Магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS): выделение Т-лимфоцитов тимуса

1. Подготовка

1. Перед началом работы наденьте лабораторные перчатки и соответствующую защитную одежду.
2. Вымойте все инструменты для вскрытия, сначала моющим средством, а затем 70% этанолом, а затем высушите их чистым бумажным полотенцем.
3. Приготовьте 200 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 2% фетальную сыворотку теленка (FCS).

2. Вскрытие

1. Прикрепите усыпленную мышь к препарирующей пластине в лежачем положении.
2. С помощью ножниц и щипцов выполняют продольную лапаротомию для доступа к грудной полости.
3. Удалите сердце, чтобы получить доступ к тимусу, который расположен над сердцем. Затем определите тимус, который состоит из двух белых долей и расположен в грудной полости над сердцем.
4. С помощью щипцов осторожно отсоедините тимус и поместите его на чашку Петри с 5 мл HBSS 2% FCS.

3. Выделение иммунных клеток

1. Поместите тимус на клеточное ситечко 40 мкм над той же чашкой Петри. Раздавите тимус поршнем, чтобы диссоциировать его в той же посуде.
2. Перенесите диссоциированный тимус и жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
3. Вымойте чашку Петри 5 мл HBSS 2% FCS и переложите промытую среду также в ту же центрифужную пробирку.
4. Центрифугируйте пробирку при давлении 370 x g в течение 7 минут при 20°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
5. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл ацетата калия для лизиса эритроцитов. Подождите 2 минуты, а затем доведите объем до 14 мл с помощью HBSS 2% FCS.
6. Снова центрифугируйте пробирку при 370 x g в течение 7 мин при 20°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS 2% FCS.
7. Оцените концентрацию клеток с помощью анализа окрашивания трипановым синим и отрегулируйте концентрацию клеток до 10⁷ клеток/мл с использованием соответствующего объема HBSS 2% FCS.

4. Магнитная маркировка иммунных клеток

1. Возьмите две трубки FACS. Пометьте одну пробирку как «необогащенные Т-клетки», а другую пробирку — «обогащенные Т-клетки», которые будут разделены с помощью магнитной маркировки.
2. Распределите раствор клетки в каждую из двух пробирок FACS.
3. Центрифугируйте пробирку с «обогащенными Т-клетками» при давлении 370 x g в течение 3 минут при 20°C и выбросьте надосадочную жидкость, избегая гранул.
4. Ресуспендировать гранулу в 250 мкл смеси анти-CD3 биотинилированных антител (табл. 1, смесь 1).

Микс	Маркировка реагентов	Разбавление
1	Анти-CD3 биотинилированное антитело	1/400 (в HBSS 2% FCS)
2	Стрептавидиновые бусины	1/5 (в HBSS 2% FCS)
3	Анти-CD3 BV421	1/200 (в HBSS 2% FCS)

Таблица 1: Состав смеси антител. Смеси 1 и 2 используются для магнитной сепарации. Смесь 3 используется для оценки обогащения клеток после магнитной сепарации.

5. Инкубируйте смесь клеточной суспензии и антител в течение 15 минут при температуре 4°C в темноте.
6. Добавьте 3 мл HBSS 2% FCS в обе пробирки и снова центрифугируйте их при 370 x g в течение 3 минут при 20°C.
7. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 250 мкл стрептавидиновых шариков (табл. 1, смесь 2).
8. Инкубируйте клеточную смесь и бусины в течение 20 минут на льду.
9. Затем добавьте 3 мл HBSS 2% FCS и хорошо перемешайте и снова центрифугируйте при 370 x g в течение 3 минут при 20°C.
10. Суспендировать гранулу в 2 мл HBSS 2% FCS.

5. Магнитное разделение CD3-положительных клеток

1. Поместите колонку на магнит и добавьте 3 мл HBSS 2% FCS для увлажнения системы. Подождите 5 минут.
2. Затем пипетируйте помеченные ячейки в столбец.
3. После того, как клеточная суспензия пройдет через колонку, промойте колонку Х3 раза 3 мл HBSS 2% FCS.
4. Затем снимите колонку с магнита и поместите ее в пробирку для сбора объемом 15 мл.
5. Чтобы элюировать целевые ячейки, добавьте 5 мл HBSS 2% FCS в колонку и промойте колонку с помощью поршня.
6. Повторите этап элюирования с еще 5 мл HBSS 2% FCS.

6. Оценка обогащения клеток-мишеней с помощью проточной цитометрии

1. Перенесите 500 мкл суспензии элюированных клеток в пробирку FACS с маркировкой «обогащенные Т-клетки». Перенесите 200 мкл суспензии «необогащенных Т-клеток» во вторую FACS.
2. Затем центрифугируйте обе пробирки при 370 x g в течение 7 минут при 20°C.
3. Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте 100 мкл флуоресцентного антитела Mix 3 (см. Таблицу 1) в обе пробирки.
4. Инкубируйте обе пробирки в течение 20 минут при температуре 4°C в темноте.
5. Затем добавьте 3 мл HBSS 2% FCS в пробирки и центрифугируйте их при 370 x g в течение 3 минут при 20°C.
6. Выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте каждую пробирку в 250 мкл HBSS 2% FCS.
7. Теперь оценим скорость обогащения CD3-положительных клеток с помощью проточной цитометрии.

7. Анализ данных

1. Откройте значок 'FlowJo' и перетащите файлы для каждой трубки в окно "All Sample".
2. Дважды щелкните по файлу "обогащенные Т-клетки", чтобы отобразить точечную диаграмму, отображающую прямое рассеяние (FSC-A) по оси X и боковое рассеяние (SSC-A) по оси Y.
3. Нажмите на "Polygon", чтобы обвести популяции лимфоцитов.
4. Затем дважды щелкните по обведенному населением, чтобы создать новое окно.
5. Выберите "FSC-W" по оси Y и "FSC-A" по оси X и обведите отрицательные ячейки FSA-W. В окне "Идентификация субпопуляции" назовите популяцию клеток "одиночные клетки".
6. Дважды щелкните по обведенному кружком населению, чтобы создать новое окно. Выберите "CD3" на оси Y и обведите CD3-положительными клетками. В окне "Идентификация субпопуляции" назовите вашу популяцию клеток "Т-клетки".
7. Повторите то же самое с «необогащенными Т-клетками».
8. Чтобы визуализировать популяцию клеток, нажмите на "Layout editor" и перетащите популяцию "T cells" из файлов "обогащенные Т-клетки" и "необогащенные Т-клетки" на вкладку.
9. Появятся точечные графики, представляющие CD3+ лимфоциты. CD3+ клетки должны появляться в интересующей популяции только в пробирке, обогащенной CD3+.
10. Чтобы оценить обогащение CD3+ лимфоцитов в отсортированных клетках, нажмите на "Редактор таблиц", а затем перетащите популяцию "Т-клеток" из файлов "обогащенные Т-клетки" и "необогащенные Т-клетки" в таблицу.
11. В меню "Статистика" выберите "Частота лимфоцитов" клеток, чтобы проверить процент CD3+ клеток во всех лимфоцитах, затем нажмите на "Создать таблицу".
12. Значения параметров появятся в новой таблице. Для «обогащенных Т-клеток» частота CD3+ клеток должна составлять около 80%.