Иммунофлуоресцентная микроскопия: иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей, залитых парафином

1. Настройка

1. Типичный протокол окрашивания включает в себя следующие этапы:
   1. Повторная гидратация срезов тканей на предметных стеклах с использованием ряда сортированных этанолов.
   2. Инкубация участков ткани с блокирующим буфером, который поможет блокировать неспецифическое связывание антитела с тканью и снизить фоновую флуоресценцию.
   3. Удаление блокирующего буфера и инкубация участка в первичном антителе, в это время антитело связывается со своей пептидной мишенью.
   4. Удаление первичного антитела и обширная промывка участков в промывном буфере.
   5. Инкубация срезов со вторичным антителом для обеспечения связывания с первичным антителом, если первичное антитело не помечено непосредственно флуорофором и требуется вторичное антитело.
   6. Смывание вторичного антитела с предметных стекол.
   7. Установка предметных стекол в монтажные носители и их высыхание перед визуализацией на флуоресцентном микроскопе.
2. Необходимы следующие предметы: держатели предметных колец (стеклянные или пластиковые), банки, пипетки, пап-ручка, влажная камера, защитные колпачки и монтажный носитель с DAPI.
3. Ксилол используется для регидратации предметных стекол. Ксилол опасен и должен использоваться в вытяжном шкафу вместе с соответствующими СИЗ, включая перчатки и лабораторный халат.
4. Рецепты буферов, растворов и реагентов
   1. Сортированные этанолы
      Этанол - 160 мл 200 proof EtOH и 40 мл ddH₂O
      Этанол - 140 мл 200 proof EtOH и 60 мл ddH₂O
   2. Решение для извлечения антигена
      10 мМ цитрат натрия, pH 6,0
   3. Блокирующий буфер
      100 мкл сыворотки от животного-хозяина, из которого было получено вторичное антитело
      900 мкл 1X PBS
      Примечание: Это объем для 10 разделов; При необходимости отрегулируйте объем примерно до 100 мкл буфера на секцию.
   4. Буфер промывки (1X PBS)

