5.4: Анализ ELISPOT: обнаружение секретирующих спленоцитов ИФН-γ

1. Настройка

Буферы и реагенты

1. Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция или магния
2. Буфер для покрытия - стерильный PBS или карбонатный буфер
3. Разбавитель анализа - 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) в PBS
4. Среда для культивирования клеток - RPMI 1640 с 10% FBS, пенициллином/стрептомицином и L-глутамином
5. Буфер промывки - PBS, содержащий 0,05% Tween20
6. Двойная дистиллированная вода (ddH₂O)
7. Субстрат детектирования - 100 мг AEC (3-амино-9-этил-карбазола) в 10 мл DMF (N,N, Диметилформамид).

Оборудование

8. Ламинарный колпак
9. Увлажненный инкубатор (установлен на 37°C, 5% CO₂)
10. Автоматический считыватель ELISPOT или препарирующий микроскоп

Материалы

11. Пластины ELISPOT
12. Стерильные и нестерильные резервуары
13. Пипетки и наконечники
14. Стерильные серологические пипетки
15. Стерильные, конические полипропиленовые трубки
16. Две бутылки для мытья тарелок

Реагенты для анализа

17. Клетки - первичные клетки или клеточные линии (здесь использовались спленоциты мышей C57BL/6)
18. Стимуляторы - митоген или антиген (здесь использовались форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 50 нг/мл) и иономицин (1 мкМ))
19. Первичное антитело - биотинилированное антитело, детектирующее антицитокины (разбавленное до 2 мкг/мл в разбавителе анализа)
20. Вторичное антитело - стрептавидин-хрен-пероксидаза (SAv-HRP)

2. Процедура

Покрытие

1. Сохраняя стерильные условия внутри ламинарного проточного колпака, разведите очищенное антитело против захвата цитокинов до конечной концентрации 0,5-4,0 мкг/мл в буфере для стерильного покрытия. (Примечание: для ИФН-γ и ИЛ-6 используйте 5 мкг/мл).
2. Перенесите раствор антитела захвата, 100 μл/лунку, на планшет ELISPOT.
3. Накройте тарелку крышкой для тарелки и закройте ее, чтобы предотвратить испарение.
4. Инкубируйте тарелку в течение ночи при 4°C.

Блокировка

5. На следующий день раскройте пластину ELISPOT в колпаке ламинарного потока. Быстро переверните планшет на стерильные салфетки, чтобы удалить раствор антитела захвата из каждой лунки.
6. Затем добавьте по 200 мкл среды для культивирования клеток в каждую лунку. Этот шаг заблокирует неспецифическое связывание во время анализа.
7. Установите на место крышку планшета и выдержите планшет в течение 2 часов при температуре 37°C.

Покрытие и активация ячеек

8. Во время инкубации планшета приготовьте 2X раствор митогена, содержащий 50 нг/мл PMA и 1 μM иономицин в среде для культивирования клеток.
9. Затем приготовьте целевые клеточные суспензии до исходной концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл.
10. После завершения инкубации удалите среду для клеточных культур из каждой лунки, быстро перевернув планшет на стерильные салфетки внутри колпака ламинарного потока.
11. Затем сгенерируйте 2-кратное серийное разведение раствора суспензии с запасными ячейками. Для этого сначала добавьте 200 мкл приготовленного исходного раствора клеточной суспензии в лунки в верхнем ряду планшета ELISPOT.
12. Затем добавьте 100 мкл простой среды для культивирования клеток в следующие пять рядов планшета под рядами, содержащими раствор клеточного запаса.
13. После этого проведите 2-кратное серийное разведение, пипетируя 100 мкл клеточной суспензии из верхнего ряда в ряд, расположенный непосредственно ниже. Обеспечьте правильное перемешивание, осторожно дозируя этот раствор вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
14. Повторите этот процесс для оставшихся четырех рядов.
15. Оставьте шестой ряд только с питательной средой. Он будет служить в качестве экспериментального контроля.
16. Далее добавьте 100 мкл приготовленного раствора митогена в экспериментальные лунки первых пяти рядов пластины. В контрольные лунки и шестой ряд добавить 100 мкл среды для клеточных культур без митогена.
17. Установите на место крышку планшета и инкубируйте планшет при температуре 37°C, 5% CO₂ в инкубаторе в течение 20-48 часов. (Примечание: 20-24 часа обычно достаточно для обнаружения ИЛ-2 и ФНО-α, тогда как для ИЛ-4 и ИФН-γ оптимальным является 48 часов).

