Анализы ИФА: косвенные, сэндвич и конкурентные
1. Косвенный ИФА
Непрямой ИФА – это метод, при котором первичное антиген-специфическое антитело распознается вторичным конъюгированным антителом. Приведенный ниже протокол является примером метода непрямого иммуноферментного анализа, в рамках которого образцы сыворотки мышей, инфицированных вирусом гриппа А (IAV), проверяются на наличие специфических антител IgG, специфичных для IAV. Одним из преимуществ этого примера является то, что можно использовать различные вторичные антитела, которые распознают все изотипы антител или конкретные изотипы (например, IgG).
Покрытие антигена микропланшетом
- Покройте лунки 96-луночного планшета для ИФА очищенным антигеном путем пипетирования 50 мкл очищенного антигена (2 мг/мл очищенного вируса A/PR/8 гриппа А в 0,05М трис-HCl буфере (pH 9,5)) в каждую лунку планшета.
- Накройте планшет клейкой крышкой и инкубируйте его в течение ночи при температуре 4°C, чтобы антиген смог закрепиться на планшете.
- По завершении инкубации удалите раствор для покрытия, перебросив пластину над раковиной.
Блокировка
- Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие сайты в лунках с покрытием, добавив 200 мкл блокирующего буфера, здесь используется 5% ослиная сыворотка в 1X PBS, на лунку. Альтернативные блокирующие реагенты включают 5% обезжиренного сухого молока или BSA в PBS или нормальную сыворотку от животного, у которого было получено вторичное антитело.
- Выдерживать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
- После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20.
Инкубация с первичным антителом
- Приготовьте серийное разведение образца сыворотки, содержащего первичное антитело, для получения диапазона разведения от 1 до 204 800 с использованием 1X PBS. Для этого сначала разбавляют сыворотку 1:12,5, а затем проводят 4-кратное разведение (диапазон разведения - от 1:12,5 до 1:204,800).
- Добавьте в лунки 100 мкл серийно разведенных образцов сыворотки.
- Накройте пластину с клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1-2 часов.
- После инкубации перекиньте тарелку над раковиной и вымойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20.
Инкубация с вторичным антителом
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл конъюгированного ферментом вторичного антитела, пероксидазы хрена, HRP-конъюгированного осла против мышей вторичного в этом эксперименте.
- Выдержите тарелку в течение 1 часа при комнатной температуре.
- После инкубации перекиньте тарелку над раковиной, а затем промойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20.
Обнаружение
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл индикаторного субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ)) в концентрации 1 мг/мл.
- Инкубируйте тарелку с субстратом в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
- Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл 2N серной кислоты (H2SO4).
В течение 30 минут после добавления стоп-раствора считайте показания планшета с помощью микропланшетного ридера с длиной волны 405 нм, чтобы определить абсорбцию лунок.
2. Бутерброд ELISA
В этой версии ИФА экспериментальный образец «зажат» между неконъюгированным антителом захвата и конъюгированным антителом обнаружения, оба из которых специфичны к одному и тому же белку, но имеют разные эпитопы. В следующем примере с помощью сэндвич-ИФА концентрацию человеческого TNFα определяли в неизвестном образце с использованием стандартной кривой, полученной в результате 2,5-кратного серийного разведения известного стандартного рекомбинантного человеческого TNFα (при концентрации 75 пг/мл).
Покрытие для захвата антител к микропланшету
- Покройте лунки 96-луночного планшета ИФА очищенным антителом захвата, добавив 100 мкл антитела захвата (диапазон 1-10 г/мл) в каждую лунку планшета.
- Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4°C.
- После инкубации удалите раствор для покрытия с пластины, перебросив пластину над раковиной.
Блокировка
- Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках, покрытых антителами, добавив в лунки 200 мкл блокирующего раствора, 5% обезжиренного сухого молока, содержащего PBS.
- Инкубировать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
- После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20.
Добавить антигенсодержащие тестовые образцы
- Добавьте в лунки 100 мкл исследуемого образца. Запечатайте пластину клеевым чехлом.
