Иммуногистохимия и иммуноцитохимия: визуализация тканей с помощью световой микроскопии

1. Подготовка клеток к иммуноцитохимии

1. Затравливайте интересующие клетки на камерные предметные стекла или камерные покровные стекла путем добавления 0,5 мл клеточной суспензии в лунки 24-луночного культурального планшета><. Примечание: Некоторые клетки могут нуждаться в росте на обработанных покровных стеклах, таких как покровные листы, обработанные полилизином. Оптимальные условия лечения должны быть определены пользователем в зависимости от типа используемой клетки.
2. Поместите планшет в увлажненный инкубатор с_CO2 и дайте клеткам расти при температуре 37°C до 50-70% слива.
3. Как только клетки достигнут оптимальной конфлюенции, удалите питательную среду из каждой лунки, а затем зафиксируйте клетки, инкубировав их в 0,5 мл 4% PFA (разведенного в 1X PBS) и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
4. Снимите фиксатор и трижды промойте лунки 1 мл 1X PBS.
5. Затем проникните клетки, добавив в каждую лунку 0,5 мл 0,1% Triton-X-100 в 1X PBS и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
6. Отсадите буфер для пермеабилизации и трижды промойте лунки 1 мл 1X PBS.
7. Ячейки на покровных стеклах теперь закреплены и пропитаны. Перейдите к процедуре окрашивания, продемонстрированной для следующего примера иммуногистохимии, за исключением того, что инкубацию следует проводить в лунках 24-луночного планшета, а не непосредственно на предметном стекле тканевого среза.

2. Подготовка фиксированных формалином, залитых парафином участков для окрашивания

1. Получите подготовленные фиксированные формалином, залитые парафином срезы ткани.

Депарафинизация

2. Погрузите слайды в 100% ксилол 2 раза по 5 мин каждый.

Регидратация

3. Погрузите предметные стекла в 100% этанол 2 раза по 3 минуты каждый.
4. Погрузите предметные стекла в 95% этанол на 3 минуты.
5. Погрузите предметные стекла в 70% этанол на 3 минуты.
6. Погрузите предметные стекла в 50% этанол на 3 минуты.

Блокирование активности эндогенной пероксидазы

7. Инкубируйте предметные стекла в 100 мл 0,3%_Н2О₂ в течение 30 мин при комнатной температуре.
8. Промойте слайды 1X PBS 2 раза по 5 минут каждый.

Извлечение антигена

9. Погрузите предметные стекла в буфер цитрата ИГХ (pH 6) и прокипятите их в течение 20 минут.
10. Теперь предметные стекла готовы к окрашиванию.

3. Подготовка свежезамороженных, безрецептурных срезов к окрашиванию

1. Поместите 5 мм свежей изолированной ткани в форму и добавляйте ОКТ до полного покрытия среза.
2. Медленно погрузите тканевый блок в жидкий азот до полного замерзания. Теперь образец можно хранить при температуре -80°C до 1 года.
3. Когда все будет готово к секционированию, перенесите замороженный тканевый блок в криостат и дайте всей установке нагреться до -20°C.
4. Вырежьте срезы ткани толщиной 5-10 мкм с помощью криостата и с помощью кисти разместите срезы непосредственно на стеклянных предметных стеклах, совместимых с IHC.
5. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Предметные стекла также можно хранить при температуре -80°C.
6. Погрузите предметные стекла в 250 мл 4% PFA на 15 минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать предметные стекла перед окрашиванием. Оптимальный способ фиксации должен быть определен пользователем.
7. Погрузите предметные стекла в 250 мл 1X PBS 2 раза по 5 минут каждый.
8. Погрузите предметные стекла в 250 мл 0,3% H₂O₂ на 30 минут при комнатной температуре, чтобы блокировать любую активность эндогенной пероксидазы.
9. Погрузите предметные стекла в 250 мл 1X PBS 2 раза по 5 минут каждый.
10. Теперь предметные стекла готовы к окрашиванию.

4. Окрашивание

1. Обведите ткань гидрофобным барьером с помощью барьерной ручки.

Блокировка

2. С помощью пипетки поместите 100 мкл блокирующего буфера (лошадиная сыворотка, разведенная в 1X PBS) - на срез на 1 час при комнатной температуре.
3. Удалите блокирующий буфер с помощью пипетки.

Инкубация первичных антител

4. Инкубировать окруженную ткань с 100 мкл разведенного раствора первичного антитела (мышиный античеловеческий циклин D1, разведенный в соотношении 1:100 в блокирующем буфере) в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Слейте первичное антитело с каждого предметного стекла и промойте предметные стекла 1X PBS 2 раза по 5 минут каждое.

Инкубация вторичных антител

6. Инкубируйте образец со 100 мкл разбавленного биотинилированного вторичного антитела (биотинилированный лошадиный антимышиный IgG в соотношении 1:200) в течение 30 минут при комнатной температуре.
7. Удалите вторичное антитело, сцедив срезы, и промойте 1X PBS 2 раза по 5 минут каждая.

Развитие цвета

8. Визуализация с помощью HRP: добавьте 100 μл реагента авидин-биотиновый комплекс (ABC) и инкубируйте срезы в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре
   Примечание: Флуоресцентно меченные антитела также могут быть использованы и визуализированы с помощью соответствующего микроскопа.
9. Промойте слайды 1X PBS 2 раза по 5 минут каждый.
10. Проявите предметные стекла путем инкубации срезов в 100 μл DAB в течение 5 минут.
11. Остановите развитие, добавив дистиллированную воду (dH₂O) на 5 минут при комнатной температуре.

Counterstaining (при желании)

12. Кратковременно погрузите предметные стекла в раствор гематоксилина Харриса (или 0,5% метилзеленого в 0,1М ацетата натрия (pH 4,2)) на 10 минут.
13. Смойте пятно, промыв предметные стекла в dH₂O два раза по 5 минут каждый.

Обезвоживание

14. Погрузите предметные стекла в 95% этанол 2 раза по 5 минут каждый.
15. Погрузите предметные стекла в 100% этанол 2 раза по 5 минут каждый.
16. Погрузите слайды в 100% ксилол 2 раза по 5 мин каждый.
17. Промокните горки бумажным полотенцем.

Применение монтажа и защитного стекла

18. Добавьте каплю монтажного материала, такого как органолимонное крепление, на направляющие и наложите покровное стекло на секции.

Микроскопический анализ

19. Рассмотрите окрашенные срезы под соответствующим микроскопом для анализа. Здесь для наблюдения использовался стандартный световой микроскоп, а для визуализации — установленная цифровая камера.