Проточная цитометрия и сортировка флуоресцентно-активируемых клеток (FACS): выделение В-лимфоцитов селезенки

1. Подготовка

1. Перед началом работы наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду.
2. Простерилизуйте все инструменты для вскрытия, сначала с помощью моющего средства, а затем с помощью 70% этанола, а затем тщательно высушите.
3. Приготовьте 50 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 2% фетальной сыворотки теленка (FCS).

2. Вскрытие

1. Используя систему доставки углекислого газа, усыпьте мышь путем гипоксии. Закрепите усыпленную мышь на диссекционной пластине в положении лежа на спине и проведите продольную лапаротомию с помощью ножниц и щипцов.
2. С помощью щипцов переместите кишечник и желудок с правой стороны живота, чтобы обнажить живот и селезенку. Селезенка прикрепляется к желудку.
3. С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от желудка и поместите ее в чашку Петри, содержащую 5 мл HBSS 2% FCS.

3. Выделение иммунных клеток

1. Поместите селезенку в ситечко размером 40 мкм над той же чашкой Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее в той же посуде.
2. Перенесите диссоциированную селезенку и жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
3. Центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 минут при 10°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
4. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл ацетата калия для лизиса эритроцитов. Подождите 2 минуты, а затем доведите объем до 15 мл с помощью HBSS 2% FCS.
5. Снова центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 мин при 10°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS 2% FCS.
6. Подсчитайте клетки с помощью теста на окрашивание трипановым синим и отрегулируйте концентрацию клеток до 10⁷ клеток/мл с использованием соответствующего объема HBSS 2% FCS.

4. Окрашивание клеток

1. Перенесите 200 мкл клеточной суспензии в шесть пробирок FACS, помеченных от 1 до 6.
2. Центрифугируйте пробирки при давлении 370 x g в течение 7 минут при 10°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
3. Затем приготовьте шесть новых смесей антител, добавив соответствующее количество антител к 200 мкл HBSS 2% FCS в соответствии с таблицей 1.
4. Затем перенесите эти смеси антител в соответствующие пронумерованные пробирки FACS.
5. Инкубируйте клеточные суспензии, смешанные с антителами, в течение 20 минут на льду в темноте.
6. Добавьте 1 мл HBSS 2% FCS в каждую пробирку, а затем снова центрифугируйте при 370 x g в течение 3 минут при 10°C.
7. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл HBSS 2% FCS.
8. Перенесите ресуспендированные гранулы в новые трубки FACS.

Таблица 1: Состав смеси антител. Для эксперимента было приготовлено шесть смесей 200 мкл антител HBSS +. Mix 1 предназначен для настройки PMT, смеси со 2 по 5 — для настроек компенсации, а mix 6 — для сортировки ячеек.

5. Калибровка FACS

1. Сначала включите сортировщик и выполните "Fluidics Startup."
2. Включите струю и подождите 15 минут, пока струя стабилизируется.
3. Отрегулируйте амплитуду потока, чтобы получить образование отрывных капель. Затем нажмите на "Sweet Spot", чтобы завершить регулировку амплитуды.
4. Установите фильтр нейтральной плотности (N.D.) - 1.0 и откройте интерфейс "CST", который предназначен для настройки и отслеживания цитометра.
5. Для выполнения ежедневного контроля качества сначала разбавьте шарики CST средой FACS в соответствии с инструкциями производителя, а затем выполните контроль CST.
6. После завершения контроля CST замените фильтр N.D. 1.0 фильтром N.D. 2.0 на цитометре.
7. Затем разбавьте шарики задержки в среде FACS, следуя инструкциям производителя, а затем загрузите в FACS.
8. Чтобы обеспечить правильную сортировку, выполните Задержка отбрасывания -
   1. Сначала нажмите "Voltage", а затем "Optical Filter". Правый квадрант должен быть равен 100%. При необходимости отрегулируйте красный лазерный винт на цитометре влево или вправо, чтобы получить 100% в правом квадранте.
   2. Далее выполните тестовую сортировку, чтобы убедиться, что поток попадает в сборную трубку. Для этого нажмите на "Waste Drawer" и запустите "Test Sort". Проверьте, чтобы боковые струи попадали в сборные трубки. Если это не так, отрегулируйте напряжение до тех пор, пока они не сработают.
   3. Перейдите к экспериментальному шаблону. Затем откройте эксперимент "Accudrop Drop Delay" и нажмите на кнопку "Sorting Layout".
   4. Измените скорость потока, чтобы получить от 1000 до 3000 событий в секунду.
   5. Нажмите "Напряжение", а затем "Оптический фильтр". Левый квадрант должен быть равен 0, а правый квадрант равен 100.
   6. В окне "Sort Layout" нажмите на "Sort", а затем нажмите "Cancel". Левый квадрант должен быть равен 100, а правый — 0. Если левый квадрант меньше 95, нажмите "Auto Delay", чтобы автоматически настроить его.

