Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Источник: Доминик Р. Боллино1, Эрик А. Легензов2, Тоня Дж. Уэбб1
1 Кафедра микробиологии и иммунологии, Медицинский факультет Университета Мэриленда и Комплексный онкологический центр Марлен и Стюарт Гринбаум, Балтимор, Мэриленд 21201
2 Центр биомедицинской инженерии и технологий, Медицинский факультет Университета Мэриленда, Балтимор, Мэриленд 21201
Конфокальная флуоресцентная микроскопия — это метод визуализации, который позволяет увеличить оптическое разрешение по сравнению с обычной «широкопольной» эпифлуоресцентной микроскопией. Конфокальные микроскопы способны достичь улучшенного оптического разрешения x-y за счет «лазерного сканирования» - обычно набора зеркал с контролируемым напряжением (гальванометр или «гальво» зеркала), которые направляют лазерное излучение на каждый пиксель образца за раз. Что еще более важно, конфокальные микроскопы достигают превосходного z-осевого разрешения за счет использования точечного отверстия для удаления расфокусированного света, исходящего из мест, которые не находятся в сканируемой z-плоскости, что позволяет детектору собирать данные из заданной z-плоскости. Благодаря высокому z-разрешению, достижимому в конфокальной микроскопии, можно собирать изображения из серии z-плоскостей (также называемых z-стеком) и создавать 3D-изображение с помощью программного обеспечения.
Прежде чем обсуждать механизм работы конфокального микроскопа, важно рассмотреть, как образец взаимодействует со светом. Свет состоит из фотонов, пакетов электромагнитной энергии. Фотон, попадающий в биологический образец, может взаимодействовать с молекулами, составляющими образец, одним из четырех способов: 1) фотон не взаимодействует и проходит через образец; 2) фотон отражается/рассеивается; 3) фотон поглощается молекулой, а поглощенная энергия высвобождается в виде тепла в результате процессов, известных как безызлучательный распад; и 4) фотон поглощается, а затем энергия быстро переизлучается в виде вторичного фотона с помощью процесса, известного как флуоресценция. Молекула, структура которой допускает флуоресцентное излучение, называется флуорофором. Большинство биологических образцов содержат ничтожно малые эндогенные флуорофоры; Поэтому для выделения интересующих особенностей в образце необходимо использовать экзогенные флуорофоры. Во время флуоресцентной микроскопии образец освещается светом с длиной волны, соответствующей для поглощения флуорофором. После поглощения фотона флуорофор называется «возбужденным», а процесс поглощения называется «возбуждением». Когда флуорофор отдает энергию в форме фотона, этот процесс известен как «излучение», а испускаемый фотон называется флуоресценцией.
Световой луч, используемый для возбуждения флуорофора, фокусируется линзой объектива микроскопа и сходится в «фокусной точке», где он максимально сфокусирован. За пределами фокальной точки свет снова расходится. Входящий и выходящий лучи можно визуализировать в виде пары конусов, соприкасающихся в фокусной точке (см. рисунок 1, левая панель). Явление дифракции накладывает ограничение на то, насколько точно может быть сфокусирован луч света - луч фактически фокусируется в пятне конечного размера. Два фактора определяют размер фокального пятна: 1) длина волны света и 2) светособирающая способность объектива, которая характеризуется его числовой апертурой (NA). Фокальная "точка" простирается не только в плоскости x-y, но и в направлении z, и в действительности является фокусным объемом. Размеры этого фокусного объема определяют максимальное разрешение, достижимое с помощью оптической визуализации. Несмотря на то, что число фотонов в фокусном объеме является наибольшим, конические световые пути выше и ниже фокуса также содержат меньшую плотность фотонов. Таким образом, любой флуорофор на световом пути может быть возбужден. В обычной (широкоугольной) эпифлуоресцентной микроскопии излучение флуорофоров выше и ниже фокальной плоскости вносит вклад в флуоресценцию вне фокуса («туманный фон»), что снижает разрешение и контрастность изображения, как показано на рисунке 1, где красный куб представляет излучение флуорофоров над фокальной плоскостью (красная звезда), что приводит к флуоресценции вне фокуса (вверху справа). Эта проблема решается при конфокальной микроскопии благодаря использованию точечного отверстия. (Рисунок 2, внизу справа). Как показано на рисунке 3, точечное отверстие позволяет излучению, исходящему из фокального места, достигать детектора (слева), блокируя флуоресценцию вне фокуса (справа) от доступа к детектору, тем самым улучшая как разрешение, так и контрастность.
Рисунок 1. Оптическое разрешение эпифлуоресценции в сравнении с конфокальной микроскопией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Световой луч, используемый для возбуждения флуорофора, фокусируется линзой объектива микроскопа и сходится в фокусном объеме, а затем расходится (слева). Красная звезда представляет фокальную плоскость образца, который визуализируется, в то время как красный квадрат представляет излучение флуорофора над фокальной плоскостью. При съемке этого образца с помощью эпифлуоресцентного микроскопа излучение из расфокусированного красного квадрата будет видно и будет способствовать образованию «туманного фона» (вверху справа). Конфокальные микроскопы имеют отверстие, которое предотвращает обнаружение света, излучаемого за пределами фокальной плоскости, устраняя «туманный фон» (внизу справа).