- Выдерживать в течение 1-2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
- После инкубации извлеките образцы, перекинув планшет над раковиной, а затем промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.
Добавить конъюгированное с ферментом антитело обнаружения
- Добавьте в лунки 100 мкл конъюгированного с ферментом детектирующего антитела в предварительно оптимизированной концентрации.
- Закройте планшет клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Удалите несвязанное антитело обнаружения, перекинув планшет над раковиной, и промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.
Обнаружение
- Добавьте 100 мкл индикаторного субстрата в концентрации 1 мг/мл. Любое связанное антитело, конъюгированное с ферментом, преобразует субстрат в детектируемый сигнал.
- Выдержать тарелку в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
- Через 5-10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N H2SO4. В течение 30 минут после добавления стоп-раствора прочитайте показания планшета с помощью считывателя микропланшетов, чтобы определить абсорбцию лунок.
3. Соревновательный ИФА
Этапы конкурентного ИФА отличаются от тех, которые используются при непрямом и сэндвич-ИФА, при этом основное различие заключается в стадии конкурентного связывания между образцом антигена и «дополнительным» антигеном. Образец антигена инкубируют с немеченым первичным антителом. Эти комплексы антитела-антиген затем добавляются к планшету ИФА, который был предварительно покрыт тем же антигеном. После инкубационного периода все несвязанные антитела смываются. Существует обратная корреляция между количеством свободного антитела, доступного для связывания антигена в лунке, и количеством антигена в исходном образце. Например, образец с большим количеством антигена будет иметь больше комплексов антиген-первичные антитела, оставляя мало несвязанного антитела для связывания с планшетом ИФА. Затем в лунки добавляют конъюгированное ферментом вторичное антитело, специфичное к первичному антителу, а затем субстрат.
Покрытие антигена микропланшетом
- Покройте лунки 96-луночного планшета методом ИФА 100 мкл очищенного антигена в концентрации 1-10 мкг/мл.
- Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте пластину в течение ночи при 4°C.
- После инкубации удалите несвязанный раствор антигена из лунок, перекинув пластину над раковиной.
Блокировка
- Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках с покрытием, добавив в каждую лунку 200 мкл блокирующего буфера, который может быть либо 5% обезжиренного сухого молока, либо BSA в PBS.
- Инкубировать планшет не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
Инкубационный образец (антиген) с первичным антителом
- При блокировании лунок готовят смесь антиген-антитело, смешивая 150 мкл образца антигена и 150 мкл первичного антитела для каждой лунки в анализе.
- Выдерживайте эту смесь в течение 1 ч при 37°C.
Добавьте в лунку смесь антиген-антитело
- Теперь снимите блокирующий буфер с лунок, перебросив пластину над раковиной.
- Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим Tween-20.
- Добавьте 100 мкл образца смеси антигена и первичного антитела.
- Инкубируйте планшет при температуре 37°C в течение 1 ч.
- Извлеките образец смеси, перебросив тарелку над раковиной.
- Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, чтобы удалить все несвязанные антитела.
Добавьте вторичное антитело
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгированного вторичного антитела, которое в данном случае представляет собой AP-конъюгированное антитело.
- Инкубировать планшет в течение 1 ч при 37°C.
- После инкубации промойте планшет 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.
Обнаружение
- Добавьте по 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку.
- Подождите 5-10 минут.
- Через 10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N серной кислоты. Затем измерьте поглощение в считывателе микропланшетов в течение 30 минут после добавления стоп-раствора
Источник: Уитни Суонсон1,2, Фрэнсис В. Шостад2,3 и Томас С. Гриффит1,2,3,4
1 Факультет урологии, Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота 55455
2…
1. Косвенный ИФА
Непрямой ИФА – это метод, при котором первичное антиген-специфическое антитело распознается вторичным конъюгированным антителом. Приведенный ниже протокол является примером метода непрямого иммуноферментного анализа, в рамках которого образцы сыворотки мышей, инфицированных вирусом гриппа А (IAV), проверяются на наличие специфических антител IgG, специфичных для IAV. Одним из преимуществ этого примера является то, что можно использовать различные вторичные антитела, которые распознают все изотипы антител или конкретные изотипы (например, IgG).
