Магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS): выделение Т-лимфоцитов тимуса

Магнитно-активируемая сортировка клеток, или MACS, — это метод, который позволяет исследователям разделять клетки на основе конкретных эпитопов, выраженных на их поверхности.

Процесс обычно начинается с извлечения органа или ткани, например, тимуса. Затем клетки механически разделяются, обычно путем дробления, до тех пор, пока ткань не будет диссоциирована на отдельные клетки. Нежелательные клетки могут быть удалены на этом этапе с помощью добавления химических веществ. Например, хлорид аммония-калий, или буфер ACK, может быть использован для лизирования нежелательных эритроцитов.

Далее в суспензию добавляют антитело, конъюгированное с молекулой под названием биотин, и эти комплексы связываются с эпитопами поверхности клеток-мишеней. Биотин обладает высоким сродством к другой молекуле под названием стрептавидин. На следующем этапе молекулы стрептавидина, слитые с магнитными шариками, добавляются к клеткам, меченным антителами. Когда биотин и стрептавидин вступают в контакт, они плотно связываются. В результате интересующие клетки покрываются магнитными шариками. Этот комплекс иногда называют бутербродом. В этом случае CD3 находится на клеточной мембране на дне, затем анти-CD3 конъюгируется с биотином и, наконец, стрептавидин конъюгируется с магнитными шариками.

Эти помеченные ячейки теперь могут быть помещены в колонку, содержащую матрицу, которая, с помощью гравитации, позволяет клеткам медленно проходить с помощью магнита. При этом меченые магнитными шариками клетки будут прилипать к краю трубки, ближайшей к магниту, в то время как немеченые ячейки будут продолжать движение в собирательную трубку ниже. Затем меченые элементы можно удалить из колонки, просто удалив магнит, добавив раствор элюента и слегка надавливая поршнем, чтобы вымыть их из колонки в новую сборную трубку. В конечном счете, этот процесс позволяет извлечь от 60 до 98% интересующих клеток.

В этой процедуре мы выделим лейкоциты тимуса у мыши и с помощью MACS отсортируем CD3-положительные Т-клетки, прежде чем подтвердим эффективность сортировки с помощью FACS.

Для начала наденьте любое подходящее защитное снаряжение, включая лабораторный халат и перчатки. Затем вымойте ножницы и щипцы для препарирования с 70% этанолом и высушите их чистым бумажным полотенцем. Затем приготовьте 200 миллилитров 2% фетальной телячьей сыворотки HBSS, или FCS, смешав четыре миллилитра FCS со 196 миллилитрами HBSS.

Прикрепите усыпленную мышь в лежачем положении на спине к препарирующей пластине. С помощью ножниц и щипцов выполнить продольную лапаротомию для доступа к грудной полости. Во-первых, удалите сердце, чтобы получить доступ к тимусу, который расположен над сердцем. Затем определите тимус, который состоит из двух белых долей. С помощью щипцов осторожно отсоедините тимус и поместите его на чашку Петри с пятью миллилитрами HBSS 2% FCS.

Чтобы изолировать иммунные клетки, сначала поместите тимус на клеточное сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров в чашке Петри. Раздавите ткань поршнем, чтобы диссоциировать ее в посуде. После этого промойте поршень и сетчатое фильтр HBSS 2% FCS, чтобы восстановить все прилипшие клетки. Затем пипеткой диссоциированные клетки тимуса и жидкость из чашки Петри в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Вымойте чашку Петри пятью миллилитрами HBSS 2% FCS и перелейте этот раствор в 15-миллилитровую центрифугу.

Затем центрифугируйте пробирку при 370 умноженных на g в течение семи минут при температуре 20 градусов Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах лизирующего буфера ACK для лизиса эритроцитов. Выдерживайте в течение двух минут при комнатной температуре на столе. Затем доведите объем до 14 миллилитров с HBSS 2% FCS. Центрифугируйте пробирку при 370 умноженных на g в течение семи минут при температуре 20 градусов Цельсия. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах HBSS 2% FCS.

Оцените концентрацию клеток с помощью предметного стекла Малассеза, как показано в протоколе выделения В-лимфоцитов методом FACS, и отрегулируйте концентрацию клеток до 10 до седьмых клеток на миллилитр с помощью HBSS 2% FCS.

Перелейте 500 микролитров клеточного раствора в две пробирки FACS. Пометьте одну пробирку необогащенными Т-клетками, а другую пробирку — обогащенными Т-клетками, которые будут разделены с помощью магнитной маркировки.

