Иммуногистохимия и иммуноцитохимия: визуализация тканей с помощью световой микроскопии

Иммуноцитохимия и иммуногистохимия являются методами окрашивания белка, представляющего интерес в культивируемых клетках и тканях соответственно. Основной принцип обоих связанных методов заключается в использовании специфических антител, помеченных системой обнаружения, для идентификации и визуализации белка и определения его местоположения в клетках и тканях, а также относительных уровней. Процесс в любом эксперименте начинается с подготовки образца.

Для иммуноциктохимии, которая конкретно визуализирует расположение белков или антигенов в клетках, она включает в себя три этапа. Первым этапом является гальванизация, которая влечет за собой культивирование клеток в питательных средах на покровном стекле или предметном стекле, как правило, в лунках культивальной пластины. За этим следует фиксация, при которой в клетки добавляется преципитирующий или сшивающий агент, такой как параформальдегид, чтобы сохранить структурную целостность белков и предотвратить их деградацию активностью ферментов. Последним этапом является пермеабилизация, которая включает в себя добавление моющего средства, чтобы сделать клеточные мембраны проницаемыми для окрашивания.

При использовании метода аналога иммуногистохимия, белки или антигены визуализируются в тканях, а подготовка образца состоит из пяти этапов. Сначала фиксации подвергается вся ткань, обычно с помощью параформальдегида. Затем следует встраивание ткани в блок парафина, а затем разрезание этого блока с помощью машины, называемой микротомом, чтобы разрезать ткань на тонкие ломтики, которые можно поместить на предметные стекла. Затем предметные стекла подвергаются депарафинизации, или удалению парафина вокруг среза ткани. Затем может быть выполнен дополнительный этап извлечения антигена. Это можно сделать либо с помощью тепла, либо с помощью ферментов для демаскировки эпитопов, которые были сшиты во время фиксации, что делает их доступными для связывания антител. После соответствующей пробоподготовки к образцу клетки или ткани добавляют первичный мишенно-специфический первичный антитело. Это первичное антитело должно связываться с интересующим белком. Далее добавляется вторичное антитело, которое обнаруживает и связывается с первичным антителом. Это вторичное антитело конъюгировано с ферментом под названием HRP или может связываться с ним. Когда добавляется его специфический субстрат, DAB, HRP преобразует его в нерастворимый коричневый осадок. Это коричневое пятно отмечает местоположение целевого белка. Предметные стекла также окрашены гематоксилином, который помечает ядра синим цветом и обеспечивает пространственную точку отсчета для определения субклеточной локализации. После этого на предметное стекло добавляется монтажный носитель, а затем накладка на крышку для того, чтобы герметизировать и сохранить испачканный образец. Наконец, предметные стекла можно визуализировать на световом микроскопе.

В этом видео вы узнаете о технике подготовки образцов для пластинчатых клеток и срезов тканей с последующим иммуноокрашиванием срезов тканей.

Во-первых, интересующие вас клетки должны быть размещены на покровных листах. Для этого, работая в тканевом культуральном шкафу, поместите отдельные покровные стекла в лунки 24-луночного планшета. Затем закройте створку и включите ультрафиолетовый свет, чтобы стерилизовать покровные стекла не менее чем на 15 минут. Далее выключите ультрафиолетовый свет. Чтобы поднять интересующие клетки из сливающейся 10-сантиметровой чашки, аспирируйте среду, кратковременно промойте PBS и добавьте трипсин в клетки на 2 минуты. Затем постучите по боковой стороне планшета, чтобы убедиться, что клетки оторвались, и нейтрализуйте трипсин с помощью среды. Далее прибавляем 0. Внесите по 5 мл суспензии ячеек в каждую лунку, убедившись, что покровные стекла закрыты. Поместите планшет во влажный CO2-инкубатор и дайте клеткам расти при температуре 37 градусов Цельсия, пока они не сливаются на 50-70%.

Как только клетки достигнут оптимального слияния, отсасывайте питательную среду из каждой лунки, а затем фиксируйте клетки, инкубируя их в . 5 мл 4% параформальдегида разведить в 1X PBS в течение 20 минут при комнатной температуре. После снятия фиксатора промойте ячейки, добавив 1 мл 1X PBS на каждую покровную крышку. Сразу же отсасывайте PBS, затем повторите полоскание еще 2 раза, всего 3 стирки.

Теперь проникните клетки, добавив 0,5 мл 0,1% Triton X-100 в 1X PBS в каждую лунку. Оставьте тарелку при комнатной температуре на 15 минут. Отсадите буфер для пермеабилизации, а затем промойте клетки, добавив 1 мл 1X PBS в каждую лунку. Немедленно отсадите PBS и повторите полоскание еще 2 раза, всего 3 стирки. Теперь, когда клетки на покровных стеклах зафиксированы и проникнуты, переходим к процедуре окрашивания, продемонстрированной для следующего примера иммуногистохимии, за исключением того, что инкубацию следует проводить в лунках 24-луночного планшета, а не непосредственно на предметном стекле тканевого среза.

Для начала получите подготовленные, фиксированные формалином, залитые парафином срезы ткани. Депарафинизируйте предметные стекла, поместив их в штатив для слайдов, а затем полностью погрузив в 250 мл 100% ксилола. Дайте предметным стеклам поинкубироваться в течение 5 минут в ксилоле. Затем достаньте предметные стекла из контейнера, протрите их бумажным полотенцем и поместите в новую ванну с ксилолом в свежей емкости еще на 5 минут.

