим. Для проведения анализа нейральной индукции необходимо подготовить яйца. Их следует инкубировать в положении на боку во влажном инкубаторе в течение 13 часов до достижения стадии HH3+ по Гамбурге и Гамильтону.

Затем подготовьте эмбрион-хозяин, используя новый метод культивирования, который был продемонстрирован ранее. В JoVE покройте поверхность эмбриона-хозяина 200 µL физиологического раствора. Это облегчит последующий перенос и позиционирование донорского трансплантата.

Наконец, накройте конструкцию перевернутой чашкой для культивирования Falcon диаметром 35 мм. Чтобы извлечь эмбрион-донор, вскройте яйцо, осторожно постучав по скорлупе пинцетом. Удалите верхнюю часть скорлупы и выбросьте ее.

Удалите плотный альбумин с помощью пинцета и наклоните желточный мешок грубым пинцетом так, чтобы эмбрион был обращен вверх. После удаления альбумина с помощью тонких ножниц вырежьте квадрат из желточного мешка вокруг эмбриона. Извлеките эмбрион из желтка ложечкой и перенесите в чашку с PBS.

Затем с помощью пинцета отделите донорский эмбрион от желтка и области lucida. После отделения перенесите донорский эмбрион в чашку с крышкой SIL guard, содержащую PBS, для маркировки и трансплантации графта. Используя микроэлектродный пуллер, вытяните под микроскопом стеклянные микрокапиллярные пипетки объемом 50 µL.

Отрежьте кончик микропипетки с помощью тонкого пинцета. Поместите микропипетку в чашку Петри, выстланную полоской модерирующего пластилина. Затем приготовьте раствор красителя, который будет использоваться для маркировки трансплантата перед пересадкой.

Сначала приготовьте стоковый раствор красителя DiI в 1 мл абсолютного этанола в концентрации 0,5%. Этот стоковый раствор можно хранить при температуре -20 °C в темноте. Затем в термоблоке, установленном на 45 °C, смешайте предварительно нагретые 10 µL стокового раствора DiI с 90 µL 0,3 M сахарозы. Данная температура необходима для предотвращения преципитации DiI и образования нерастворимых кристаллов.

Кратковременно центрифугируйте раствор в мини-центрифуге SPECT в течение 5–10 секунд. Теперь раствор DAI готов к использованию. С помощью энтомологических булавок закрепите эмбрион-донор на дне чашки с ограничителем (sill guard) дорсальной стороной вверх. После закрепления эмбриона заполните микропипетку раствором D eye, приложив легкое давление.

Используя аспирационную трубку в сборе, введите небольшую порцию красителя в узел Хенсона. Повторите процедуру, убедившись, что весь узел Хенсона помечен.

С помощью микрокапиллярной пипетки или микродиссекционного ножа вырежьте узел Хенсона; дорсальную сторону узла можно отличить от вентральной по наличию бороздки, тогда как вентральная сторона узла плоская. При необходимости пометьте дорсальную сторону трансплантата карминовым порошком. Это обеспечит правильную дорсо-вентральную ориентацию при позиционировании трансплантата.

С помощью пипетки Gilson на 10 мкл перенесите трансплантат в эмбрион-хозяин, используя микрокапиллярную пипетку. Подведите трансплантат к area lucida — непрозрачной пограничной области на уровне узла Хенсона эмбриона-хозяина. Затем с помощью микрокапиллярной пипетки или микродиссекционного ножа сделайте небольшой разрез размером от 80 до 100 мкм в этой области.

Определите непрозрачную границу области Lucita на уровне узла Хенсона эмбриона реципиента. Используя микрокапиллярную пипетку или микродиссекционный нож, расположите трансплантат так, чтобы его вентральная сторона была обращена к вам, а задний конец располагался параллельно соответствующей области эмбриона реципиента. После позиционирования удалите физиологический раствор из эмбриона реципиента, убедившись, что трансплантат остается в непосредственной близости от места имплантации, и поместите эмбрион реципиента на новый культивируемый раствор на 18–22 часа, как описано в нашей предыдущей публикации.

После 24 часов культивирования эмбрион извлекают из инкубатора и фиксируют булавками в чашке для сигар. PBS удаляют и заменяют 4% параформальдегидом. Затем эмбрион фиксируют в течение 24 часов.

Утилизируйте фиксатор в подходящий контейнер для опасных отходов и добавьте PBS в чашку для фиксации. Извлеките энтомологические булавки с помощью пинцета после того, как они будут вытащены. Используя пастуровскую пипетку с закругленным концом, перенесите эмбрион в мерный флакон для сцинтилляции, содержащий PBS.

Дважды промойте эмбрион в PBS по пять минут каждый раз, затем один раз в Tris-буфере в течение пяти минут; после промывки перенесите эмбрион на предметное стекло с лункой, содержащее 0,1 мл Tris-буфера. Замените раствор Tris-буфера на 0,1 мл раствора DAB. Утилизируйте наконечник в контейнере с раствором отбеливателя.

Для деконтаминации DAB поместите покровное стекло поверх предметного стекла с лункой под фокус флуоресценции флуоресцеинизотиоцианата FEI. Объектив микроскопа при наведении на донорские клетки трансплантата покажет флуоресцентный красный цвет; подвергайте их воздействию флуоресценции FEI до тех пор, пока все флуоресцентно-красные клетки не станут коричневыми. Это происходит в результате фотопревращения флуорохрома в нерастворимые коричневые кристаллы под воздействием длины волны возбуждения FEI.

4 88 нанометров в присутствии dab. Этот процесс занимает от 20 минут до двух часов. После завершения реакции фотоокисления снимите покровное стекло с помощью тонкого пинцета.

Перенесите эмбрион в сцинтилляционный флакон объемом 20 milliliter, содержащий PBTW или PBS с 0,1% tween 20. В завершение удалите остатки DAB с покровного стекла, предметного стекла и из лунки. Обработайте эмбрион раствором отбеливателя путем инкубации для подготовки к визуализации.

Проведите гибридизацию in situ, инкубируя эмбрион только с зондом, меченным DIG. Затем приступите к фотографированию и созданию срезов, как описано во втором видео JoVE. Ниже приведен пример анализа нейральной индукции.

Изначально трансплантат помещают на границу между area lucita и area alpaca эмбриона реципиента. Эмбрионы донора и реципиента находятся на стадии 3+. Через девять часов культивирования трансплантат начинает дифференцироваться и индуцировать структуру, напоминающую миниатюрную голову стадии 8-.

После 24 часов культивирования и последующей фиксации нейральная индукция завершена. Эмбрион подвергается обработке для фотоокисления. Первоначально видно, что меченые красителем клетки донора пролиферировали, образовав миниатюрную нейру, показанную здесь красным цветом.

После фотоокисления эти клетки приобретают коричневый цвет. Затем эмбрион подвергается гибридизации in situ на целом препарате для выявления нейрального маркера Otx2, разработанного в лаборатории доктора Бонелли.

Показано, что донорский трансплантат индуцирует экспрессию OTX two в тканях реципиента. Мы только что продемонстрировали, как проводить анализ нейральной индукции в эмбрионе цыпленка. При выполнении этой процедуры важно не забыть удалить всю жидкость в области вокруг трансплантата после пересадки с помощью пипетки.

Это обеспечит надежную фиксацию трансплантата и предотвратит его смещение относительно эмбриона реципиента в процессе культивирования. На этом всё. Спасибо за внимание и удачи в ваших экспериментах.