Question 1

Почему сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) лучше оптической микроскопии для получения изображений биологических образцов?

Accepted Answer

SEM обеспечивает разрешение до 0,5 нанометра по сравнению с пределом оптической микроскопии в 200 нанометров. Столь высокое разрешение достигается благодаря тому, что длина волны электронного пучка составляет 1 нанометр, в то время как для видимого света она равна 500 нанометрам. SEM также обеспечивает большую глубину резкости, что делает этот метод идеальным для визуализации трехмерных биологических структур и наноструктур, которые невозможно четко распознать с помощью оптических микроскопов.

Question 2

Что происходит при воздействии электронного пучка на биологический образец в СЭМ?

Accepted Answer

Электронный пучок вызывает два типа эмиссии электронов: эмиссию вторичных и обратнорассеянных электронов. Вторичные электроны представляют собой низкоэнергетические электроны, излучаемые с поверхности образца, которые дают топографическую информацию о структуре. Обратнорассеянные электроны отражаются в направлении, противоположном падающему пучку; их интенсивность увеличивается с ростом атомного веса, что позволяет проводить компонентный анализ и выявлять различия в составе материалов.

Question 3

Почему биологические образцы необходимо высушивать перед получением изображений с помощью СЭМ?

Accepted Answer

СЭМ работает в условиях высокого вакуума, что несовместимо с высоким содержанием воды в биологических образцах. В вакууме вода испаряется быстро, что приводит к коллапсу структур образца, особенно в хрупких клетках. Для сохранения нативной структуры при удалении воды образцы обрабатывают фиксаторами, промывают и подвергают медленной дегидратации с использованием возрастающих концентраций этанола.

Question 4

Что такое напыление и почему оно необходимо для получения изображений с помощью СЭМ?

Accepted Answer

Напыление позволяет нанести на биологические образцы тонкий слой металла, как правило, золота толщиной от четырех до шести нанометров. Поскольку биологические материалы не проводят ток, это металлическое покрытие предотвращает накопление заряда от электронного пучка, которое могло бы привести к искажению изображений. Проводящая поверхность обеспечивает точное детектирование электронов и повышение качества изображения при проведении анализа с помощью СЭМ.

Question 5

Чем отличается экологический СЭМ от традиционного СЭМ при получении изображений чувствительных образцов?

Accepted Answer

Экологический сканирующий электронный микроскоп (ESEM) поддерживает газовую среду в камере с образцом, что позволяет получать изображения влажных или ненанесенных покрытием образцов без их высушивания. Две апертуры отделяют камеру электронного пушка с высоким вакуумом от камеры с образцом. Несмотря на то что молекулы газа рассеивают электронный пучок, энергии пучка остается достаточно для визуализации, что позволяет сохранить неразрушенную структуру клеток и обеспечивает возможность исследования гидратированных биологических образцов.

Question 6

Какие этапы подготовки являются критически важными для визуализации таких хрупких биологических структур, как растительные ткани?

Accepted Answer

Хрупкие ткани требуют фиксации в таких растворах, как формалин/уксусная кислота, для стабилизации структуры. Затем ткани подвергают диссекции в этаноле, помещают в сетчатые контейнеры и обезвоживают с помощью серии этанола (70%, 80%, 90% и 100%). Наконец, методом сушки в критической точке удаляют оставшийся растворитель, чтобы предотвратить коллапс структуры, после чего перед визуализацией с помощью СЭМ проводят напыление металла.

Question 7

Какую информацию о биологических материалах может выявить СЭМ, которую невозможно получить с помощью других методов?

Accepted Answer

СЭМ позволяет выявить трехмерные пористые структуры с волокнистыми элементами размером менее 25 микрон, которые трудно визуализировать при исследовании биологических образцов с помощью оптической и конфокальной микроскопии из-за ограниченной глубины резкости. СЭМ также предоставляет данные о топографии, элементном составе и степени кристалличности посредством анализа вторичных и отраженных электронов, что обеспечивает комплексную характеристику нано- и микроструктур.

СЭМ-визуализация биологических образцов - Оценочный тест