Покрытие антигена микропланшетом
- Покройте лунки 96-луночного планшета для ИФА очищенным антигеном путем пипетирования 50 мкл очищенного антигена (2 мг/мл очищенного вируса A/PR/8 гриппа А в 0,05М трис-HCl буфере (pH 9,5)) в каждую лунку планшета.
- Накройте планшет клейкой крышкой и инкубируйте его в течение ночи при температуре 4°C, чтобы антиген смог закрепиться на планшете.
- По завершении инкубации удалите раствор для покрытия, перебросив пластину над раковиной.
Блокировка
- Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие сайты в лунках с покрытием, добавив 200 мкл блокирующего буфера, здесь используется 5% ослиная сыворотка в 1X PBS, на лунку. Альтернативные блокирующие реагенты включают 5% обезжиренного сухого молока или BSA в PBS или нормальную сыворотку от животного, у которого было получено вторичное антитело.
- Выдерживать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
- После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20.
Инкубация с первичным антителом
- Приготовьте серийное разведение образца сыворотки, содержащего первичное антитело, для получения диапазона разведения от 1 до 204 800 с использованием 1X PBS. Для этого сначала разбавляют сыворотку 1:12,5, а затем проводят 4-кратное разведение (диапазон разведения - от 1:12,5 до 1:204,800).
- Добавьте в лунки 100 мкл серийно разведенных образцов сыворотки.
- Накройте пластину с клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1-2 часов.
- После инкубации перекиньте тарелку над раковиной и вымойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20.
Инкубация с вторичным антителом
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл конъюгированного ферментом вторичного антитела, пероксидазы хрена, HRP-конъюгированного осла против мышей вторичного в этом эксперименте.
- Выдержите тарелку в течение 1 часа при комнатной температуре.
- После инкубации перекиньте тарелку над раковиной, а затем промойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20.
Обнаружение
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл индикаторного субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ)) в концентрации 1 мг/мл.
- Инкубируйте тарелку с субстратом в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
- Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл 2N серной кислоты (H2SO4).
В течение 30 минут после добавления стоп-раствора считайте показания планшета с помощью микропланшетного ридера с длиной волны 405 нм, чтобы определить абсорбцию лунок.
2. Бутерброд ELISA
В этой версии ИФА экспериментальный образец «зажат» между неконъюгированным антителом захвата и конъюгированным антителом обнаружения, оба из которых специфичны к одному и тому же белку, но имеют разные эпитопы. В следующем примере с помощью сэндвич-ИФА концентрацию человеческого TNFα определяли в неизвестном образце с использованием стандартной кривой, полученной в результате 2,5-кратного серийного разведения известного стандартного рекомбинантного человеческого TNFα (при концентрации 75 пг/мл).
Покрытие для захвата антител к микропланшету
- Покройте лунки 96-луночного планшета ИФА очищенным антителом захвата, добавив 100 мкл антитела захвата (диапазон 1-10 г/мл) в каждую лунку планшета.
- Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4°C.
- После инкубации удалите раствор для покрытия с пластины, перебросив пластину над раковиной.
Блокировка
- Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках, покрытых антителами, добавив в лунки 200 мкл блокирующего раствора, 5% обезжиренного сухого молока, содержащего PBS.
- Инкубировать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
- После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20.
Добавить антигенсодержащие тестовые образцы
- Добавьте в лунки 100 мкл исследуемого образца. Запечатайте пластину клеевым чехлом.
- Выдерживать в течение 1-2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
- После инкубации извлеките образцы, перекинув планшет над раковиной, а затем промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.
Добавить конъюгированное с ферментом антитело обнаружения
- Добавьте в лунки 100 мкл конъюгированного с ферментом детектирующего антитела в предварительно оптимизированной концентрации.
- Закройте планшет клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Удалите несвязанное антитело обнаружения, перекинув планшет над раковиной, и промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.
