Анализ ELISPOT: обнаружение секретирующих спленоцитов ИФН-γ

1. Настройка

Буферы и реагенты

1. Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция или магния
2. Буфер для покрытия - стерильный PBS или карбонатный буфер
3. Разбавитель анализа - 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) в PBS
4. Среда для культивирования клеток - RPMI 1640 с 10% FBS, пенициллином/стрептомицином и L-глутамином
5. Буфер промывки - PBS, содержащий 0,05% Tween20
6. Двойная дистиллированная вода (ddH₂O)
7. Субстрат детектирования - 100 мг AEC (3-амино-9-этил-карбазола) в 10 мл DMF (N,N, Диметилформамид).

Оборудование

8. Ламинарный колпак
9. Увлажненный инкубатор (установлен на 37°C, 5% CO₂)
10. Автоматический считыватель ELISPOT или препарирующий микроскоп

Материалы

11. Пластины ELISPOT
12. Стерильные и нестерильные резервуары
13. Пипетки и наконечники
14. Стерильные серологические пипетки
15. Стерильные, конические полипропиленовые трубки
16. Две бутылки для мытья тарелок

Реагенты для анализа

17. Клетки - первичные клетки или клеточные линии (здесь использовались спленоциты мышей C57BL/6)
18. Стимуляторы - митоген или антиген (здесь использовались форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 50 нг/мл) и иономицин (1 мкМ))
19. Первичное антитело - биотинилированное антитело, детектирующее антицитокины (разбавленное до 2 мкг/мл в разбавителе анализа)
20. Вторичное антитело - стрептавидин-хрен-пероксидаза (SAv-HRP)

2. Процедура

Покрытие

1. Сохраняя стерильные условия внутри ламинарного проточного колпака, разведите очищенное антитело против захвата цитокинов до конечной концентрации 0,5-4,0 мкг/мл в буфере для стерильного покрытия. (Примечание: для ИФН-γ и ИЛ-6 используйте 5 мкг/мл).
2. Перенесите раствор антитела захвата, 100 μл/лунку, на планшет ELISPOT.
3. Накройте тарелку крышкой для тарелки и закройте ее, чтобы предотвратить испарение.
4. Инкубируйте тарелку в течение ночи при 4°C.

Блокировка

5. На следующий день раскройте пластину ELISPOT в колпаке ламинарного потока. Быстро переверните планшет на стерильные салфетки, чтобы удалить раствор антитела захвата из каждой лунки.
6. Затем добавьте по 200 мкл среды для культивирования клеток в каждую лунку. Этот шаг заблокирует неспецифическое связывание во время анализа.
7. Установите на место крышку планшета и выдержите планшет в течение 2 часов при температуре 37°C.

Покрытие и активация ячеек

8. Во время инкубации планшета приготовьте 2X раствор митогена, содержащий 50 нг/мл PMA и 1 μM иономицин в среде для культивирования клеток.
9. Затем приготовьте целевые клеточные суспензии до исходной концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл.
10. После завершения инкубации удалите среду для клеточных культур из каждой лунки, быстро перевернув планшет на стерильные салфетки внутри колпака ламинарного потока.
11. Затем сгенерируйте 2-кратное серийное разведение раствора суспензии с запасными ячейками. Для этого сначала добавьте 200 мкл приготовленного исходного раствора клеточной суспензии в лунки в верхнем ряду планшета ELISPOT.
12. Затем добавьте 100 мкл простой среды для культивирования клеток в следующие пять рядов планшета под рядами, содержащими раствор клеточного запаса.
13. После этого проведите 2-кратное серийное разведение, пипетируя 100 мкл клеточной суспензии из верхнего ряда в ряд, расположенный непосредственно ниже. Обеспечьте правильное перемешивание, осторожно дозируя этот раствор вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
14. Повторите этот процесс для оставшихся четырех рядов.
15. Оставьте шестой ряд только с питательной средой. Он будет служить в качестве экспериментального контроля.
16. Далее добавьте 100 мкл приготовленного раствора митогена в экспериментальные лунки первых пяти рядов пластины. В контрольные лунки и шестой ряд добавить 100 мкл среды для клеточных культур без митогена.
17. Установите на место крышку планшета и инкубируйте планшет при температуре 37°C, 5% CO₂ в инкубаторе в течение 20-48 часов. (Примечание: 20-24 часа обычно достаточно для обнаружения ИЛ-2 и ФНО-α, тогда как для ИЛ-4 и ИФН-γ оптимальным является 48 часов).

