Проточная цитометрия и сортировка флуоресцентно-активируемых клеток (FACS): выделение В-лимфоцитов селезенки

Иммунная система защищает организм от вторжения патогенных микроорганизмов, вырабатывая лейкоциты, также называемые лейкоцитами. Когда патоген успешно заражает организм, активируется большое разнообразие лейкоцитов, и эта скоординированная реакция называется иммунным ответом.

Часто исследователям полезно иметь возможность идентифицировать конкретный тип и количество иммунных клеток, которые были активированы в ответ на патоген. Проточная цитометрия — это метод, который позволяет исследователям разделять клетки на основе конкретных эпитопов, выраженных на их поверхности. Это достигается с помощью меченых флуорохромами моноклональных антител, которые связываются с известными эпитопами, специфичными для иммунных клеток, и при возбуждении эти связанные флуорохромы излучают длину волны света, которая может быть обнаружена и измерена проточным цитометром.

Проточные цитометры состоят из трех систем. Жидкостная система транспортирует клетки потоком таким образом, что они проходят перед лазером одна за другой. Оптическая система состоит из лазеров и детекторов, которые распознают наличие или отсутствие флуорофоров. Наконец, электронная система преобразует собранные оптические данные в электронные файлы для анализа.

Расширением проточной цитометрии является сортировщик флуоресцентно-активируемых клеток, или FACS, который позволяет обогащать определенные клеточные популяции таким образом, чтобы их можно было изучать независимо. Сортировка клеток осуществляется с помощью вибрационного сопла в потоке жидкости, которое образует микрокапли, каждая из которых содержит одну клетку. Затем детектор определяет, излучается ли флуоресцентный свет из каждой капли, и на основе этой информации электромагнит дает каждой ячейке отрицательный или положительный заряд. Далее сильное электрическое поле сортирует различно заряженные капли по отдельным контейнерам. В конечном счете, один из контейнеров будет содержать однородную популяцию клеток, основанную на экспрессии определенной молекулы клеточной поверхности.

В этом видео вы узнаете, как использовать проточную цитометрию для выделения лейкоцитов из ткани селезенки мыши и FACS для отбора В-лимфоцитов.

Для начала наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду. Затем вымойте ножницы и щипцы сначала с моющим средством, а затем с 70% этанолом, а затем высушите их чистым бумажным полотенцем.

Затем добавьте 49 миллилитров сбалансированного солевого раствора Хэнка, или HBSS, в 50-миллилитровую трубку. Добавьте один миллилитр фетальной сыворотки для телят, или FCS, чтобы получить 2% раствор FCS HBSS, и перемешайте, осторожно дозируя вверх и вниз примерно 10 раз.

Затем поместите усыпленную мышь в лежачем положении на препарирующую пластину. С помощью ножниц и щипцов выполните продольную лапаротомию для доступа к брюшной полости. С помощью щипцов переместите кишечник с правой стороны брюшной полости в одну сторону, чтобы обнажить желудок и селезенку. Селезенка прикрепляется к желудку. Затем с помощью пипетки поместите пять миллилитров HBSS 2% FCS в чашку Петри. С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от желудка и поместите селезенку в чашку Петри.

Чтобы изолировать иммунные клетки, сначала поместите селезенку на сетчатый фильтр для клеток размером 40 микрон в чашке Петри. Раздавите селезенку поршнем, чтобы диссоциировать ее в блюде. Затем пипеткой диссоциировавшую селезенку и жидкость из чашки Петри в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 370 умноженных на g в течение семи минут при 10 градусах Цельсия, а затем осторожно извлекайте пробирку, чтобы не потревожить гранулу.

Теперь удалите надосадочную жидкость, избегая гранул, и выбросьте жидкость в соответствующий контейнер для отходов. Затем добавьте два миллилитра лизирующего буфера ACK в центрифужную пробирку для ресуспендирования и лизирования эритроцитов. Подождите две минуты, а затем добавьте HBSS 2% FCS, чтобы получить общий объем 15 миллилитров. Повторите центрифугирование. Осторожно извлеките трубку и выбросьте надосадочную жидкость. Снова суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах HBSS 2% FCS.

Чтобы подсчитать ресуспензионные клетки, разведите пять микролитров клеточной суспензии с пятью микролитрами Трипана Синего. Затем аккуратно нанесите каплю этой разбавленной клеточной суспензии объемом пять микролитров между покровным стеклом и предметным стеклом Malassez. Теперь под микроскопом при 40-кратном увеличении подсчитайте количество присутствующих клеток. Затем отрегулируйте концентрацию клеток до 10 до седьмых клеток на миллилитр, добавив соответствующий объем HBSS 2% FCS.