Обнаружение
- Добавьте 100 мкл индикаторного субстрата в концентрации 1 мг/мл. Любое связанное антитело, конъюгированное с ферментом, преобразует субстрат в детектируемый сигнал.
- Выдержать тарелку в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
- Через 5-10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N H2SO4. В течение 30 минут после добавления стоп-раствора прочитайте показания планшета с помощью считывателя микропланшетов, чтобы определить абсорбцию лунок.
3. Соревновательный ИФА
Этапы конкурентного ИФА отличаются от тех, которые используются при непрямом и сэндвич-ИФА, при этом основное различие заключается в стадии конкурентного связывания между образцом антигена и «дополнительным» антигеном. Образец антигена инкубируют с немеченым первичным антителом. Эти комплексы антитела-антиген затем добавляются к планшету ИФА, который был предварительно покрыт тем же антигеном. После инкубационного периода все несвязанные антитела смываются. Существует обратная корреляция между количеством свободного антитела, доступного для связывания антигена в лунке, и количеством антигена в исходном образце. Например, образец с большим количеством антигена будет иметь больше комплексов антиген-первичные антитела, оставляя мало несвязанного антитела для связывания с планшетом ИФА. Затем в лунки добавляют конъюгированное ферментом вторичное антитело, специфичное к первичному антителу, а затем субстрат.
Покрытие антигена микропланшетом
- Покройте лунки 96-луночного планшета методом ИФА 100 мкл очищенного антигена в концентрации 1-10 мкг/мл.
- Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте пластину в течение ночи при 4°C.
- После инкубации удалите несвязанный раствор антигена из лунок, перекинув пластину над раковиной.
Блокировка
- Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках с покрытием, добавив в каждую лунку 200 мкл блокирующего буфера, который может быть либо 5% обезжиренного сухого молока, либо BSA в PBS.
- Инкубировать планшет не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
Инкубационный образец (антиген) с первичным антителом
- При блокировании лунок готовят смесь антиген-антитело, смешивая 150 мкл образца антигена и 150 мкл первичного антитела для каждой лунки в анализе.
- Выдерживайте эту смесь в течение 1 ч при 37°C.
Добавьте в лунку смесь антиген-антитело
- Теперь снимите блокирующий буфер с лунок, перебросив пластину над раковиной.
- Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим Tween-20.
- Добавьте 100 мкл образца смеси антигена и первичного антитела.
- Инкубируйте планшет при температуре 37°C в течение 1 ч.
- Извлеките образец смеси, перебросив тарелку над раковиной.
- Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, чтобы удалить все несвязанные антитела.
Добавьте вторичное антитело
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгированного вторичного антитела, которое в данном случае представляет собой AP-конъюгированное антитело.
- Инкубировать планшет в течение 1 ч при 37°C.
- После инкубации промойте планшет 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.
Обнаружение
- Добавьте по 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку.
- Подождите 5-10 минут.
- Через 10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N серной кислоты. Затем измерьте поглощение в считывателе микропланшетов в течение 30 минут после добавления стоп-раствора
Иммуноферментный анализ, или ИФА, является высокочувствительным количественным анализом, обычно используемым для измерения концентрации аналита, такого как цитокины и антитела, в биологическом образце. Общий принцип этого анализа включает в себя три этапа: начиная с захвата, или иммобилизации, аналита-мишени на микропланшете, за которым следует обнаружение аналита с помощью специфических для мишени детектирующих белков, и, наконец, ферментативная реакция, при которой конъюгированный фермент превращает свой субстрат в окрашенный продукт. Основанный на различных методах захвата и обнаружения, ИФА может быть четырех типов: прямой, косвенный, сэндвич и конкурентный.
При прямом ИФА целевой антиген сначала связывается с планшетом, а затем обнаруживается специфическим детектирующим антителом. Этот метод обычно используется для скрининга антител к определенному антигену. Непрямой ИФА используется для обнаружения антител в образце с целью количественной оценки иммунных реакций. Пластина сначала покрывается специфическим антигеном захвата, который иммобилизует целевое антитело, а затем этот комплекс антиген-антитело обнаруживается с помощью второго антитела.
