Генерация антител: получение моноклональных антител с использованием гибридом

Примечание: При работе с гибридомными клетками и средой стерильным способом (например, в шкафу биобезопасности) следует придерживаться стерильного метода культивирования клеток до тех пор, пока не наступит стадия очистки антител.

1. Размораживание замороженных гибридомных клеток

1. Инкубируйте флакон с замороженными гибридомными клетками на водяной бане при температуре 37°C до полного оттаивания (примерно 2 минуты).
2. Добавьте размороженные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл полного RPMI (RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 1x заменимых аминокислот, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 10 мМ HEPES).
3. Центрифуга в течение 5 минут при 1200 об/мин, чтобы смыть любые загрязняющие сублимационные среды.
4. После центрифугирования выбросьте жидкую надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл свежего полного RPMI. Затем добавьте клетки в колбу для культуры тканей T75, содержащую 15 мл полного RPMI (конечный объем RPMI составляет 20 мл).
5. Выращивайте клетки в стандартном инкубаторе при температуре 37°C с 5% CO₂. Клетки не адгезивны во время культивирования.

2. Расширение гибридомы

1. Дайте клеткам разрастись в течение примерно 3 дней, пока колба не станет слитой на ~80%.
   Примечание: Это время может варьироваться в зависимости от начального количества клеток, а также от внутренних различий в скорости роста разных клеток. Важно, чтобы клетки находились в фазе экспоненциального роста.
2. Как только исходная колба достигнет ~80% конфлюенции, извлеките элементы из этой первоначальной колбы T75, поместите в коническую центрифужную трубку и вращайте (1200 об/мин в течение 5 минут), чтобы гранулировать ячейки.
3. Ресуспендируйте клетки в 6 мл полной RPMI, а затем распределите клеточную суспензию в три новых колбы T75 (2 мл/колба, содержащая 18 мл RPMI). Инкубируйте эти три колбы T75 при температуре 37°C с 5% CO₂, пока они не станут ~80% сливающимися (это должно занять примерно 3 дня).

3. Выработка антител в бессывороточной среде

Примечание: На этом этапе клетки готовы продолжить свой рост в бессывороточной среде, предназначенной для роста гибридомных клеточных линий. В этом протоколе мы используем готовую к использованию, коммерчески доступную базальную жидкую среду HB, содержащую добавку HB101.

1. Элементы из каждой из трех колб T75 (при конфлюенции ~80%) собираются и центрифугируются (1200 об/мин в течение 5 мин).
2. Клеточную гранулу из каждой колбы T75 ресуспендируют в 10 мл добавки HB101 бессывороточной среды, а затем добавляют в две колбы T225 с добавлением бессывороточной среды HB101 (т.е. по 5 мл клеточной суспензии в каждую из 6 колб, содержащих ~220-240 мл HB101 в каждой колбе).
3. Продолжайте выращивать клетки в колбах T225 и средах HB101 при температуре 37°C с 5% CO₂ в течение трех недель или до тех пор, пока клетки не начнут умирать. В течение этих 3 недель клетки продуцируют mAb и выделяют его в культуральную среду. Как только клетки начинают умирать, они больше не производят mAb.

4. Очистка антител - день 1

Примечание: На данном этапе стерильность не требуется, поэтому не требуется стерильное обращение со средой (например, в шкафу биобезопасности). Кроме того, гибридомы не считаются агентами «уровня BSL2».

