Анализ для нейронных Индукция в куриных эмбрионах

Нейронные индукции является первым шагом в формировании мозга. Это механизм, посредством которого узел Гензена (организатор), инструктирует соседних тканей принять нейронных судьба, то есть привести к нервной системе. Это видео демонстрирует тест для нейронных индукции в куриных эмбрионах.

В этом видео демонстрируются различные этапы анализа нервной индукции у куриного эмбриона. Сначала эмбрион хозяина эксплантируется В новой культуре донорский эмбрион эксплантируется в физиологический раствор, а узел Хенсона помечается флуоресцентным красителем. Узел Хенсона вырезается из донорского эмбриона и трансплантируется эмбриону-хозяину.

Эмбрион хозяина культивируется в течение 24 часов, фиксируется и обрабатывается для фотоокисления под действием флуоресценции фей. С даб. Эмбрион обрабатывают для гибридизации in situ с помощью нейрального маркера.

Здравствуйте, я Дельфина из Лейбористской больницы Феннелла в Центре экологической и геномной медицины Техасского университета А и М в Хьюстоне. Сегодня мы покажем вам процедуру проведения анализов нервной индукции у щечного эмбриона. Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения влияния противоэпилептических препаратов на нейронные индуцирующие свойства узла Хансена.

Итак, приступим. Для проведения анализа нервной индукции необходимо подготовить яйцеклетки. Эти яйца следует инкубировать, лежа на боку во влажном инкубаторе в течение 13 часов, чтобы гамбургер и Гамильтон стадии три плюс или HH три плюс.

Далее подготавливают эмбрион хозяина с помощью нового метода культивирования, который был продемонстрирован ранее. В JoVE покройте поверхность эмбриона хозяина 200 микролитрами физиологического раствора. Это облегчит последующий перенос и позиционирование донорского трансплантата.

Наконец, накройте сборку перевернутой 35-миллиметровой чашкой для культуры Falcon. Чтобы представить донорский эмбрион, откройте яйцеклетку, постукивая щипцами по скорлупе. Снимите верхнюю часть скорлупы и выбросьте.

Удалите густой альбумин с помощью щипцов и наклоните желточный мешок грубыми щипцами так, чтобы эмбрион был обращен вверх. После удаления альбумина с помощью тонких ножниц вырежьте квадратный желточный мешок вокруг эмбриона. Извлеките зародыш из желтка ложкой и поместите в посуду, содержащую PBS.

Далее с помощью щипцов отсоедините донорский эмбрион от желтка и области люсита. После того, как эмбрион будет отделен, перенесите донорский эмбрион в чашку, покрытую защитой SIL, содержащую PBS, чтобы пометить и пересадить трансплантат. С помощью съемника микроэлектродов вытяните стеклянные микрокапиллярные пипетки объемом 50 микролитров под микроскопом.

Разрежьте кончик микропипетки с помощью тонких щипцов. Поместите микропипетку в чашку Петри, выстланную лентой из пластилина. Далее приготовьте раствор красителя, который будет использоваться для маркировки трансплантата перед трансплантацией.

Во-первых, приготовьте запас глазного красителя в одном миллилитре, абсолютного этанола в концентрации 0,5%Этот запас можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в темноте. Затем в нагревательный блок, установленный на 45 градусов Цельсия, смешивается предварительно подогретый 10 микролитров дайского бульона до 90 микролитров, 0,3 моляра сахарозы. Эта температура необходима для того, чтобы предотвратить выпадение осадка dai и образование нерастворимых кристаллов.

Кратковременно вращайте раствор на мини-фуге ОФЭКТ в течение пяти-10 секунд. Теперь решение DAI готово к использованию с помощью булавок от насекомых, закрепленных донорским эмбрионом на нижней части защитного кожуха порога, покрытой спинной стороной вверх. После того, как эмбрион будет закреплен, заполните микропипетку D-глазом, слегка надавливая.

С помощью аспираторной трубки в сборе. Нанесите небольшой комок даи на узел Хенсона. Повторите, убедитесь, что весь узел хенсона помечен следующим.

С помощью микрокапиллярной пипетки или микрорассекающего ножа, разрезающего узел Хенсона, можно отличить дорсальную сторону узла от вентральной, поскольку она образует бороздку, в то время как вентральная сторона узла плоская. При необходимости отметьте тыльную сторону прививки порошком кармина. Это обеспечит расположение трансплантата с правильной дорсальной вентральной ориентацией.

