What is a fluorophore and how does it work in immunofluorescence microscopy?

A fluorophore is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength through excitation, then immediately releases the energy at a different wavelength through emission. Fluorophores are conjugated to antibodies and introduced into tissue samples through immunostaining. When the antibody binds to the target protein, the fluorophore labels it, allowing visualization under a fluorescence microscope.

How does a fluorescence microscope separate excitation and emission light?

A fluorescence microscope uses specialized optical components to separate wavelengths. Excitation light passes through an excitation filter, then reflects off a dichroic mirror toward the objective lens, which focuses it on the sample. Emitted light from excited fluorophores returns through the objective and dichroic mirror, which allows only emission wavelengths to pass. An emission filter removes unwanted wavelengths before the image reaches the eyepiece or camera.

Why is rehydration necessary before immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue?

Tissue sections are dehydrated during the paraffin embedding process. Before staining, sections must be rehydrated through graded ethanol incubations and PBS washes to restore tissue hydration and prepare it for antibody binding. This step ensures proper antibody penetration and reduces non-specific binding during the immunostaining procedure.

What is the purpose of a blocking buffer in immunofluorescence staining?

Blocking buffer reduces non-specific binding of antibodies to the tissue section. The tissue is incubated with blocking buffer for one hour at room temperature before primary antibody application. This step prevents the antibody from binding to sites other than the target protein, improving staining specificity and reducing background fluorescence in the final image.

Why is a control slide included in immunofluorescence staining procedures?

A control slide is treated identically to experimental slides but receives only blocking buffer instead of primary antibody. This control helps identify any non-specific binding of the secondary antibody to the tissue. By comparing the control to experimental slides, researchers can distinguish true target protein localization from background fluorescence caused by non-specific antibody interactions.

How can multiple proteins be visualized simultaneously in a single tissue sample?

Multiple different fluorophores with distinct excitation and emission wavelengths can be used to label different proteins within the same sample. DNA binding fluorescent dyes like DAPI label nuclei as a reference point. By using multiple fluorophores, researchers can compare the localization of different proteins and analyze their spatial relationships within the tissue section.

What information can immunofluorescence imaging provide about tissue samples?

Immunofluorescence imaging provides data on protein intensity and localization within tissue sections, revealing cell type heterogeneity, activation of signaling pathways, and biomarker expression. Researchers can quantify the frequency of specific cell populations by counting positively stained cells and comparing them to the total cell population, calculated using a simple ratio equation.

Иммунофлуоресцентная микроскопия: иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей, залитых парафином

0 views09:56 min

1. Настройка

Типичный протокол окрашивания включает в себя следующие этапы:
1. Повторная гидратация срезов тканей на предметных стеклах с использованием ряда сортированных этанолов.
2. Инкубация участков ткани с блокирующим буфером, который поможет блокировать неспецифическое связывание антитела с тканью и снизить фоновую флуоресценцию.
3. Удаление блокирующего буфера и инкубация участка в первичном антителе, в это время антитело связывается со своей пептидной мишенью.
4. Удаление первичного антитела и обширная промывка участков в промывном буфере.
5. Инкубация срезов со вторичным антителом для обеспечения связывания с первичным антителом, если первичное антитело не помечено непосредственно флуорофором и требуется вторичное антитело.
6. Смывание вторичного антитела с предметных стекол.
7. Установка предметных стекол в монтажные носители и их высыхание перед визуализацией на флуоресцентном микроскопе.
Необходимы следующие предметы: держатели предметных колец (стеклянные или пластиковые), банки, пипетки, пап-ручка, влажная камера, защитные колпачки и монтажный носитель с DAPI.
Ксилол используется для регидратации предметных стекол. Ксилол опасен и должен использоваться в вытяжном шкафу вместе с соответствующими СИЗ, включая перчатки и лабораторный халат.
Рецепты буферов, растворов и реагентов
1. Сортированные этанолы
  Этанол - 160 мл 200 proof EtOH и 40 мл ddH₂O
  Этанол - 140 мл 200 proof EtOH и 60 мл ddH₂O
2. Решение для извлечения антигена
  10 мМ цитрат натрия, pH 6,0
3. Блокирующий буфер
  100 мкл сыворотки от животного-хозяина, из которого было получено вторичное антитело
  900 мкл 1X PBS
  Примечание: Это объем для 10 разделов; При необходимости отрегулируйте объем примерно до 100 мкл буфера на секцию.
4. Буфер промывки (1X PBS)

