1. Подготовка
2. Забор тканей
Источник: Кей Стюарт, RVT, RLATG, CMAR; Валери А. Шредер, RVT, RLATG. Университет Нотр-Дам, Индиана
В 1959 году 3 R были представлены У.М.С. Расселом…
1. Подготовка
2. Забор тканей
Многие эксперименты требуют забора клеток из иссеченной ткани. В таких случаях крайне важно, чтобы процедура забора тканей была выполнена стерильным способом. Использование клеточных линий и тканевых культур, полученных от исследовательских животных, позволяет проводить многие эксперименты in vitro, что, в свою очередь, снижает использование животных в исследованиях.
В этом видео мы обсудим асептический метод забора обычно извлекаемых органов у лабораторных животных. За этим последует краткий обзор нескольких примеров экспериментов с использованием этой стерильной техники для достижения различных исследовательских целей.
Давайте начнем с подготовительных этапов, необходимых для обеспечения стерильности помещения, инструментов и персонала во время забора тканей животных.
Эта процедура выполняется в ламинарном вытяжном шкафу. Перед началом процесса вентилятор вытяжки должен проработать не менее 15 минут, а помещение должно быть продезинфицировано 70% спиртом. Затем положите в капот несколько бумажных полотенец и смочите их 70% этанолом. После этого загрузите стерильное оборудование и организуйте по порядку, в котором будет использоваться каждый инструмент, обычно слева направо. Это позволяет выполнять рабочий процесс в одном направлении, предотвращая случайное загрязнение туши животного.
Рекомендуется, чтобы в помощь ему присутствовал нестерильный техник. Оба оператора должны быть в маске и надувном костюме. Стерильный техник должен надеть стерильный халат и две пары стерильных хирургических перчаток. Обратите внимание, что халат и перчатки должны закрывать запястья, чтобы предотвратить выпадение клеток кожи в открытую полость тела, чашки Петри или стерильные среды.
Нестерильный человек открывает упаковку со стерильным инструментом, не прикасаясь к внутренней поверхности, чтобы стерильный человек мог извлечь инструмент асептическим способом. Наконец, нестерильный техник усыпляет животное, кладет тушу на бумажные полотенца и полностью пропитывает ее 70% спиртом, чтобы стерильный человек мог начать сбор урожая.
Во-первых, мы рассмотрим удаление органов брюшной полости, включая селезенку, печень, почки, яичники и яички.
С помощью набора стерильных ножниц и щипцов сделайте горизонтальный надрез на коже прямо перед крайней плотью у мужчин и тазовой костью у женщин. Избегайте разрезания брюшной мускулатуры. Затем поместите большой палец под порез и возьмитесь за краниальный край разреза. Другой рукой надежно удерживайте задние конечности и хвост, при этом подтягивая кожу к голове. Кожа будет отрываться от тела чуть выше задних конечностей, и может быть вывернута наизнанку над головой и передними ногами. Это эффективно удаляет загрязнения волос, которые могут помешать стерильному извлечению органов. Затем снова замочите тело в 70% спирте и снимите поверхностную пару перчаток, которые уже не являются стерильными. Также выбросьте на кожу все инструменты, которые были использованы.
Чтобы собрать селезенку, расположите тело в правом боковом положении лежа. Селезенка должна быть видна через мышцы живота. С помощью ножниц сделайте надрез непосредственно над селезенкой, и аккуратно втяните орган из полости тела. Разрежьте все прикрепления между селезенкой и тканью желудка и поджелудочной железы, но избегайте прокола или разрыва органа.
Чтобы извлечь все остальные органы брюшной полости, поместите тело в лежачее положение на спине. Затем поднимите и отрежьте мышцу живота, оставив овальное отверстие непосредственно над брюшной полостью. Чтобы извлечь печень, отразите орган каудально в сторону от диафрагмы. Теперь с помощью ножниц аккуратно разрежьте любые мембраны между двумя структурами. Далее сделайте надрез перпендикулярно позвоночнику через кровеносные сосуды. Затем поднимите печень и направьте ее к диафрагме, чтобы визуализировать прикрепления под ней. Будут тонкие мембраны, прикрепляющие меньшие доли печени к желудку и тонкой кишке. Возьмитесь за фиброзный узел в центре печени с нижней стороны и приподнимите орган, чтобы найти все прикрепления. Теперь отделите орган от подлежащих тканей. Обратите внимание, что печень хрупкая и может быть легко проколота, что приведет к чрезмерному выделению крови. Поэтому обращаться с ним нужно аккуратно.