Чтобы окрашивать иммунные клетки, начните с маркировки шести пробирок FACS от одной до шести. Затем перенесите по 200 микролитров клеточного раствора в каждую из шести пробирок. Центрифугируйте эти пробирки при 370 умноженных на g в течение семи минут при 10 градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость.

Затем пометьте шесть новых пробирок FACS как от одного до шести и внесите в каждую пипетку 200 микролитров HBSS 2% FCS. Приготовьте шесть новых смесей антител, добавив соответствующее количество антител в каждую пробирку в соответствии с таблицей 1. Смешайте один для неокрашенных клеток без добавления антител. Смеси со второго по пятый содержат разные антитела для настроек компенсации. Смесь шесть содержит все четыре антитела для мультиокрашенных клеток, которые будут использоваться для сортировки.

Затем перенесите эти смеси антител в соответствующие пронумерованные пробирки FACS. Инкубируйте эти растворы в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия или на льду в темноте. Далее добавьте по одному миллилитру HBSS 2% FCS в каждую пробирку, а затем снова центрифугируйте. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах HBSS 2% FCS. Наконец, перенесите ресуспендированные гранулы в новые пробирки с маркировкой FACS.

Чтобы выполнить FACS, сначала включите сортировщик. Затем выберите меню цитометра и нажмите «Запуск жидкости». Следуйте инструкциям на экране.

На вкладке трансляции нажмите на красный крестик, чтобы включить трансляцию, а затем подождите 15 минут, пока трансляция стабилизируется. Регулируйте амплитуду потока до тех пор, пока на вкладке потока не появится четкая отдельно стоящая капля. Затем нажмите на область наилучшего восприятия, чтобы завершить регулировку амплитуды. Вставьте фильтр нейтральной плотности, или ND, 1.0 перед лазером.

Откройте меню цитометра в верхней части экрана и выберите CST, что расшифровывается как Cytometer Setup and Tracking. Для выполнения ежедневного контроля качества сначала разбавьте гранулы CST средой FACS в пробирке FACS, следуя инструкциям производителя. Затем загрузите пробирку в аппарат и выполните контроль CST, нажав кнопку «Выполнить» на вкладке CST.

Когда контроль CST будет завершен, замените фильтр ND 1.0 на фильтр ND 2.0 на цитометре. Затем разбавьте шарики задержки капель в среде FACS, следуя инструкциям производителя, а затем загрузите трубку в FACS. Чтобы обеспечить правильную сортировку, выполните задержку падения, сначала щелкнув напряжением, а затем оптическим фильтром. Правый квадрант оптического фильтра должен быть равен 100%, что указывает на то, что 100% капель регистрируются машиной. При необходимости отрегулируйте красный лазерный винт на цитометре влево или вправо, чтобы получить 100% в правом квадранте. Важно следить за тем, чтобы струя попадала в сборную трубку. Для этого выполните тестовую сортировку, нажав на ящик для отходов, а затем проверьте сортировку. Проверьте, чтобы боковые струи попадали в сборные трубки. Если это не так, отрегулируйте напряжение на вкладке сортировки до тех пор, пока они не сработают.

Перейдите к экспериментальному шаблону, выбрав вкладку браузера и щелкнув общий вид. Затем откройте эксперимент Accudrop_DROP DELAY и нажмите кнопку сортировки. Теперь измените пороговую скорость на панели сбора данных, манипулируя скоростью потока, пока она не достигнет 3 000 событий в секунду. Щелкните напряжение, а затем щелкните оптический фильтр. Левый квадрант должен быть равен нулю, а правый квадрант равен 100.

Наконец, в окне макета сортировки нажмите кнопку Сортировка, а затем нажмите кнопку Отмена. Левый квадрант должен быть равен 100, а правый квадрант равен нулю. Если левый квадрант меньше 95, нажмите «Автозадержка», чтобы дать команду программному обеспечению автоматически увеличить напряжение для получения 100% падения напряжения в левом квадранте.

Чтобы начать проточную цитометрию, мы сначала будем использовать неокрашенные клетки для определения морфологии клеток и отрицательных пиков флуорохромов. Для этого поместите в машину первую трубку, содержащую неокрашенные элементы, и на вкладке панели сбора данных нажмите кнопку «Загрузить». На вкладке цитометра отрегулируйте напряжение прямого и бокового рассеяния, пока не увидите на экране популяцию клеток в виде плотной концентрации точек. Лимфоциты являются мелкими клетками, поэтому они будут иметь низкий прямой разброс и низкий боковой разброс.