2. Протокол

Регидратация с ксилолами и этанолами
1. Поместите предметные стекла в держатель для слайдов, а затем погрузите их в раствор 100% изомеров ксилола, убедившись, что слайды полностью покрыты раствором.
2. Инкубируйте предметные стекла в 100% изомерах ксилола в течение 3 минут. Повторите два раза, всего 3 отдельных инкубации. Обязательно протрите решетку для слайдов бумажным полотенцем перед переносом на новый раствор, чтобы свести к минимуму загрязнение.
  Примечание: Рекомендуется проводить эти инкубации в трех отдельных контейнерах.
3. Инкубируйте предметные стекла в 100% EtOH в течение 2 минут. Повторите два раза, всего 3 отдельных инкубации.
  Примечание: Рекомендуется проводить эти инкубации в трех отдельных контейнерах.
4. Инкубируйте предметные стекла с 95% EtOH в течение 2 мин.
5. Инкубируйте предметные стекла с 80% этиленоксидом в течение 2 мин.
6. Инкубируйте предметные стекла с 70% EtOH в течение 2 мин.
7. Инкубируйте предметные стекла в 1X PBS в течение 5 мин.
(Дополнительный) Извлечение антигена для демаскирования эпитопов, распознаваемых первичным антителом
Примечание 1: Эта процедура в значительной степени зависит от используемого антитела, и рекомендуется выполнять первоначальные процедуры оптимизации для определения потребности в извлечении антигена.
Примечание 2: Эта процедура не выполнялась с окрашиванием F4/80, показанным ниже. Потребность в выделении антигена должна быть оптимизирована с каждым новым антителом.
1. Поместите слайды в держатель слайдов из термостойкого пластика или стекла и убедитесь, что стеллаж заполнен слайдами, чтобы обеспечить равномерное распределение тепла. Пустые предметные стекла можно использовать, если образцов меньше, чем слотов в штативе.
2. Поместите штатив в 1000 мл демаскирующего раствора антигена, в стакан 2 л - 10 мл антигена демаскирующего запаса на 990 мл воды.
3. Готовьте в микроволновой печи на высокой мощности в общей сложности 20 минут, следите за тем, чтобы горки оставались покрытыми водой.
4. Остудите горки в течение 20 минут в стакане.
5. Вымойте решетку для слайдов в держателях для слайдов, содержащих ddH₂O, в течение 5 минут каждая. Повторите два раза, в общей сложности 3 отдельных инкубации с использованием свежего ddH₂O каждый раз. Слайды можно стирать в одном и том же держателе слайдов во время каждой стирки.
6. Инкубируйте предметные стекла в 1X PBS в течение 5 мин.
Обведите срезы пап-ручкой. Это позволит использовать минимальный объем буферов, необходимый для покрытия участков тканей. Не допускайте пересыхания участков ткани.
Добавьте буфер блокировки в каждую секцию. Количество буфера, необходимого для покрытия секции, будет варьироваться в зависимости от размера секции, но может варьироваться от 25 до 500 мкл. Буфер должен быть использован достаточно для формирования валика, который покрывает всю поверхность секции, включая края.
Примечание: Выбор блокирующего буфера может варьироваться в зависимости от используемого антитела. Например, 10% сыворотка от животного-хозяина, у которого было выращено вторичное антитело, может быть использована для снижения неспецифического связывания вторичного антитела (например, можно использовать нормальную сыворотку крови козы, если вторичное антитело было выращено у козы). Оптимизация блокирующего буфера должна быть выполнена для каждого первичного антитела. Для окрашивания участков опухоли молочной железы F4/80 использовали 0,1 мл 10% нормальной козьей сыворотки в PBS.
Инкубировать секции в блокирующем буфере в увлажненной камере в течение 1 часа при комнатной температуре или при 4°C до 24 часов. Увлажненная камера предотвращает высыхание секций.
Снимите блокирующий буфер, скачав воду с предметного стекла. В качестве альтернативы блокирующий буфер можно удалить с помощью пипетки, но будьте осторожны, чтобы не прикасаться к этому участку с наконечником пипетки.
Разведите первичное антитело в блокирующем буфере.
Примечание: Правильное разведение должно быть определено для каждого антитела и типа образца. Оптимизация включает в себя выполнение серии разведений для определения оптимального окрашивания. Для окрашивания участков опухоли молочной железы F4/80 срезы тканей инкубировали в течение ночи при 4°C в 0,1 мл антитела к F4/80 крысы, разведенного в соотношении 1:100 в 1% нормальной сыворотке коз в PBS.
Добавьте первичное антитело в каждую секцию и инкубируйте во влажной камере до 16 часов (на ночь) при 4°C. Оставьте по крайней мере одну секцию в блокирующем буфере без первичного антитела, которая будет служить контролем, что поможет выявить неспецифическое связывание вторичным антителом.
Слейте первичное антитело или блокирующий буфер со среза и промойте срезы PBS, поместив предметные стекла в штатив для слайдов и поместив в держатель слайдов с 1x PBS. Стирайте 3 раза по 10 минут каждый раз.
Разведите вторичное антитело в соотношении 1:200 в блокирующем буфере. Разведение может быть оптимизировано в зависимости от вторичного антитела.
Добавьте вторичное антитело во все срезы, включая контроль, и инкубируйте в течение 1 часа во увлажненной камере, защищенной от света.
Слейте вторичное антитело со срезов и каждый раз промойте 3 раза в PBS в течение 10 минут.
Добавьте 2-3 капли монтажного материала, содержащего DAPI, на предметные стекла и наденьте на образцы покровное стекло. Если монтажный материал не является быстросохнущим типом носителя, может потребоваться герметизация краев предметного стекла расплавленным парафином или лаком для ногтей, чтобы предотвратить утечку и сохранить образцы в течение длительного времени.
Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи в темноте и сфотографируйте срезы с помощью флуоресцентного микроскопа.