Затем регидратируйте срезы в серии растворов градуированного этанола, начиная со 100% этанола, в течение 3 минут. Протрите решетку для слайдов бумажным полотенцем и переложите слайды в новую емкость со 100% этанолом еще на 3 минуты. Продолжайте этот цикл стирки, протирания бумажным полотенцем и переноса горок в новую ванну в соответствии с указанными концентрациями этанола в течение указанного времени. После окончательной промывки этанолом протрите решетку бумажным полотенцем и инкубируйте предметные стекла в 100 мл 0,3% перекиси водорода в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы блокировать любую активность эндогенной пероксидазы. Промойте предметные стекла в 250 мл 1X PBS в течение 5 минут. Повторите эту стирку в емкости со свежим 1X PBS еще 5 минут.

Затем выполните извлечение антигена, погрузив предметные стекла в 250 мл буфера цитрата ИГХ при pH 6,0 и прокипятив их в течение 20 минут. Затем приступайте к протоколу окрашивания.

Чтобы начать процесс окрашивания для ИГХ, обведите срезы гидрофобным пером, чтобы определить минимальную площадь, которую должен покрыть буфер. Затем с помощью пипетки поместите 100 микролитров блокирующего буфера, который в этом эксперименте представляет собой лошадиную сыворотку, разведенную в 1X PBS, на срез. Выдержите предметные стекла в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого извлеките блокирующий буфер с помощью пипетки.

Затем разбавьте первичное антитело и блокирующий буфер в соотношении 1:100, добавив 990 микролитров лошадиной сыворотки, разведенной в 1X PBS, в 1. 5 мл пробирки Эппендорфа, за которым следует 10 микролитров первичного антитела. Добавьте по 100 микролитров разведенного первичного антитела в каждую секцию и инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре. Когда сработает таймер, слейте первичные антитела с каждого предметного стекла, а затем промойте их в 250 мл 1X PBS в течение 5 минут. Повторите эту стирку еще раз, используя свежий 1X PBS.

Во время промывки предметных стекол в 1X PBS разбавьте вторичное антитело до разведения 1:200, добавив 995 микролитров блокирующего буфера в пробирку объемом 1,5 мл, а затем 5 микролитров вторичного антитела, которое в данном случае представляет собой биотинилированный лошадиный антимышиный IGG. Добавьте по 100 микролитров разведенного вторичного антитела в каждую секцию, а затем инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 30 минут удалите вторичное антитело, сцедив его со срезов, затем промойте предметные стекла в 250 мл 1X PBS в течение 5 минут. Повторите эту стирку, используя свежий 1X PBS.

Теперь добавьте 100 микролитров комплексного реактива авидин-биотин и инкубируйте срезы в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее промойте предметные стекла, погрузив их в 250 мл 1X PBS на 5 минут. Как и на предыдущих этапах стирки, повторите эту стирку еще раз, используя свежий 1X PBS. Затем проявите слайды, инкубируя срезы в 100 микролитрах DAB в течение 5 минут. Остановите проявку, погрузив срезы в 250 мл дистиллированной воды на 5 минут.

Теперь при желании слайды можно запятнать. Для этого ненадолго опустите предметные стекла в 250 мл раствора гематоксилина Харриса. Смойте противостойное пятно, промыв предметные стекла в 250 мл дистиллированной воды в течение 5 минут. Повторите эту промывку еще 1 раз, используя свежую дистиллированную воду. Далее обезвоживаем срезы. Для этого сначала инкубируют предметные стекла в 95% этаноле в течение 5 минут. Промокните слайды на бумажном полотенце, и переложите их в новую емкость со свежим 95% этанолом еще на 5 минут. Продолжайте цикл умывания, промокнув бумажным полотенцем, и перенося горки в новую ванночку, следуя указанным растворам по 5 минут каждая.

После окончательной инкубации промокните предметные стекла бумажным полотенцем, затем добавьте на предметные стекла каплю монтажного материала, такого как Organo-Limonene Mount. Теперь наденьте на секции покровную крышку, стараясь не задерживать пузырьки воздуха. Теперь предметные стекла готовы к рассмотрению под микроскопом для анализа.

Чтобы наблюдать за окрашенными участками, используйте стандартный световой микроскоп для визуализации пятна и цифровую камеру для захвата изображения. В этом конкретном примере ИГХ ткани селезенки дикого типа и спонтанных, двойных трансгенных мышей или мышей DTG сравниваются для изучения экспрессии Dyclin D1 при лимфоме. Ткани были залиты парафином, срезы и окрашены антителом антициклина D1 и визуализированы при 20-кратном увеличении. Клетки, экспрессирующие циклин D1, обозначены красновато-коричневым цветом на фоне синей ткани. Сравнивая интенсивность окрашивания на изображениях от различных мышей, можно увидеть, что неувеличенная селезенка имеет относительно низкое количество экспрессии Cyclin D1 независимо от генотипа мыши. Напротив, увеличенная селезенка мыши DTG имеет повышенное красновато-коричневое окрашивание, что указывает на корреляцию между развитием рака и экспрессией циклина D1 в этой модели мыши.