Анализы ИФА: косвенные, сэндвич и конкурентные

1. Косвенный ИФА

Непрямой ИФА – это метод, при котором первичное антиген-специфическое антитело распознается вторичным конъюгированным антителом. Приведенный ниже протокол является примером метода непрямого иммуноферментного анализа, в рамках которого образцы сыворотки мышей, инфицированных вирусом гриппа А (IAV), проверяются на наличие специфических антител IgG, специфичных для IAV. Одним из преимуществ этого примера является то, что можно использовать различные вторичные антитела, которые распознают все изотипы антител или конкретные изотипы (например, IgG).

Покрытие антигена микропланшетом

1. Покройте лунки 96-луночного планшета для ИФА очищенным антигеном путем пипетирования 50 мкл очищенного антигена (2 мг/мл очищенного вируса A/PR/8 гриппа А в 0,05М трис-HCl буфере (pH 9,5)) в каждую лунку планшета.
2. Накройте планшет клейкой крышкой и инкубируйте его в течение ночи при температуре 4°C, чтобы антиген смог закрепиться на планшете.
3. По завершении инкубации удалите раствор для покрытия, перебросив пластину над раковиной.

Блокировка

4. Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие сайты в лунках с покрытием, добавив 200 мкл блокирующего буфера, здесь используется 5% ослиная сыворотка в 1X PBS, на лунку. Альтернативные блокирующие реагенты включают 5% обезжиренного сухого молока или BSA в PBS или нормальную сыворотку от животного, у которого было получено вторичное антитело.
5. Выдерживать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
6. После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20.

Инкубация с первичным антителом

7. Приготовьте серийное разведение образца сыворотки, содержащего первичное антитело, для получения диапазона разведения от 1 до 204 800 с использованием 1X PBS. Для этого сначала разбавляют сыворотку 1:12,5, а затем проводят 4-кратное разведение (диапазон разведения - от 1:12,5 до 1:204,800).
8. Добавьте в лунки 100 мкл серийно разведенных образцов сыворотки.
9. Накройте пластину с клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1-2 часов.
10. После инкубации перекиньте тарелку над раковиной и вымойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20.

Инкубация с вторичным антителом

11. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл конъюгированного ферментом вторичного антитела, пероксидазы хрена, HRP-конъюгированного осла против мышей вторичного в этом эксперименте.
12. Выдержите тарелку в течение 1 часа при комнатной температуре.
13. После инкубации перекиньте тарелку над раковиной, а затем промойте тарелку PBS, содержащей 1% Tween-20.

Обнаружение

14. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл индикаторного субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ)) в концентрации 1 мг/мл.
15. Инкубируйте тарелку с субстратом в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
16. Через 10 минут остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл 2N серной кислоты (H₂SO₄).
    В течение 30 минут после добавления стоп-раствора считайте показания планшета с помощью микропланшетного ридера с длиной волны 405 нм, чтобы определить абсорбцию лунок.

2. Бутерброд ELISA

В этой версии ИФА экспериментальный образец «зажат» между неконъюгированным антителом захвата и конъюгированным антителом обнаружения, оба из которых специфичны к одному и тому же белку, но имеют разные эпитопы. В следующем примере с помощью сэндвич-ИФА концентрацию человеческого TNFα определяли в неизвестном образце с использованием стандартной кривой, полученной в результате 2,5-кратного серийного разведения известного стандартного рекомбинантного человеческого TNFα (при концентрации 75 пг/мл).

Покрытие для захвата антител к микропланшету

1. Покройте лунки 96-луночного планшета ИФА очищенным антителом захвата, добавив 100 мкл антитела захвата (диапазон 1-10 г/мл) в каждую лунку планшета.
2. Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4°C.
3. После инкубации удалите раствор для покрытия с пластины, перебросив пластину над раковиной.

Блокировка

4. Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках, покрытых антителами, добавив в лунки 200 мкл блокирующего раствора, 5% обезжиренного сухого молока, содержащего PBS.
5. Инкубировать не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
6. После инкубации снимите блокирующий буфер, щелкнув пластиной, а затем промойте пластину PBS, содержащей 1% Tween-20.