Обнаружение

Первичное антитело

18. Готовят биотинилированное антицитокиновое детектирующее антитело в концентрации 2 мкг/мл в разбавителе анализа.
19. В это время приготовьте 20-25 мл буфера для промывки, смешав 0,05% Tween-20 в PBS.
20. После завершения инкубации откройте крышку планшета и быстро переверните его над раковиной, чтобы удалить всю жидкость из лунок. (Примечание: после этого планшет больше не нужно хранить стерильным).
21. Затем промойте пластину, добавив ~200 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Выдавите эту жидкость, быстро перевернув и перебросив тарелку над раковиной. Повторите этот процесс в общей сложности пять стирок.
22. Далее добавьте в каждую лунку по 100 мкл разбавленного биотинилированного раствора антицитокин-детектирующих антител. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C.

Вторичное антитело

23. После завершения инкубации изгоните обнаруженные антитела, перевернув и перебросив пластину над раковиной.
24. Как и раньше, промойте пластину 5 раз с буфером для стирки ~200 μL, выталкивая жидкость между каждым мытьем.
25. Далее в каждую лунку добавляют по 100 мкл разведенного раствора стрептавидин-хренпероксидазы (разведенного до его заданной оптимальной концентрации в разбавителе анализа).
26. Установите на место крышку планшета и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов при 37°C.

Субстрат

27. После инкубации, не более чем за 15 минут до использования, предварительно активируйте раствор субстрата AEC в соответствии с инструкцией производителя.
28. Далее отбрасывайте содержимое лунок и пять раз промойте пластину промывочным буфером, как и раньше.
29. Затем сразу же добавьте в каждую лунку по 100 мкл приготовленного раствора AEC-субстрата.
30. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение ~10-20 минут, наблюдая за развитием пятна.
31. Остановите реакцию, промойте тарелку водой и перебросьте тарелку над раковиной.
32. Промокните тарелку на бумажных полотенцах и дайте тарелке высохнуть на воздухе в течение ночи или до полного высыхания. Снятие пластикового лотка под тарелку облегчит сушку.

3. Сбор и анализ данных

1. После высыхания пятна готовы к подсчету с помощью автоматического считывателя пластин. Здесь используется считыватель CTL Immunospot, но этот протокол может быть адаптирован для любого ридера.
2. Сначала включите прибор, затем компьютер. Затем откройте программу CTL и нажмите "scan count."
3. Нажмите кнопку «Извлечь», чтобы лоток выдвинулся из машины. Затем снимите пластиковый адаптер и совместите ряд «А» на пластине и адаптере ELISPOT.
4. Выберите имя файла и место для сохранения файла и загрузите тарелку в лоток.
5. Затем нажмите «загрузить» в программном обеспечении и закройте дверцу сбоку машины.
6. Убедитесь, что файл сохранен, а затем откройте программное обеспечение контроля качества "QC" для анализа данных и подсчета количества пятен.

Примечания:

1. Минимальное количество клеток должно быть определено в предварительных экспериментах. Оптимальное количество мест ~50/лунка. Если загружено слишком много ячеек, будет трудно обнаружить отдельные пятна. Кроме того, клетки будут перекрываться и не могут образовывать монослой на мембране, таким образом, уровень обнаружения может быть снижен.
2. При оптимизации эксперимента учитывайте ожидаемый уровень экспрессии целевого белка. Чем ниже экспрессия, тем большее количество ячеек требуется на лунку.
3. В отличие от ИФА, тарелку лучше мыть вручную, а не использовать мойку для тарелок. Пластины ELISPOT более деликатные, и следует избегать прокола мембраны из ПВДФ.
4. Следует ограничить движение пластины в период инкубации, так как это может привести к размазыванию пятен.
5. Тарелки следует хранить в темноте, так как воздействие прямого света приводит к выцветанию пятен.

Иммуноспот, связанный с ферментами, или ELISPOT, — это метод анализа иммунного ответа на патоген или повреждение клеток. Это позволяет количественно оценить активацию различных иммунных клеток путем обнаружения специфических белков, которые они секретируют. Например, ELISPOT обычно используется для измерения реакции Т-клеток при воздействии чужеродного антигена путем обнаружения секретируемых цитокинов.