1. Залейте материал из колб в трубки для ротора с фиксированным углом. Вращайте пробирки в центрифуге с фиксированным углом вращения ротора со скоростью 10 000 об/мин в течение 8 минут. Этот этап предназначен для удаления клеточного мусора из надосадочной жидкости культуры.
   Примечание: Размеры трубок могут варьироваться в зависимости от используемого ротора. Важно помнить, что пробирки должны иметь одинаковый объем, чтобы обеспечить правильную балансировку ротора перед центрифугированием. Вполне вероятно, что весь объем среды не поместится в центрифуге за один раз. Оставшаяся среда будет центрифугирована позже (шаг 4.5) с использованием тех же пробирок.
2. Приготовьте пластиковый стакан объемом 2 л с мешалкой в ведре, окруженном льдом. Выложите на тарелку для перемешивания.
3. Прикрепите фильтрующую крышку объемом 500 мл к бутылке объемом 1 л. Прикрепите бутылочный фильтрующий блок к домашнему пылесосу с помощью соответствующей трубки.
4. Залейте надосадочную жидкость из шага 4.1 (которая все еще содержит mAb, производимый гибридомными клетками) в верхнюю часть фильтра.
5. Продолжайте использовать тот же набор трубок для удаления остатков грануляторов из среды (гранула будет продолжать накапливаться). Подождите, пока вакуум не заполнится и не будет готова к заливке еще одна партия надосадочной жидкости. Не допускайте пересыхания фильтра, иначе фильтрация станет очень медленной.
6. Когда бутылка объемом 1 л будет близка к заполнению, снимите крышку фильтра и налейте надосадочную жидкость в стакан объемом 2 л, подготовленный на шаге 4.2. Снова прикрепите верхнюю часть фильтра. Следите за объемом.
7. Повторяйте этапы центрифугирования и фильтрации до тех пор, пока не будет обработан весь фильтрующий материал.
8. Отмерьте 295 г сульфата аммония на 1 л собранной отфильтрованной надосадочной жидкости. Помешивая, медленно добавляйте сульфат аммония в надосадочную жидкость в течение следующих нескольких часов (~25 г каждые 15 минут), чтобы предотвратить локализованную высокую концентрацию соли сульфата аммония, которая может привести к выпадению нежелательных белков в осадок.
9. После того, как весь сульфат аммония будет добавлен, накройте стакан фольгой и переместите пластину для перемешивания до 4°C (например, в холодильник или холодильную камеру). Перемешайте на ночь. Для растворения соли требуется постоянное перемешивание раствора, однако длительное перемешивание может привести к денатурации белков в растворе на границе поверхности и воздуха.
10. Промойте трубки с помощью ротора с фиксированным углом.

5. Очищение антител - день 2

1. Налейте надосадочную жидкость, содержащую сульфат аммония, из стакана объемом 2л в трубки для ротора с фиксированным углом. Вращайте центрифугу с ротором с фиксированным углом вращения со скоростью 6500 об/мин в течение 20 минут без тормоза.
2. Вакуумируйте надосадочную жидкость, стараясь не всасывать гранулу, так как она будет мягкой. Продолжайте использовать тот же набор пробирок для сбора гранул из надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония.
3. После последней аспирации повторно суспендируйте каждую гранулу (которая содержит антитела) в ~1 мл PBS.
4. Сульфат аммония удаляют из осажденного раствора mAb методом диализа против больших объемов PBS. Для этого сначала отрежьте примерно 1 дюйм диализной трубки (например, отсечную трубку для целлюлозного диализа Membra-Cel MD25-14 MWCO 12 000-14 000 Dalton) для каждого мл раствора mAb. Намочите трубку с помощью dH₂O. Завяжите узел на одном конце трубки и заполните dH₂O, чтобы убедиться, что узел не протекает. Опорожните dH₂O от трубки.
5. Внесите в трубку пипетку раствор PBS/антитела. Промойте пробирки еще 0,25 мл PBS и переложите на трубку.
6. Закрепите верхнюю часть трубки как можно ближе к раствору с помощью оранжевого диализного зажима.
7. Прикрепите верхнюю часть трубки к внешней стороне стакана объемом 4 л. Позвольте заполненной части трубки свиснуть в стакане. Наполните стакан PBS и добавьте полосу для перемешивания.
8. Перемешайте на ночь ~8 часов при 4°C.
9. Замените PBS в стакане на свежий PBS и перемешивайте в течение ~8 часов еще два раза.
10. Перенесите антитело из трубки в конические пробирки объемом 15 или 50 мл. Центрифугируйте в течение 5 минут при 1200 об/мин, чтобы удалить образовавшийся осадок. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку.
11. Разведите аликвоту антитела 1:20 с PBS (5 мкл антитела + 95 мкл PBS). Количественно измерьте концентрацию антител с помощью спектрофотометра (бланк с PBS) при длине волны 280 нм. Используйте коэффициент экстинкции (ε) равный 1,43. Концентрация рассчитывается как
    
    
12. Разложите антитело по флаконам с завинчивающейся крышкой и храните при -80°C.