С помощью пипетки Жильсона объемом 10 микролитров перенесите трансплантат к эмбриону-хозяину с помощью микрокапиллярной пипетки. Подведите трансплантат близко к области люцита, непрозрачной пограничной области на уровне узла Хенсона эмбриона-хозяина. Затем с помощью микрокапиллярной пипетки или микродиссекционного ножа сделайте небольшой разрез от 80 до 100 микрометров в этой области.

Непрозрачная граница области Lucita на уровне узла Хенсона эмбриона-хозяина. С помощью микрокапиллярной пипетки или микрорассекающего ножа. Расположите трансплантат так, чтобы вентральная сторона была обращена к вам, а задний конец был параллелен эквивалентной области в эмбрионе хозяина O. Оказавшись в положении, удалите физиологический раствор из эмбриона хозяина, убедившись, что трансплантат остается в непосредственной близости от места хозяина, и обработайте эмбрион хозяина для новой культуры в течение 18-22 часов, как описано в нашей предыдущей заявке.

После 24 часов культивирования эмбрион извлекают из инкубатора и прижимают к сигаре. Содержащий P-B-S-P-B-S удаляется и заменяется 4%-ным параформальдегидом. Затем эмбрион фиксируется в течение 24 часов.

Утилизируйте фиксатор в подходящем контейнере для опасных отходов и добавьте PBS в чашку для фиксации. Удалите булавки от насекомых щипцами после того, как булавки были удалены. Используйте пастбищную пипетку с тупым концом, чтобы перенести эмбрион в сцинтилляционный флакон, содержащий PBS.

Промойте эмбрион дважды в PBS в течение пяти минут каждый и один раз в буфере Twist в течение пяти минут после мытья, перенесите эмбрион в стеклянную полость, содержащую 0,1 миллилитров Трис-буфера. Замените раствор трис-буфера на 0,1 миллилитра раствора DAB. Утилизируйте наконечник эйнора в ведро с раствором отбеливателя.

Чтобы обеззаразить DAB, поместите защитное стекло на верхнюю часть предметного стекла полости под фокусом флуоресценции флуоресцеина изотиоцианата FEI. Объектив микроскопа на донорских клетках трансплантата будет казаться флуоресцентным красным цветом и подвергаться воздействию флуоресценции FEI до тех пор, пока все флуоресцентные эритроциты не станут коричневыми. Это происходит в результате того, что флюорохром теста преобразуется в нерастворимые коричневые кристаллы под воздействием длины волны возбуждения FEI.

4 88 нанометров в присутствии dab. Этот процесс занимает от 20 минут до двух часов. После завершения фотоокислительной реакции удалите покровный лист с помощью тонких щипцов.

Перенесите эмбрион в сцинтилляционный флакон объемом 20 мл, содержащий PBTW или PBS с 0,1% tween 20. Наконец, отключите DAB от крышки, слипа и стеклянной полости. Скольжение путем инкубации раствора отбеливателя, чтобы обработать эмбрион для визуализации.

Продолжайте гибридизацию in-situ, инкубируя эмбрион только для зонда, меченного DIG. Далее, начните фотографирование и секционирование, как описано в Видео Джо два. Вот пример анализа нейронной индукции.

Первоначально трансплантат располагается на границе между областью lucita и областью альпаки эмбриона-хозяина. Эмбрионы как донора, так и хозяина находятся на стадии три плюс. После девяти часов в культуре трансплантат начинает дифференцироваться и индуцировать то, что выглядит как миниатюрная стадия восемь минус головка.

После 24 часов в культуре нейронная индукция завершена после фиксации. Эмбрион обрабатывается для фотоокисления. Первоначально было показано, что клетки, меченные глазом, полученные от донора, пролиферировали, образуя миниатюрный Нур, как показано на рисунке красным цветом.

После фотоокисления эти клетки выглядят коричневыми. Затем эмбрион обрабатывают с помощью гибридизации in situ для получения нейрального маркера. О otx два разработаны в лаборатории доктора Бонелли.

Показано, что донорский трансплантат индуцирует экспрессию OTX 2 из ткани, полученной от хозяина. Мы только что показали вам, как провести анализ нервной индукции на щечном эмбрионе. При выполнении этой процедуры важно помнить об удалении всей жидкости в области вокруг трансплантата после трансплантации с помощью трубчатого пэта.

Это гарантирует, что трансплантат будет надежно расположен и что он не будет удаляться от эмбриона-хозяина во время культивирования. Вот и все. Спасибо. Так что наблюдаю и удачи в ваших экспериментах.