Обнаружение

Первичное антитело

18. Готовят биотинилированное антицитокиновое детектирующее антитело в концентрации 2 мкг/мл в разбавителе анализа.
19. В это время приготовьте 20-25 мл буфера для промывки, смешав 0,05% Tween-20 в PBS.
20. После завершения инкубации откройте крышку планшета и быстро переверните его над раковиной, чтобы удалить всю жидкость из лунок. (Примечание: после этого планшет больше не нужно хранить стерильным).
21. Затем промойте пластину, добавив ~200 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Выдавите эту жидкость, быстро перевернув и перебросив тарелку над раковиной. Повторите этот процесс в общей сложности пять стирок.
22. Далее добавьте в каждую лунку по 100 мкл разбавленного биотинилированного раствора антицитокин-детектирующих антител. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.

Вторичное антитело

23. После завершения инкубации изгоните обнаруженные антитела, перевернув и перебросив пластину над раковиной.
24. Как и раньше, промойте пластину 5 раз с буфером для стирки ~200 μL, выталкивая жидкость между каждым мытьем.
25. Далее в каждую лунку добавляют по 100 мкл разведенного раствора стрептавидин-хренпероксидазы (разведенного до его заданной оптимальной концентрации в разбавителе анализа).
26. Установите на место крышку планшета и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов при 37°C.

Субстрат

27. После инкубации, не более чем за 15 минут до использования, предварительно активируйте раствор субстрата AEC в соответствии с инструкцией производителя.
28. Далее отбрасывайте содержимое лунок и пять раз промойте пластину промывочным буфером, как и раньше.
29. Затем сразу же добавьте в каждую лунку по 100 мкл приготовленного раствора AEC-субстрата.
30. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение ~10-20 минут, наблюдая за развитием пятна.
31. Остановите реакцию, промойте тарелку водой и перебросьте тарелку над раковиной.
32. Промокните тарелку на бумажных полотенцах и дайте тарелке высохнуть на воздухе в течение ночи или до полного высыхания. Снятие пластикового лотка под тарелку облегчит сушку.

3. Сбор и анализ данных

1. После высыхания пятна готовы к подсчету с помощью автоматического считывателя пластин. Здесь используется считыватель CTL Immunospot, но этот протокол может быть адаптирован для любого ридера.
2. Сначала включите прибор, затем компьютер. Затем откройте программу CTL и нажмите "scan count."
3. Нажмите кнопку «Извлечь», чтобы лоток выдвинулся из машины. Затем снимите пластиковый адаптер и совместите ряд «А» на пластине и адаптере ELISPOT.
4. Выберите имя файла и место для сохранения файла и загрузите тарелку в лоток.
5. Затем нажмите «загрузить» в программном обеспечении и закройте дверцу сбоку машины.
6. Убедитесь, что файл сохранен, а затем откройте программное обеспечение контроля качества "QC" для анализа данных и подсчета количества пятен.

Примечания:

1. Минимальное количество клеток должно быть определено в предварительных экспериментах. Оптимальное количество мест ~50/лунка. Если загружено слишком много ячеек, будет трудно обнаружить отдельные пятна. Кроме того, клетки будут перекрываться и не могут образовывать монослой на мембране, таким образом, уровень обнаружения может быть снижен.
2. При оптимизации эксперимента учитывайте ожидаемый уровень экспрессии целевого белка. Чем ниже экспрессия, тем большее количество ячеек требуется на лунку.
3. В отличие от ИФА, тарелку лучше мыть вручную, а не использовать мойку для тарелок. Пластины ELISPOT более деликатные, и следует избегать прокола мембраны из ПВДФ.
4. Следует ограничить движение пластины в период инкубации, так как это может привести к размазыванию пятен.
5. Тарелки следует хранить в темноте, так как воздействие прямого света приводит к выцветанию пятен.