В случае сэндвич-ИФА целевой аналит представляет собой антиген, который захватывается на планшете с помощью антитела захвата, а затем обнаруживается антителом обнаружения, образуя таким образом сэндвич антитело-антиген-антитело. Этот метод полезен для измерения концентрации антигена в смешанной пробе.
Конкурентный ИФА используется, когда доступно только одно антитело для целевого антигена, представляющего интерес. Пластина сначала покрывается очищенным антигеном. Между тем, образец, содержащий антиген, предварительно инкубируют с антителом, а затем добавляют в планшет, чтобы позволить любым свободным молекулам антител связываться с иммобилизованным антигеном. Чем выше сигнал от пластины, тем ниже концентрация антигена в образце. Во всех четырех типах ИФА, прямом, непрямом, сэндвичевом и конкурентном, антитело обнаружения либо напрямую конъюгировано с ферментом, либо может быть косвенно связано с ним через другое антитело или белок.
Ферментами, обычно используемыми для реакции, являются пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза с соответствующими субстратами, оба из которых производят растворимый окрашенный продукт, который можно измерить и количественно определить с помощью планшетного ридера. В этом видео вы узнаете, как выполнять непрямой ИФА, сэндвич-ИФА и конкурентный ИФА, а затем приведете примеры количественной оценки целевого аналита с помощью методов непрямого и сэндвич-ИФА.
В первом эксперименте будет продемонстрировано, как использовать непрямой иммуноферментный анализ для определения наличия антител к вирусу гриппа в сыворотке, полученной от мышей, инфицированных гриппом.
Для начала добавьте 50 микролитров очищенного антигена - в данном случае 2 миллиграмма на миллилитр очищенного вируса A/PR/8 гриппа А - в каждую лунку 96-луночного планшета ИФА. Затем накройте планшет клейкой крышкой и инкубируйте его в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы антиген смог прикрепиться к пластине. На следующий день удалите раствор для покрытия, перебросив тарелку над раковиной. Затем заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках с покрытием, добавив в каждую лунку 200 микролитров блокирующего буфера - в данном случае, 5% сыворотки осла в 1X PBS. Оставьте тарелку инкубироваться не менее чем на 2 часа при комнатной температуре. После инкубации снимите блокирующий буфер, а затем промойте планшет, добавив 200 микролитров 1X PBS, содержащего 1% Tween-20. Еще раз перекиньте тарелку над раковиной, чтобы удалить смыв.
Затем подготовьте тестовые образцы, добавив 460 микролитров PBS в свежую пробирку, а затем добавив 40 микролитров сыворотки, чтобы сделать разведение от 1 до 12,5. Затем добавьте 300 микролитров PBS во вторую пробирку, а затем добавьте 100 микролитров первого разбавления. Продолжайте этот диапазон последовательного разведения до получения окончательного образца с разведением от 1 до 204 800. Добавьте в лунки последовательно разведенные образцы сыворотки в трех экземплярах. Накройте тарелку клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение часа. Затем извлеките образцы, бросив пластину в раковину, а затем промойте пластину, добавив 200 микролитров 1X PBS, содержащего 1% Tween-20. Еще раз переверните тарелку, чтобы удалить стирку.
Теперь добавьте в каждую лунку по 100 микролитров конъюгированного ферментом вторичного антитела, которое в данном эксперименте представляет собой пероксидазу хрена, или HRP, конъюгированную вторичную ослиную антитело-мышиное. Выдержите тарелку в течение часа при комнатной температуре и переверните тарелку, чтобы удалить лишнюю жидкость. Промойте пластину 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, а затем нанесите 100 микролитров индикаторной подложки в концентрации один миллиграмм на миллилитр в каждую лунку. Выдержите тарелку с субстратом от 5 до 10 минут при комнатной температуре. В этом примере бесцветный субстрат 3,3', 5,5' - тетраметилбензидин, или TMB, приобретает синий цвет при наличии HRP. Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив 100 микролитров 2Н серной кислоты. Образцы приобретут желтый цвет.
