Генерация антител: получение моноклональных антител с использованием гибридом

Антитела являются мощным инструментом для исследований и диагностики, а это означает, что часто необходимо производить их в больших количествах.

Первым шагом к получению антител является введение интересующего антигена животному-хозяину. Антиген активирует В-клетки хозяина, которые затем вырабатывают и выделяют антитела, специфичные к этому антигену. Затем проводится регулярный скрининг антител животного-хозяина на наличие антитела-мишени с помощью ИФА или другого метода обнаружения. Как только он обнаружен, селезенка животного-хозяина, которая содержит В-клетки, удаляется. Если все В-клетки из селезенки теперь изолированы, это должно включать популяцию, которая секретирует антитела к интересующему антигену. Мы называем эту популяцию поликлональной, потому что каждая клетка, вероятно, связана с разным эпитопом антигена и, следовательно, вырабатывает свое собственное индивидуальное и уникальное антитело.

Для получения моноклональных антител, антител, выращенных для распознавания одного конкретного эпитопа, отдельная В-клетка, которая продуцирует желаемое антитело, должна быть сначала изолирована и культивирована. К сожалению, В-клетки плохо приживаются в культуре. Поэтому, чтобы преодолеть это препятствие, ученые объединяют В-клетки с бессмертными клетками миеломы, в результате чего образуются гибридомы. Затем эти клетки выращиваются в селективной среде, которая позволяет только гибридомам расти и высвобождать антитела. Опять же, среду проводят скринингом с использованием такого метода, как ИФА, на наличие желаемого антитела. Как только гибридомы обнаружены, их клонируют с помощью процесса, называемого предельным разведением, последовательного разведения родительской культуры, которое должно привести к тому, что отдельные клетки будут засеяны в лунки просеивающей пластины. Это позволяет выращивать гибридомы из одной родительской клетки, получая моноклональную клеточную линию, которая высвобождает только желаемое антитело. Эти моноклональные линии могут быть расширены в колбах для тканевых культур для получения большого количества моноклональных антител. После этого, по мере того как клетки начинают отмирать, антитела могут выпадать в осадок из среды с сульфатом аммония. В норме в растворе антитела взаимодействуют с водой посредством гидрофильных взаимодействий. Тем не менее, аммоний и сульфат являются высокозаряженными ионами, которые отделяют молекулы воды от антител, снижая растворимость антител и вызывая их осаждение.

Для начала сначала проверьте список материалов и подготовьте все среды, расходные материалы и рабочие поверхности для протокола.

Затем включите водяную баню и установите ее на 37 градусов по Цельсию. Затем добавьте 10 миллилитров полного RPMI в 15-миллилитровую коническую пробирку и 15 миллилитров полного RPMI в колбу для клеточных культур T75 и отложите их в сторону. Соблюдая осторожность и надевая соответствующие средства индивидуальной защиты, извлеките замороженный флакон, содержащий клетки гибридомы, из хранилища жидкого азота. Чтобы ослабить давление внутри флакона, слегка ослабьте крышку. Теперь осторожно инкубируйте флакон на водяной бане, следя за тем, чтобы крышка оставалась над поверхностью воды, чтобы свести к минимуму вероятность заражения. Когда клетки почти разморозятся, что обычно занимает около двух минут, переместите флакон в колпак для культуры тканей.

Затем протрите внешнюю сторону флакона 70% этанолом, прежде чем снять крышку. С помощью стерильной пипетки перенесите клетки в коническую трубку, содержащую 10 миллилитров полной среды RPMI. Затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 1200 об/мин. После центрифугирования переместите пробирку обратно к тканевому колпаку и протрите внешнюю сторону пробирки этанолом. Не повреждая гранулы, выбросьте надосадочную жидкость, а затем добавьте пять миллилитров свежей полной среды RPMI и аккуратно пипетируйте вверх и вниз до повторного воздействия. Затем перенесите клетки в колбу для клеточных культур T75 и поместите колбу в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Позвольте клеткам достичь примерно 80% конфлюенции, что обычно занимает около трех дней. Обратите внимание, что гибридомные клетки не адгезивны и будут расти во взвешенном состоянии в среде. Время достижения достаточного слияния может варьироваться в зависимости от начального количества живых клеток и типа используемых гибридомных клеток.

Как только клетки достаточно сливаются, используйте стерильную 25-миллилитровую пипетку, чтобы перенести их из колбы для культур в коническую центрифужную пробирку. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 1200 об/мин в течение пяти минут. Пока клетки находятся в центрифуге, добавьте по 18 миллилитров полного RPMI в каждую из трех новых колб для клеточных культур T75 и отложите их в сторону. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в шести миллилитрах полной RPMI. Затем добавьте по два миллилитра клеточной суспензии в каждую из трех новых колб для клеточных культур. Наконец, поместите колбы в инкубатор, настроенный на 5% углекислого газа и 37 градусов Цельсия, и инкубируйте до тех пор, пока колбы не станут примерно на 80% сливающимися, примерно три дня.

На этом этапе клетки готовы к продолжению своего роста в бессывороточной среде, предназначенной для гибридомных клеточных линий, такой как коммерчески доступная базальная жидкая среда HB, содержащая добавку HB101. Перенесите клетки из каждой колбы для клеточных культур в конические центрифужные пробирки, а затем гранулируйте клетки центрифугированием при 1200 об/мин в течение пяти минут. Теперь добавьте 230 миллилитров добавки HB101 без сыворотки в каждую из шести колб для клеточных культур площадью 225 квадратных сантиметров и отложите их в сторону. Когда центрифугирование будет завершено, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 10 миллилитрах добавленной среды HB101. Затем в каждую колбу для клеточных культур добавьте по пять миллилитров клеточной суспензии. Поместите колбы в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия и продолжайте выращивать клетки в течение примерно трех недель. В течение этого времени клетки будут продуцировать и высвобождать представляющее интерес моноклональное антитело в культуральную среду, и антитело будет готово к очистке, когда клетки начнут умирать.