Центрифугируйте обогащенную Т-клеточную пробирку при 370 умноженных на g в течение трех минут при 20 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах биотинового связанного анти-CD3-антитела, разведенного один к 400 в HBSS 2% FCS. Инкубируйте клетки в течение 20 минут на льду и в темноте. Добавьте три миллилитра HBSS 2% FCS в пробирки и снова центрифугируйте их при 370 умноженных на g в течение трех минут при 20 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах стрептавидиновых сопряженных гранул, разведенных один к пяти в HBSS 2% FCS. Инкубируйте смесь клеток и бусин в течение 20 минут на льду. Затем добавьте три миллилитра HBSS 2% FCS в пробирку, пипеткой вверх и вниз для смешивания и снова центрифугируйте при 370 умноженных на г в течение трех минут при 20 градусах Цельсия. Ресуспендируйте гранулу в двух миллилитрах HBSS 2% FCS.

Поместите колонку на магнит и добавьте три миллилитра HBSS 2% FCS для увлажнения системы. Затем пипеткой введите окрашенные клетки в колонку. После того, как клеточная суспензия пройдет через колонку, трижды промойте колонку тремя миллилитрами HBSS 2% FCS. Далее снимите колонку с магнита и поместите ее в тубу объемом 15 миллилитров. Чтобы элюировать целевые клетки, добавьте в колонку пять миллилитров HBSS 2% FCS и промойте колонку с помощью поршня. Повторите этот шаг с еще пятью миллилитрами HBSS 2% FCS.

Чтобы оценить эффективность выделения клеток-мишеней, сначала перенесите 500 микролитров суспензии элюированных клеток в пробирку FACS и пометьте ее обогащенными Т-клетками. Затем центрифугируйте обогащенные и необогащенные пробирки при 370 умноженных на g в течение семи минут при температуре 20 градусов Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте 100 микролитров флуоресцентного антитела, разведенного один к 200 в HBSS 2% FCS в обе пробирки. Инкубируйте клетки в течение 20 минут на льду и в темноте. Затем добавьте в пробирки три миллилитра HBSS 2% FCS и центрифугируйте их при 370 умноженных на g в течение трех минут при температуре 20 градусов Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте гранулы в 250 микролитрах HBSS 2% FCS. Теперь оцените скорость обогащения CD3-положительных клеток с помощью проточной цитометрии, как показано в протоколе FACS.

Теперь мы определим частоту CD3-положительных лимфоцитов среди всех тимоцитов, которые были выделены из тимуса мыши. Для начала дважды щелкните значок FlowJo и перетащите файлы для каждой трубки в окне всех образцов. Затем дважды щелкните по обогащенному файлу Т-клеток, чтобы отобразить клетки, записанные из этого образца, на точечной диаграмме, которая отображает прямое рассеяние, FSCA, по оси x, и боковое рассеяние, SSCA, по оси y.

Нажмите на многоугольник, чтобы обвести популяции лимфоцитов. Затем дважды щелкните по обведенному населением, чтобы создать новое окно. Выберите FSC-W по оси Y и FSC-A по оси X и обведите вокруг отрицательных ячеек FSA-W. В окне идентификации субпопуляции назовите популяцию клеток Single Cells. Затем нажмите OK в окне идентификации субпопуляции, затем дважды щелкните по обведенной популяции, чтобы создать новое окно. Выберите CD3 на оси Y и обведите кружком CD3-положительные клетки. В окне идентификации субпопуляции назовите Т-клетки популяции клеток. Повторите то же самое с файлом с необогащенными Т-клетками. Чтобы визуализировать популяцию клеток, нажмите «Редактор макетов» и перетащите популяцию Т-клеток из обогащенных и необогащенных файлов Т-клеток на вкладку.

Появятся точечные графики, представляющие CD3-положительные лимфоциты. CD3-положительные клетки должны появляться в интересующей популяции только в CD3-положительной обогащенной пробирке. Чтобы оценить обогащение CD3-положительных лимфоцитов в отсортированных клетках, нажмите на «Редактор таблиц», а затем перетащите популяцию Т-клеток из обогащенных и необогащенных файлов Т-клеток в таблицу. В меню статистики выберите «Частота лимфоцитарных клеток», чтобы проверить процент CD3-положительных клеток во всех лимфоцитах. Затем нажмите «Создать таблицу». Значения параметров появятся в новой таблице. Для обогащенных Т-клеток частота CD3-положительных клеток должна составлять около 80% или выше.