В течение 30 минут после добавления стоп-раствора вставьте планшет в считыватель микропланшетов и считайте показания планшета на соответствующей длине волны для подложки, чтобы определить поглощение лунок.
Для начала проведения бутерброда ИФА пластина должна быть покрыта очищенными антителами захвата. Для этого добавьте 100 микролитров антитела захвата в концентрации в пределах 1-10 микрограмм на миллилитр, в каждую лунку 96-луночного планшета для ИФА. Затем накройте тарелку клейкой крышкой для тарелки, а затем выдержите тарелку в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. После инкубации удалите раствор для покрытия, перебросив тарелку над раковиной.
Теперь заблокируйте оставшиеся места связывания белка в лунках с покрытием, добавив в лунки 200 микролитров 5% обезжиренного сухого молока. Выдерживайте тарелку при комнатной температуре не менее 2 часов. Далее снимите блокирующий буфер, а затем промойте лунки 1X PBS, содержащим 1% Tween-20. Удалите средство для мытья, наведя тарелку на раковину. Теперь добавьте в лунки 100 микролитров тестового образца, заклейте пластину клейкой крышкой, а затем выдержите ее при комнатной температуре в течение 2 часов. После инкубации извлеките образцы, перекинув планшет над раковиной, а затем промойте лунки 200 микролитрами 1X PBS, содержащим 1% Tween-20. Переведите тарелку над раковиной, чтобы удалить смывку, а затем добавьте в лунки 100 микролитров конъюгированного с ферментом антитела для обнаружения.
Запечатайте пластину клеевым чехлом. Оставьте тарелку инкубироваться при комнатной температуре на 2 часа. После инкубации удалите несвязанное антитело обнаружения, перекинув планшет над раковиной, и промойте лунки 200 микролитрами 1X PBS, содержащим 1% Tween-20. Далее добавьте 100 микролитров индикаторного субстрата в концентрации 1 миллиграмм на миллилитр, и выдержите тарелку от 5 до 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 микролитров 2N серной кислоты, а затем прочитайте на планшете в течение 30 минут после добавления стоп-раствора в считывателе микропланшетов.
Для проведения конкурентного ИФА сначала покройте лунки 96-луночного планшета ИФА 100 микролитрами очищенного антигена в концентрации 1-10 микрограммов на миллилитр. Накройте тарелку клейкой крышкой, а затем выдерживайте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. После этого удалите несвязанный раствор антигена из лунок, перекинув пластину над раковиной.
Затем заблокируйте оставшиеся участки связывания белка в лунках с покрытием, добавив 200 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку - здесь 5% обезжиренного сухого молока в PBS. Выдержите тарелку не менее 2 часов при комнатной температуре. Закупоривая лунки, приготовьте смесь антиген-антитело в 1. 5 миллилитров пробирки путем добавления 150 микролитров образца антигена к 150 микролитрам первичного антитела на каждую лунку в анализе. Выдерживайте эту смесь в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь снимите блокирующий буфер с лунок, перебросив пластину над раковиной. Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим Tween 20, а затем добавьте 100 микролитров образца смеси антиген-первичные антитела.
Оставьте тарелку инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Затем удалите смесь образцов, перекинув планшет над раковиной, а затем промойте лунки 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, чтобы удалить любые несвязанные антитела. Добавьте 100 микролитров конъюгированного ферментом вторичного антитела в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После этого промойте пластину 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, а затем добавьте по 100 микролитров раствора субстрата в каждую лунку. Подождите 5-10 минут. Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив 100 микролитров 2N серной кислоты, а затем измерьте абсорбцию в микропланшетном ридере в течение 30 минут после добавления стоп-раствора.