Затем удалите фоновую флуоресценцию, регулируя напряжение для флуорохромов на вкладке цитометра до тех пор, пока популяции клеток на отрицательном уровне не достигнут уровня в первой декаде на вкладке глобального рабочего листа. В меню цитометра нажмите на кнопку «Просмотреть конфигурацию» и убедитесь, что все флуорохромы присутствуют. Далее поместите вторую пробирку в цитометр и нажмите кнопку загрузки. Отрегулируйте спектральное перекрытие на вкладке цитометра до тех пор, пока отрицательная и положительная медианы популяции не будут выровнены на вкладке глобального листа. На вкладке Приобретение задайте для параметра События для записи значение 10 000 и нажмите кнопку Запись. Повторите эти действия с трубками три, четыре и пять.

Затем загрузите шестую трубку, в которой находятся многослойные элементы. Чтобы выделить В-лимфоциты, сначала настройте параметры сортировки клеток на основе их морфологии. В первом окне построите область прямого рассеяния FSC-A по оси y и область бокового рассеяния SSC-A по оси X. На точечной диаграмме каждая точка представляет собой ячейку. Нажмите на полигональный вентиль на глобальном листе и выберите популяцию с низким прямым разбросом и промежуточным боковым разбросом. В новом окне точечной диаграммы щелкните правой кнопкой мыши по окну, выберите в меню пункт «Показать популяции» и нажмите P1.

Затем, в новом окне, затворите жизнеспособные CD45-положительные клетки, построив график жизнеспособности по оси y и CD45 по оси x. Используйте полигональный вентиль для обведения ячеек с низкой жизнеспособностью и высоким сигналом CD45 и выберите P2, чтобы отобразить выбранные ячейки в новом окне. В следующем окне ворота для CD45-положительных лейкоцитов, исключая Т-лимфоциты. Когда CD45 находится на оси x, а CD3 — на оси y, обведите население с высоким сигналом CD45 и низким отрицательным сигналом CD3 и выберите P3. Наконец, ворота для CD19-положительных клеток, которые идентифицируют В-лимфоциты. Когда CD19 находится на оси y, а CD3 — на оси x, обведите население с высоким сигналом CD19 и низким отрицательным сигналом CD3 и выберите P4.

Теперь все параметры сортировки заданы. Затем в окне сортировки выберите интересующую вас популяцию клеток - P4, которая является четвертой популяцией, которая была заблокирована, и указывает машине сортировать только B-лимфоциты. Установите целевое количество событий на 10 000 ячеек и установите точность до чистоты. Мы сортируем только одну популяцию. Тем не менее, одновременно можно отсортировать до четырех различных популяций. Когда все будет готово, нажмите «Сортировать» и «ОК». Затем дождитесь сортировки ячеек.

После завершения сортировки клеток проведите контроль чистоты, пипетируя 10 микролитров отсортированных клеток в новую пробирку FACS с 90 микролитрами HBSS 2% FCS. Поместите пробирку в цитометр, нажмите кнопку «Загрузить», а затем нажмите кнопку «Записать», чтобы проанализировать фенотипы клеток и убедиться, что стратегия стробирования работает так, как задумано.

Теперь мы проанализируем отсортированные клетки, чтобы определить процент В-лимфоцитов среди лейкоцитов, которые были выделены из селезенки мыши. Для начала дважды щелкните по значку FlowJo и перетащите файлы для каждой трубки в окно всех образцов.

Нажмите на полигон и воссоздайте стратегии стробирования, которые использовались в предыдущем разделе. Затем нажмите на редактор макетов и перетащите интересующие популяции В-лимфоцитов из шестой пробирки и регулятора чистоты на вкладку редактора макетов. Появятся точечные графики, представляющие В-лимфоциты. В этом примере график в правом верхнем углу представляет отсортированные В-лимфоциты из общей суспензии клеток селезенки, а график в правом нижнем углу представляет контроль чистоты. Клетки должны появляться только в популяции, представляющей интерес для контроля чистоты.

Чтобы проверить чистоту В-лимфоцитов в отсортированных клетках, нажмите на редактор таблиц. Перетащите популяцию В-лимфоцитов из шестой пробирки и контроль чистоты в таблице. В меню статистики выберите частоту CD45-положительных клеток, чтобы проверить чистоту этой популяции клеток. Затем нажмите на кнопку «Создать таблицу». Значения параметров появятся в новой таблице. В окне контроля чистоты проверьте частоту В-лимфоцитов в CD45-положительных клетках, которая должна быть выше 98%.