Чтобы удалить клеточный мусор из питательных сред, содержащих антитела, содержимое культуральных колб разливают в пробирки для ротора с фиксированным углом. Поместите трубки в ротор и убедитесь, что он правильно сбалансирован перед центрифугированием. Вращайте трубки со скоростью 10 000 об/мин в течение восьми минут. Пока образцы центрифугируются, поместите двухлитровый пластиковый стакан с мешалкой в ведро со льдом, а затем поставьте ведро со льдом на тарелку для перемешивания.

Далее к литровой бутылке прикрепите 500-миллилитровую крышку фильтра. Прикрепите этот фильтрующий блок к домашнему пылесосу с помощью соответствующей трубки. Затем налейте надосадочную жидкость, содержащую антитело, в верхнюю часть фильтра. Центрифугируйте оставшуюся среду для отделения клеточного мусора от надосадочной жидкости, содержащей антитело. Когда верхняя часть фильтра заполнится надосадочной жидкостью, запустите пылесос. Затем, когда литровая бутылка для сбора будет близка к заполнению, снимите крышку фильтра и вылейте отфильтрованную надосадочную жидкость в двухлитровый стакан со льдом. Повторяйте шаги фильтрации до тех пор, пока не будет обработана вся надосадочная жидкость.

Когда вся проба будет обработана, взвесьте 295 грамм сульфата аммония на один литр отфильтрованной надосадочной жидкости. Запустите пластину для перемешивания и медленно добавляйте сульфат аммония в надосадочную жидкость в течение следующих нескольких часов. Это предотвращает локализованную высокую концентрацию соли сульфата аммония, которая может привести к выпадению нежелательных белков в осадок. После того, как весь сульфат аммония будет добавлен, накройте стакан фольгой и переместите его вместе с пластиной для перемешивания в холодное помещение при температуре четыре градуса Цельсия и установите его на перемешивание раствора антител на ночь.

На следующее утро вылейте раствор антитела, содержащий сульфат аммония, из двухлитрового стакана в чистые пробирки для ротора с фиксированным углом. Центрифугируйте пробирки при 6500 об/мин в течение 20 минут без перерыва, чтобы гранулировать антитело на дне пробирок. Затем вакуумируйте надосадочную жидкость, соблюдая осторожность, чтобы не всасывать мягкую гранулу. Продолжайте использовать тот же набор пробирок для сбора гранулированного антитела из остатков надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония. После последней аспирации повторно суспендируйте каждую гранулу антитела примерно в одном миллилитре PBS.

Чтобы удалить сульфат аммония из раствора антитела, сначала отрежьте примерно один дюйм диализной трубки на каждый миллилитр раствора антитела. Далее протрите трубку дистиллированной водой и завяжите узел на одном конце трубки. Наполните трубку дистиллированной водой, чтобы проверить наличие утечки из узла. Если через несколько минут утечки нет, слейте воду из трубки.

Далее пипеткой введите раствор антитела в трубку. Чтобы извлечь как можно больше антител, промойте пробирки еще 0,25 миллилитрами PBS и перенесите их на трубку. Закрепите верхнюю часть трубки как можно ближе к раствору с помощью диализного зажима. Затем прикрепите верхнюю часть трубки к внешней стороне четырехлитрового стакана, а заполненную часть трубки свисаем в стакан. Теперь поднесите стакан в холодную камеру с температурой четыре градуса Цельсия и положите его на тарелку для перемешивания. Наполните стакан доверху PBS и добавьте полосу для перемешивания. Дайте пробирке и раствору перемешаться в течение ночи в течение примерно восьми часов. На следующее утро замените PBS в стакане свежим PBS, а затем снова оставьте стакан перемешивать примерно на восемь часов. Позже тем же вечером повторите процесс в последний раз. Утром откройте диализную трубку, а затем перенесите раствор антитела из трубки в 15-миллилитровые конические пробирки. Чтобы удалить любой осадок, который мог образоваться во время диализа, центрифугируйте пробирки в течение пяти минут при 1200 об/мин. Наконец, переложите надосадочную жидкость в свежие пробирки.

Чтобы количественно определить концентрацию антитела, сначала произведите 20-кратное разведение, добавив пять микролитров аликвоты антитела к 95 микролитрам PBS. Затем пипеткой нанесите разведенное антитело в кювету и с помощью спектрофотометра зарегистрируйте концентрацию на уровне 280 нанометров. Далее рассчитайте концентрацию антител по приведенной формуле. Наконец, наклейте на флаконы с завинчивающейся крышкой название антитела, концентрацию, дату приготовления и, если применимо, номер партии и имя экспериментатора, а затем распределите антитело по маркированным флаконам с завинчивающейся крышкой. Их можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до тех пор, пока они не понадобятся.

Примеры выходов с использованием антимышиной линии CD317 или гибридома PDCA-1 120G8 варьировались от 44 до 99,6 мг, что обычно дает в среднем 67,3 мг. Важно отметить, что каждый производственный цикл с одной и той же линией гибридомных клеток может немного отличаться по количеству моноклональных антител, доступных в конце.