Для полуколичественного непрямого иммуноферментного анализа наличие антител к вирусу гриппа А в серийно разведенных образцах сыворотки от мышей, инфицированных гриппом А, определяли путем считывания абсорбции каждой лунки на 405 нанометрах в планшетном ридоре. Эти необработанные данные экспортируются в электронную таблицу для расчетов. В этом эксперименте последовательно разведенные образцы сыворотки, которые варьируются от 1 - 12,5 до 1 - 204 800, повторялись в трех экземплярах.
Таким образом, для анализа данных вычисляется среднее значение поглощения для каждого набора тройных разрежений путем сложения всех значений для каждого разубоживания и деления суммы на 3. После того, как определено среднее значение для каждого набора тройных разведений, средние показания OD450 строятся в зависимости от серийных разведений. Показания OD уменьшаются по мере разбавления сыворотки, что указывает на то, что в более разбавленных образцах обнаруживается меньше антител. В количественном сэндвич-тесте ИФА разведения известного стандарта, в данном случае рекомбинации человеческого TNFalpha, добавляли в 96-луночный планшет и считывали вместе с неизвестными образцами.
Для создания стандартной кривой было рассчитано среднее значение поглощения для каждого набора показаний известных концентраций. Затем среднее значение поглощения было построено на основе оси y в сравнении с известными концентрациями белка на оси x. Кривая наилучшего вписывания добавляется через точки на графике.
После того, как стандартная кривая построена, количество белка TNFalpha в исследуемом образце может быть определено путем предварительного расчета среднего значения поглощения для испытуемого образца. В этом примере тестовые образцы показали показания OD450 0,636 и 0. 681. Сложив эти значения и разделив сумму на 2, мы получим в среднем 0,659. От оси y на графике стандартной кривой протяните горизонтальную линию от этого значения поглощения до стандартной кривой. В точке пересечения продлите вертикальную линию до оси x и считайте соответствующую концентрацию, которая в данном испытанном образце соответствует концентрации TNFalpha в 38,72 пикограмма на миллилитр.
Q1: What are the three main steps in an ELISA assay?
ELISA involves three sequential steps: capture or immobilization of the target analyte on a microplate, detection of the analyte using target-specific detection proteins, and enzyme reaction where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. This three-step process forms the foundation for all ELISA variants, enabling sensitive quantification of biomolecules in biological samples.
Q2: How does indirect ELISA differ from sandwich ELISA?
Indirect ELISA coats the plate with a specific capture antigen to detect antibodies in a sample, measuring immune responses. Sandwich ELISA uses a capture antibody to coat the plate and detects antigens sandwiched between capture and detection antibodies. Sandwich ELISA is better suited for analyzing complex samples like tissue culture supernatants where the antigen is part of a mixed sample.
Q3: When should competitive ELISA be used instead of other ELISA types?
Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen or when detecting small antigens with a single epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hindrance. The plate is coated with purified antigen, and higher signal indicates lower antigen concentration in the sample, creating an inverse relationship.
Q4: What enzymes are commonly used in ELISA and what do they do?
Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes conjugated to antibodies in ELISA. These enzymes convert colorless substrates into soluble, colored products that can be measured and quantified using a plate reader, enabling detection and quantification of antigen-antibody complexes.
Q5: How is a standard curve created and used in sandwich ELISA?
A standard curve is generated by adding known concentrations of purified recombinant protein to designated wells and processing them alongside test samples. Mean absorbance values for known concentrations are plotted on the y-axis against protein concentrations on the x-axis. Test sample absorbance values are then compared to this curve to determine the unknown antigen concentration in the sample.
Q6: Why is blocking an important step in ELISA protocols?
Blocking prevents non-specific binding of antibodies and proteins to empty sites on the microplate. After coating the plate with antigen or antibody, blocking buffer fills remaining protein-binding sites, reducing background signal and improving assay specificity. This step ensures that only target-specific interactions are detected.
Q7: What information does serial dilution provide in indirect ELISA analysis?
Serial dilution of serum samples reveals antibody concentration patterns by showing how absorbance decreases as samples become more diluted. When mean absorbance values from serially diluted samples are plotted against dilution factors, the resulting curve demonstrates that less antibody is present in more diluted samples, enabling semi-quantitative assessment of immune response.