Добавить антигенсодержащие тестовые образцы

7. Добавьте в лунки 100 мкл исследуемого образца. Запечатайте пластину клеевым чехлом.
8. Выдерживать в течение 1-2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.
9. После инкубации извлеките образцы, перекинув планшет над раковиной, а затем промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.

Добавить конъюгированное с ферментом антитело обнаружения

10. Добавьте в лунки 100 мкл конъюгированного с ферментом детектирующего антитела в предварительно оптимизированной концентрации.
11. Закройте планшет клейкой крышкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2 часов.
12. Удалите несвязанное антитело обнаружения, перекинув планшет над раковиной, и промойте лунки 200 μL 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.

Обнаружение

13. Добавьте 100 мкл индикаторного субстрата в концентрации 1 мг/мл. Любое связанное антитело, конъюгированное с ферментом, преобразует субстрат в детектируемый сигнал.
14. Выдержать тарелку в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
15. Через 5-10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N H₂SO₄. В течение 30 минут после добавления стоп-раствора прочитайте показания планшета с помощью считывателя микропланшетов, чтобы определить абсорбцию лунок.

3. Соревновательный ИФА

Этапы конкурентного ИФА отличаются от тех, которые используются при непрямом и сэндвич-ИФА, при этом основное различие заключается в стадии конкурентного связывания между образцом антигена и «дополнительным» антигеном. Образец антигена инкубируют с немеченым первичным антителом. Эти комплексы антитела-антиген затем добавляются к планшету ИФА, который был предварительно покрыт тем же антигеном. После инкубационного периода все несвязанные антитела смываются. Существует обратная корреляция между количеством свободного антитела, доступного для связывания антигена в лунке, и количеством антигена в исходном образце. Например, образец с большим количеством антигена будет иметь больше комплексов антиген-первичные антитела, оставляя мало несвязанного антитела для связывания с планшетом ИФА. Затем в лунки добавляют конъюгированное ферментом вторичное антитело, специфичное к первичному антителу, а затем субстрат.

Покрытие антигена микропланшетом

1. Покройте лунки 96-луночного планшета методом ИФА 100 мкл очищенного антигена в концентрации 1-10 мкг/мл.
2. Накройте пластину крышкой с клейкой пластиной и инкубируйте пластину в течение ночи при 4°C.
3. После инкубации удалите несвязанный раствор антигена из лунок, перекинув пластину над раковиной.

Блокировка

4. Заблокируйте оставшиеся белок-связывающие участки в лунках с покрытием, добавив в каждую лунку 200 мкл блокирующего буфера, который может быть либо 5% обезжиренного сухого молока, либо BSA в PBS.
5. Инкубировать планшет не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.

Инкубационный образец (антиген) с первичным антителом

6. При блокировании лунок готовят смесь антиген-антитело, смешивая 150 мкл образца антигена и 150 мкл первичного антитела для каждой лунки в анализе.
7. Выдерживайте эту смесь в течение 1 ч при 37°C.

Добавьте в лунку смесь антиген-антитело

8. Теперь снимите блокирующий буфер с лунок, перебросив пластину над раковиной.
9. Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим Tween-20.
10. Добавьте 100 мкл образца смеси антигена и первичного антитела.
11. Инкубируйте планшет при температуре 37°C в течение 1 ч.
12. Извлеките образец смеси, перебросив тарелку над раковиной.
13. Затем промойте лунки 1X PBS, содержащим 1% Tween-20, чтобы удалить все несвязанные антитела.

Добавьте вторичное антитело

14. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгированного вторичного антитела, которое в данном случае представляет собой AP-конъюгированное антитело.
15. Инкубировать планшет в течение 1 ч при 37°C.
16. После инкубации промойте планшет 1X PBS, содержащим 1% Tween-20.

Обнаружение

17. Добавьте по 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку.
18. Подождите 5-10 минут.
19. Через 10 мин остановите ферментативную реакцию, добавив в лунки 100 мкл 2N серной кислоты. Затем измерьте поглощение в считывателе микропланшетов в течение 30 минут после добавления стоп-раствора