2. Протокол

1. Регидратация с ксилолами и этанолами
   1. Поместите предметные стекла в держатель для слайдов, а затем погрузите их в раствор 100% изомеров ксилола, убедившись, что слайды полностью покрыты раствором.
   2. Инкубируйте предметные стекла в 100% изомерах ксилола в течение 3 минут. Повторите два раза, всего 3 отдельных инкубации. Обязательно протрите решетку для слайдов бумажным полотенцем перед переносом на новый раствор, чтобы свести к минимуму загрязнение.
      Примечание: Рекомендуется проводить эти инкубации в трех отдельных контейнерах.
   3. Инкубируйте предметные стекла в 100% EtOH в течение 2 минут. Повторите два раза, всего 3 отдельных инкубации.
      Примечание: Рекомендуется проводить эти инкубации в трех отдельных контейнерах.
   4. Инкубируйте предметные стекла с 95% EtOH в течение 2 мин.
   5. Инкубируйте предметные стекла с 80% этиленоксидом в течение 2 мин.
   6. Инкубируйте предметные стекла с 70% EtOH в течение 2 мин.
   7. Инкубируйте предметные стекла в 1X PBS в течение 5 мин.
2. (Дополнительный) Извлечение антигена для демаскирования эпитопов, распознаваемых первичным антителом
   Примечание 1: Эта процедура в значительной степени зависит от используемого антитела, и рекомендуется выполнять первоначальные процедуры оптимизации для определения потребности в извлечении антигена.
   Примечание 2: Эта процедура не выполнялась с окрашиванием F4/80, показанным ниже. Потребность в выделении антигена должна быть оптимизирована с каждым новым антителом.
   1. Поместите слайды в держатель слайдов из термостойкого пластика или стекла и убедитесь, что стеллаж заполнен слайдами, чтобы обеспечить равномерное распределение тепла. Пустые предметные стекла можно использовать, если образцов меньше, чем слотов в штативе.
   2. Поместите штатив в 1000 мл демаскирующего раствора антигена, в стакан 2 л - 10 мл антигена демаскирующего запаса на 990 мл воды.
   3. Готовьте в микроволновой печи на высокой мощности в общей сложности 20 минут, следите за тем, чтобы горки оставались покрытыми водой.
   4. Остудите горки в течение 20 минут в стакане.
   5. Вымойте решетку для слайдов в держателях для слайдов, содержащих ddH₂O, в течение 5 минут каждая. Повторите два раза, в общей сложности 3 отдельных инкубации с использованием свежего ddH₂O каждый раз. Слайды можно стирать в одном и том же держателе слайдов во время каждой стирки.
   6. Инкубируйте предметные стекла в 1X PBS в течение 5 мин.
3. Обведите срезы пап-ручкой. Это позволит использовать минимальный объем буферов, необходимый для покрытия участков тканей. Не допускайте пересыхания участков ткани.
4. Добавьте буфер блокировки в каждую секцию. Количество буфера, необходимого для покрытия секции, будет варьироваться в зависимости от размера секции, но может варьироваться от 25 до 500 мкл. Буфер должен быть использован достаточно для формирования валика, который покрывает всю поверхность секции, включая края.
   Примечание: Выбор блокирующего буфера может варьироваться в зависимости от используемого антитела. Например, 10% сыворотка от животного-хозяина, у которого было выращено вторичное антитело, может быть использована для снижения неспецифического связывания вторичного антитела (например, можно использовать нормальную сыворотку крови козы, если вторичное антитело было выращено у козы). Оптимизация блокирующего буфера должна быть выполнена для каждого первичного антитела. Для окрашивания участков опухоли молочной железы F4/80 использовали 0,1 мл 10% нормальной козьей сыворотки в PBS.
5. Инкубировать секции в блокирующем буфере в увлажненной камере в течение 1 часа при комнатной температуре или при 4°C до 24 часов. Увлажненная камера предотвращает высыхание секций.
6. Снимите блокирующий буфер, скачав воду с предметного стекла. В качестве альтернативы блокирующий буфер можно удалить с помощью пипетки, но будьте осторожны, чтобы не прикасаться к этому участку с наконечником пипетки.
7. Разведите первичное антитело в блокирующем буфере.
   Примечание: Правильное разведение должно быть определено для каждого антитела и типа образца. Оптимизация включает в себя выполнение серии разведений для определения оптимального окрашивания. Для окрашивания участков опухоли молочной железы F4/80 срезы тканей инкубировали в течение ночи при 4°C в 0,1 мл антитела к F4/80 крысы, разведенного в соотношении 1:100 в 1% нормальной сыворотке коз в PBS.
8. Добавьте первичное антитело в каждую секцию и инкубируйте во влажной камере до 16 часов (на ночь) при 4°C. Оставьте по крайней мере одну секцию в блокирующем буфере без первичного антитела, которая будет служить контролем, что поможет выявить неспецифическое связывание вторичным антителом.
9. Слейте первичное антитело или блокирующий буфер со среза и промойте срезы PBS, поместив предметные стекла в штатив для слайдов и поместив в держатель слайдов с 1x PBS. Стирайте 3 раза по 10 минут каждый раз.
10. Разведите вторичное антитело в соотношении 1:200 в блокирующем буфере. Разведение может быть оптимизировано в зависимости от вторичного антитела.
11. Добавьте вторичное антитело во все срезы, включая контроль, и инкубируйте в течение 1 часа во увлажненной камере, защищенной от света.
12. Слейте вторичное антитело со срезов и каждый раз промойте 3 раза в PBS в течение 10 минут.
13. Добавьте 2-3 капли монтажного материала, содержащего DAPI, на предметные стекла и наденьте на образцы покровное стекло. Если монтажный материал не является быстросохнущим типом носителя, может потребоваться герметизация краев предметного стекла расплавленным парафином или лаком для ногтей, чтобы предотвратить утечку и сохранить образцы в течение длительного времени.
14. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи в темноте и сфотографируйте срезы с помощью флуоресцентного микроскопа.

3. Анализ данных и результаты

1. Окрашенные срезы анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа. Конкретные детали получения и анализа изображений будут зависеть от технических характеристик микроскопа и программного обеспечения, используемого для выполнения анализа. Как правило, изображения могут быть взяты как одноцветные изображения и наложены друг на друга для создания многоцветных изображений. Процент положительных клеток может быть количественно определен путем подсчета количества положительно окрашенных клеток и деления на общее количество DAPI-окрашенных клеток в пределах среза. Для окрашивания участков опухоли молочной железы с помощью F4/80 с помощью программного обеспечения Leica Application Suite версии 3.8 на вкладке «Получение» и в режиме «Наложение изображений» были включены DAPI и RFP. Экспозиция, усиление и гамма были скорректированы (20,0 мс, 1,0x и 1,53 соответственно для DAPI и 944,2 мс, 1,0x и 1,08 соответственно для RFP), хотя они варьируются в зависимости от эксперимента. Кнопка «Получить наложение» использовалась для создания наложенных изображений экспозиций DAPI и RFP.
2. На рисунке ниже (Рисунок 1) показан пример иммунофлуоресцентного изображения участка опухоли, окрашенного F4/80, который обнаруживает антиген на макрофагах и других миелоидных клетках. Секция была смонтирована с использованием DAPI-содержащей монтажной среды, а ядра показаны синим цветом.