3. Анализ данных и результаты

Окрашенные срезы анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа. Конкретные детали получения и анализа изображений будут зависеть от технических характеристик микроскопа и программного обеспечения, используемого для выполнения анализа. Как правило, изображения могут быть взяты как одноцветные изображения и наложены друг на друга для создания многоцветных изображений. Процент положительных клеток может быть количественно определен путем подсчета количества положительно окрашенных клеток и деления на общее количество DAPI-окрашенных клеток в пределах среза. Для окрашивания участков опухоли молочной железы с помощью F4/80 с помощью программного обеспечения Leica Application Suite версии 3.8 на вкладке «Получение» и в режиме «Наложение изображений» были включены DAPI и RFP. Экспозиция, усиление и гамма были скорректированы (20,0 мс, 1,0x и 1,53 соответственно для DAPI и 944,2 мс, 1,0x и 1,08 соответственно для RFP), хотя они варьируются в зависимости от эксперимента. Кнопка «Получить наложение» использовалась для создания наложенных изображений экспозиций DAPI и RFP.
На рисунке ниже (Рисунок 1) показан пример иммунофлуоресцентного изображения участка опухоли, окрашенного F4/80, который обнаруживает антиген на макрофагах и других миелоидных клетках. Секция была смонтирована с использованием DAPI-содержащей монтажной среды, а ядра показаны синим цветом.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Томас Чаффи¹, Томас С. Гриффит^2,3,4 и Кэтрин Л. Швертфегер^1,3,4
¹ Отделение лабораторной медицины и патологии, Университет Миннесоты, Миннеа…