6. Проточная цитометрия и контроль чистоты

1. Начните проточную цитометрию, начав с пробирки 1 (неокрашенные клетки), чтобы определить морфологию клеток и отрицательные пики флуорохров. Настройте прямое и боковое рассеяние и определите напряжения каждого флуоресцентного параметра. Поместите отрицательное население в первую декаду с помощью сетки на каждой точечной диаграмме.
2. Далее загрузите пробирку 2 (одноцветный контроль) в цитометр. Отрегулируйте спектральное перекрытие до тех пор, пока отрицательная и положительная медианы населения не будут выровнены, или используйте программное обеспечение для автоматического расчета. Важно следить за тем, чтобы сигнал соответствовал масштабу. Управление компенсацией должно соответствовать настройкам экспериментальных флуорохромов и детекторов. Рекордные 10 000 событий.
3. Повторите эти действия с трубками 3, 4 и 5 (другие одноцветные элементы управления).
4. Затем загрузите трубку 6 (мультиокрашенные клетки) и определите интересующие популяции клеток с помощью определенной стратегии стробирования.
5. В окне Схема сортировки выберите интересующую вас популяцию ячеек. Выберите пороговое значение ячейки в поле "Target Events" и уровень точности в поле "Precision". Здесь сортируется только одна популяция, однако одновременно могут быть отсортированы четыре разные популяции.
6. Когда все будет готово, нажмите "Sort" и "OK", затем дождитесь сортировки ячеек.
7. После завершения сортировки клеток проведите контроль чистоты, сначала пипетируя 10 мкл отсортированных клеток в новую пробирку FACS с 90 микролитрами HBSS 2% FCS.
8. Затем загрузите в трубку цитометр. Запишите и проанализируйте фенотипы клеток, чтобы убедиться, что стратегия стробирования сработала так, как задумано.

7. Анализ данных

1. Откройте программу 'FlowJo' и перетащите файлы для каждой трубки в окно "Все образцы".
2. Дважды щелкните файл, чтобы открыть его в новом окне.
3. Нажмите на "Polygon" и воссоздайте ранее использованную стратегию стробирования.
4. Повторите эти шаги со всеми остальными файлами.
5. Чтобы визуализировать точечные графики, нажмите на "Layout editor" и перетащите интересующие популяции из трубки 6 и контроля чистоты на вкладке редактора компоновки. Клетки должны появляться только в популяции, представляющей интерес для контроля чистоты (см. Рисунок 2).
6. Чтобы проверить чистоту В-лимфоцитов в отсортированных клетках, нажмите на "Редактор таблиц". Перетащите популяцию B-лимфоцитов из пробирки 6 и контроль чистоты в таблице.
7. В меню "Статистика" выберите частоту клеток CD45⁺, чтобы проверить чистоту этой популяции клеток, затем нажмите на "Создать таблицу".
8. Значения параметров появятся в новой таблице. В окне контроля чистоты проверьте частоту В-лимфоцитов в клетках CD45⁺, которая должна быть выше 98% (см. рисунок 2, нижняя панель).