Чтобы собрать почки, протолкните кишечник влево, чтобы обнажить правую почку, или вправо, чтобы обнажить левую почку. Теперь с помощью лезвий щипцов захватите под почку и с помощью ножниц разрежьте под щипцами, извлекая орган из тела.
Чтобы собрать яичники, двигайте кишечником краниально, чтобы визуализировать матку. Следуйте левым и правым маточным рогам к яичникам. Это небольшие органы, и у старых животных они могут быть вкраплены в жир. Проденьте щипцы под яичник, чтобы изолировать его от тела и освободить от жира и фаллопиевой трубы.
У самцов для удаления семенников аккуратно возьмитесь за паховую жировую подушку и потяните вперед. Это вытянет яичко из мошонки. Как только они станут видимыми, разрежьте прикрепления к мошонке и семявыносящим протокам, чтобы освободить эти структуры от тела.
Далее давайте узнаем, как извлекать данные из грудных органов, таких как сердце и легкие. Сердце и легкие легче всего удаляются вместе. Чтобы открыть грудную полость, начните с помещения животного в спинное лежачее положение. Сначала захватите и подтяните мечевидный отросток. Затем сделайте надрез через мышцу живота как раз каудально к ребрам. Удлините срез по нижнему изгибу грудной клетки с обеих сторон, обнажая диафрагму.
Далее проколите диафрагму, сделав небольшой надрез в грудной клетке в максимально возможной боковой точке с каждой стороны. Затем отрежьте диафрагму от ребер. Теперь поднимите ребра у мечевидной кости, чтобы визуализировать органы грудной клетки. Продлите боковой разрез до верхней части грудины с обеих сторон, чтобы открыть грудную клетку. Затем расположите щипцы перпендикулярно трахее и крепко возьмитесь за дыхательное горло. Теперь с помощью ножниц сделайте перпендикулярный надрез прямо перед щипцами. При этом следует разорвать трахею и пищевод. Не ослабляя хватку на трахее, поднимите ее вверх каудально и обрежьте любые прикрепления легких к поверхности позвоночника в грудной клетке. Продолжайте до тех пор, пока не сможете освободить сердце и легкие от грудной полости.
Чтобы удалить просто сердце, приподнимите орган и аккуратно прорежьте перикардиальный мешок. Далее придерживайте аорту щипцами и сделайте надрез дистальнее щипцов. Затем разрежьте переднюю полую вену, легочные артерии и вены. После этого вы сможете освободить сердце от грудной полости.
Теперь давайте рассмотрим процедуру забора мозга с помощью асептической техники. В тех случаях, когда мозг является единственным органом, который необходимо собрать, этапы подготовки одинаковы.
Чтобы начать сбор урожая, напитайте тело алкоголем и снимите кожу с тела, как и раньше - вверх и над черепом. Это позволяет с этого момента все быть стерильным. Затем снова пропитайте животное спиртом, снимите верхние перчатки и выбросьте инструменты, используемые на коже. Теперь сделайте надрез на затылке и продлите его по средней линии от дорсальной шейной области до кончика носа.
Теперь, используя специальные стерильные ножницы для сбора мозга, сделайте разрез через позвоночник у основания черепа. Чтобы открыть черепную коробку, поместите острие ножниц в большое затылочное отверстие и разрежьте по средней линии. Обратите внимание, что во время этой процедуры извлечения мозга одна рука считается нестерильной, поскольку она захватывает кожу черепа, отраженную под подбородком, чтобы стабилизировать голову, в то время как стерильная рука используется для разрезания черепа. После этого используйте плоский край лезвия ножниц, чтобы отодвинуть теменные кости от мозга. И с помощью шпателя осторожно нарушить нервные прикрепления в стволе мозга и зрительный хиазма под мозгом. Наконец, сдвиньте закрытые щипцы вперед и сломайте крепления на обонятельных луковицах. И мозг затем может быть сброшен с черепа прямо в стерильную среду.
Теперь, когда мы рассмотрели основные принципы забора стерильных тканей, давайте обсудим некоторые из многих применений этой процедуры в биомедицинских исследованиях.
Исследователи нейронных стволовых систем используют метод стерильного сбора для извлечения ткани из неонатального мозга мыши, чтобы вырастить эти клетки in vitro. Это позволяет им изучать роль нейральных стволовых клеток в развитии и прогрессировании рака.