Для анализа ELISPOT на основе цитокинов процесс начинается с покрытия микропланшета ELISPOT антителом захвата, специфичным для целевого цитокина. После покрытия антителами Т-клетки добавляются в лунки и стимулируются внешним агентом, например, антителами против CD3. Затем клетки секретируют целевой цитокин, который немедленно иммобилизуется антителом захвата. Поскольку белок захватывается мгновенно после секреции из живых клеток, без разведения или деградации, этот анализ имеет высокую точность. После иммобилизации целевого цитокина добавляется антитело обнаружения, которое также связывается с захваченным цитокином.

Метод ELISPOT также может быть использован для количественной оценки В-клеток памяти после инфекции или вакцинации путем анализа выработки ими специфических антител. В ELISPOT на основе антител специфический антиген используется вместо антитела либо на этапе захвата, когда антиген будет связан с пластиной, либо на этапе обнаружения, когда антиген обнаруживает целевое антитело после захвата. Во всех вариациях процесса, для Т-клеток или В-клеток, детектирующее антитело или антиген биотинилированы, что позволяет им связываться со стрептавидин-конъюгированным детекционным ферментом, таким как пероксидаза хрена. Затем, при добавлении субстрата пероксидазы, AEC, образуется темный, нерастворимый осадок. Этот осадок отмечает местоположение захваченного белка, и в результате каждой секреторной клетки образуется видимое пятно, которое можно количественно определить с помощью считывателя ELISPOT или микроскопа. Размер пятен является относительной оценкой количества белка, секретируемого каждой клеткой. Этот анализ может обнаруживать иммунные реакции отдельных клеток, даже в относительно небольших субпопуляциях секреторных клеток, что делает его полезным для изучения иммунных реакций на клеточном уровне.

В этом видео вы узнаете, как провести анализ ELISPOT, а затем количественно определить количество пятен, представляющих секреторные клетки.

На протяжении всего эксперимента обеспечьте стерильные условия, работая в капюшоне с ламинарным потоком и надевая перчатки.

Все расчеты в этом протоколе основаны на объеме, необходимом для одного 96-луночного планшета.

Во-первых, разбавьте антитело к захвату цитокинов. Для этого нужно переложить 10 миллилитров буфера в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем с помощью пипетки добавьте 10 микролитров одного миллиграмм на миллилитр моноклонального антитела в буфер, чтобы создать раствор с конечной концентрацией один микрограмм на миллилитр. Далее налейте раствор антитела захвата в стерильный резервуар и с помощью многоканальной пипетки распределите по 100 микролитров в каждую лунку 96-луночного планшета ELISPOT.

Накройте тарелку крышкой для тарелки, закройте ее, чтобы предотвратить испарение, и выдерживайте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день раскройте пластину ELISPOT в колпаке ламинарного потока. Быстро переверните планшет на стерильные салфетки, чтобы удалить раствор антитела захвата из каждой лунки. Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую лунку по 200 микролитров среды для культивирования клеток. Этот шаг заблокирует неспецифическое связывание во время анализа. Установите на место крышку пластины и выдерживайте в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

Во время инкубации планшета приготовьте раствор митогена 2X, добавив один микролитр PMA и 20 микролитров иономицина в 10 миллилитров среды для клеточных культур до достижения конечной концентрации 15 нанограмм на миллилитр PMA и одного микромольного иономицина.

Клеточные суспензии спленоцитов мышей также следует готовить в это время в стерильном капюшоне. С помощью микроскопа и гемоцитометра измерьте концентрацию клеток и отрегулируйте общий объем до тех пор, пока не будет достигнута исходная концентрация в два миллиона клеток на миллилитр.

После завершения инкубации быстро переверните планшет на стерильные салфетки, чтобы удалить питательную среду из каждой лунки. Далее добавьте 200 микролитров приготовленного исходного раствора клеточной суспензии в лунки в верхнем ряду пластины ELISPOT. Поставьте эксперимент в трех экземплярах, чтобы каждый тестируемый тип клеток был помещен в набор из трех сгруппированных столбцов. Ниже этого добавьте 100 микролитров простой среды для культивирования клеток в следующие пять рядов планшета, ниже рядов, содержащих раствор клеточного запаса.