Еще одной активной областью исследований, связанной с забором тканей, является метаболическое профилирование, которое включает в себя изучение физиологии тканей путем анализа различных метаболитов в образце. В этом примере ученые, используя асептический метод, собрали биопсию печени у мышей дикого типа и стерильных мышей и использовали спектроскопию ядерного магнитного резонанса, или ЯМР, чтобы выяснить разницу в метаболическом профиле печени двух популяций животных.
Наконец, иммунологи часто проводят забор стерильных тканей для изучения распространения инфекции. В этом конкретном эксперименте исследователи выполнили внутритрахеальную инъекцию бактерии Pseudomonas aeruginosa, чтобы вызвать хроническую легочную инфекцию. После этого животных усыпляли и извлекали легкие с использованием асептического метода для определения бактериальной нагрузки через 3, 7, 14 и 28 дней после заражения.
Вы только что посмотрели видео JoVE о заборе тканей у лабораторных животных с помощью асептической техники. Теперь вы должны иметь лучшее представление о шагах, которые необходимо предпринять, чтобы обеспечить сохранение стерильности на протяжении всего сбора урожая. И вы должны иметь возможность извлекать органы брюшной полости, грудную клетку, а также мозг у этих животных, не причиняя никакого вреда тканям. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is sterile tissue harvest important in laboratory animal research?
Sterile tissue harvest prevents contamination of cells and organs collected from research animals, which is essential for cell and tissue cultures, protein and RNA analysis, and metabolic profiling. Using harvested tissues for in vitro experiments reduces overall animal usage in research, supporting the replacement principle of the 3 R's framework for humane research practices.
Q2: What equipment and preparation are needed before starting a sterile tissue harvest?
The procedure requires a laminar flow hood running for at least 15 minutes before use. Disinfect the hood with 70% alcohol and place wet paper towels inside. Arrange sterile instruments in order of use from left to right to maintain unidirectional workflow. The sterile technician must wear a sterile gown and two pairs of sterile surgical gloves covering the wrists to prevent skin cell contamination.
Q3: How are abdominal organs like the liver and spleen removed during sterile harvest?
For the spleen, position the animal in right lateral recumbency and cut directly over the organ, gently retracting it while avoiding punctures. For the liver, place the animal in dorsal recumbency, reflect it away from the diaphragm, and carefully sever membranes and blood vessels. The liver is fragile and easily punctured, so handle it carefully to prevent excessive blood release that could compromise tissue quality.
Q4: What is the proper technique for harvesting the heart and lungs together?
Place the animal in dorsal recumbency and open the thoracic cavity by cutting through the abdominal muscle and diaphragm. Puncture the diaphragm at the lateral rib cage and extend cuts to the sternum. Grasp the trachea with forceps and sever it with scissors, then lift and remove lung attachments from the spinal surface until the heart and lungs can be lifted free from the chest cavity.
Q5: How is the brain harvested using aseptic technique?
Strip the skin from the body and over the skull, then saturate with alcohol and remove outer gloves. Make a cut along the midline from the cervical area to the nose. Using dedicated sterile scissors, cut through the spine at the skull base and along the midline through the foramen magnum. Lever the parietal bones away, disrupt nerve attachments with a spatula, and break olfactory bulb attachments with forceps before dropping the brain into sterile media.
Q6: What research applications use sterile tissue harvest techniques?
Neural stem researchers extract tissue from mouse neonatal brains to study stem cell development and cancer progression in vitro. Metabolic profiling studies analyze tissue metabolites using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Immunologists harvest lungs aseptically to measure bacterial load in infection models, collecting samples at multiple time points to track disease progression.
Q7: What roles do sterile and non-sterile technicians play during tissue harvest?
Both technicians wear masks and bouffants. The non-sterile technician euthanizes the animal, places the carcass on paper towels, soaks it with 70% alcohol, and opens sterile instrument packages without touching inner surfaces. The sterile technician wears a sterile gown and two pairs of gloves, removes instruments aseptically, and performs the actual organ extraction to maintain sterility throughout the procedure.
Главы в этом видео
0:00
Overview
1:06
Prepping for Sterility: Space, Instruments, and Personnel
3:04
Harvesting Abdominal Organs
7:08
Harvesting Thoracic Organs
9:12
Harvesting Brain
11:00
Applications
12:02
Summary