Затем выполните серийное разведение, пипетируя 100 микролитров клеточной суспензии из верхнего ряда в ряд непосредственно ниже, аккуратно пипетируя раствор вверх и вниз для равномерного распределения клеток. Повторите этот процесс для остальных рядов, перемещая по 100 микролитров из предыдущего ряда в ряд ниже на каждом шаге, продолжая до тех пор, пока пятый ряд не будет последовательно разбавлен. Оставьте шестой ряд только со средой для клеточных культур, чтобы она служила контролем. Для стимуляции клеток в экспериментальных лунках планшета добавьте 100 микролитров приготовленного раствора митогена в клеточные суспензии в каждой лунке рядов с первого по пятый. Обязательно оставьте шестой ряд, который будет служить контрольным, без стимуляции. Установите крышку на место и выдерживайте пластину при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 24–48 часов.

Приготовьте разведенное биотинилированное антитело, детектирующее антицитокины. Сначала приготовьте 50 миллилитров разбавителя анализа, добавив 5 миллилитров 10% фетальной бычьей сыворотки к 45 миллилитрам PBS. Далее разведите детектирующее антитело до концентрации 2 мкг на миллилитр в разбавителе анализа. Кроме того, в это время приготовьте от 20 до 25 миллилитров буфера для стирки, смешав 0,05% Tween-20 и PBS.

После завершения инкубации откройте крышку планшета и быстро переверните его, чтобы удалить всю жидкость из лунок. Вымойте тарелку, добавив в каждую лунку около 200 микролитров буфера для промывки. Выдавите эту жидкость, быстро перевернув и перебросив тарелку над раковиной. Повторите этот процесс еще четыре раза, в общей сложности пять стирок. Далее в каждую лунку добавьте по 100 микролитров разведенного раствора антител для обнаружения, закройте крышкой, и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух часов. После инкубации вытолкните раствор антител для обнаружения из лунок планшета, перевернув и перебросив планшет над раковиной.

Как и раньше, вымойте тарелку пять раз с помощью буфера для промывки, вытесняя жидкость между каждой стиркой. После окончательной промывки приготовьте раствор стрептавидин-пероксидазы хрена, разбавив его согласно инструкции производителя. Далее, когда лунки тарелки опустошены, добавьте в каждую лунку по 100 микролитров разведенного раствора стрептавидин-хренпероксидазы. Установите крышку обратно на тарелку и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух часов.

После инкубации, не более чем за 15 минут до использования, активируйте заранее приготовленный раствор AEC субстрата. Выбросьте содержимое лунок и промойте пластину пять раз с помощью буфера для промывки, как и раньше. Затем сразу же добавьте в каждую лунку по 100 микролитров приготовленного раствора AEC субстрата. Оставьте пластину при комнатной температуре для проявления примерно на 10-20 минут, наблюдая при этом за развитием пятен. Эти пятна будут проявляться в виде небольших затемненных кругов на поверхности лунок. Затем остановите реакцию, промойте тарелку водой и перебросьте ее над раковиной. Промокните тарелку на бумажных полотенцах и дайте высохнуть на воздухе в течение ночи или до полного высыхания. Снятие пластикового лотка под тарелку облегчит сушку. После высыхания пятна готовы к подсчету с помощью автоматического считывателя пластин.

Здесь используется считыватель CTL ImmunoSpot, но этот протокол может быть адаптирован под любой считыватель. Затем откройте программу CTL и нажмите «Количество сканирований». Нажмите кнопку извлечения, чтобы лоток выдвинулся из машины. Затем снимите пластиковый адаптер и совместите ряд А на пластине и адаптере ELISPOT. Выберите имя файла и место для сохранения файла, а затем загрузите пластину и адаптер в лоток. Нажмите «Загрузить» в программном обеспечении и закройте дверцу сбоку машины. Затем нажмите «Старт после подсчета». Убедитесь, что файл сохранен, а затем откройте программное обеспечение контроля качества, чтобы проанализировать данные и подсчитать количество пятен. Экспортируйте эти данные в виде файла Excel. После завершения анализа нажмите кнопку Eject (Извлечь), чтобы извлечь пластину.

В этом эксперименте клетки мышей дикого типа и мышей с опухолями были покрыты и проанализированы на ИФН гамма. Обратите внимание, что количество пятен уменьшается с уменьшением концентрации клеток. Как правило, данные ELISPOT представляются в виде количества пятен на количество покрытых клеток. В этом примере количество пятен было отображено на гистограмме, где каждая соответствующая концентрация клеток была указана по оси x. Обратите внимание, что количество пятен указывает на количество активированных клеток на общее количество клеток в данной популяции.