Рисунок 2. Точечный эффект в конфокальной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Хотя наибольшая интенсивность возбуждающего света находится в фокусной точке объектива (слева, красный овал), другие части образца, не находящиеся в фокусной точке (справа, красная звезда), будут получать свет и флуоресцировать. Чтобы свет, излучаемый из этих расфокусированных областей, не достигал детектора, перед детектором имеется экран с отверстием-обскуром. Только сфокусированный свет (слева), излучаемый из фокальной плоскости, может пройти через отверстие и достичь детектора. Расфокусированный свет (справа) блокируется отверстием и не доходит до детектора.
Рисунок 3. Основные составные части конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Для простоты механистическое описание конфокального микроскопа будет ограничено описанием Nikon Eclipse Ti A1R. Несмотря на незначительные технические различия между различными конфокальными микроскопами, A1R хорошо служит хорошей моделью для описания функции конфокального микроскопа. Возбуждающий световой луч, производимый массивом диодных лазеров, отражается первичным дихроичным зеркалом в объектив, который фокусирует свет на изображаемом образце. Первичное дихроичное зеркало избирательно отражает возбуждающий свет, пропуская свет на других длинах волн. Затем свет сталкивается со сканирующими зеркалами, которые направляют луч света через образец x-y, освещая по одному (x, y) пикселю за раз. Флуоресценция, испускаемая флуорофорами на освещенном пикселе, собирается линзой объектива и проходит через первичное дихроичное зеркало, достигая массива фотоумножителей (ФЭУ). Вторичные дихроичные зеркала направляют свет излучения на соответствующую ФЭУ. Возбуждающий свет, рассеянный образцом обратно в объектив, отражается первичным дихроичным зеркалом обратно к образцу и, таким образом, не попадает на траекторию обнаруживающего света и не достигает ФЭУ (см. Рисунок 3). Это позволяет количественно оценить относительно слабую флуоресценцию без загрязнения светом, рассеянным от возбуждающего светового пучка, который обычно на порядки интенсивнее флуоресценции. Поскольку отверстие блокирует свет из-за пределов фокусного объема, свет, поступающий на детектор, поступает из узкой, выбранной плоскости z. Следовательно, изображения могут быть собраны из ряда смежных z-плоскостей; Эту серию изображений часто называют «z-стеком». С помощью соответствующего программного обеспечения можно обработать z-стек для создания 3D-изображения образца. Особым преимуществом конфокальной микроскопии является возможность различать субклеточную локализацию окрашивания. Например, дифференциация между мембранным окрашиванием и внутриклеточным окрашиванием, что очень сложно при традиционной эпифлуоресцентной микроскопии (1, 2, 3).
Подготовка образцов является важным аспектом конфокальной визуализации. Сильной стороной методов оптической микроскопии является гибкость визуализации живых или неподвижных клеток. При попытке создания 3D-изображений, из-за количества изображений, которые должны быть получены для z-стека, сложности поддержания здоровья клеток и движения живых клеток и их органелл, типичным является использование фиксированных клеток. Процедура фиксации и окрашивания клеток для конфокальной флуоресценции аналогична той, которая традиционно используется при иммунофлуоресценции. После культивирования в предметных стеклах камеры или на покровных стеклах клетки фиксируют с помощью параформальдегида для сохранения клеточной морфологии. Связывание неспецифических антител блокируется с помощью бычьего сывороточного альбумина, молока или нормальной сыворотки. Чтобы сохранить специфичность вторичных антител, используемый раствор не должен происходить от того же вида, у которого были получены первичные антитела. Клетки инкубируются с первичными антителами, которые связываются с интересующим антигеном. При мечении нескольких клеточных мишеней каждое из первичных антител должно быть получено из разных видов. Антитела, маркирующие антиген, затем связываются с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами. Флуорофор-конъюгированные вторичные антитела следует выбирать таким образом, чтобы они были совместимы с длинами волн лазерного возбуждения, имеющимися в конфокальном микроскопе. При визуализации множественных антигенов спектры возбуждения/излучения флуорофоров должны различаться настолько, чтобы их сигналы можно было различить с помощью микроскопического анализа. Затем окрашенный образец устанавливается на предметное стекло для визуализации. Монтажный материал используется для предотвращения фотообесцвечивания и обезвоживания образца. При желании можно использовать монтажный материал, содержащий ядерное противопятно (например, DAPI или Hoechst) (4).
В следующем протоколе мышиные фибробласты, трансфицированные для экспрессии CD1d (LCD1), окрашивали антителами, распознающими CD1d и CD107a (LAMP-1). CD1d является основным рецептором комплекса гистосовместимости 1 (MHC 1), присутствующим на поверхности антигенпрезентирующих клеток, которые представляют липидные антигены. LAMP-1 (лизосомально-ассоциированный мембранный белок-1) — трансмембранный белок, присутствующий преимущественно в лизосомальных мембранах. Для правильной презентации антигена CD1d транспортируется через лизосомальный компартмент с низким pH, поэтому LAMP-1 используется в качестве маркера лизосомального компартмента для этого протокола. Зондируя клетки LCD1 с анти-CD1d и анти-LAMP-1, которые были получены у разных видов, можно использовать вторичные антитела с уникальными флуорофорами для определения локализации каждого белка в клетке и наличия CD1d в положительных лизосомальных компартментах LAMP-1.
1. Материалы
Буферы
Оборудование
Материалы и реактивы
Реагенты для анализа
2. Протокол
Подготовка к окрашиванию антителами
Засев ячеек
Фиксация
Пермеабилизация
Блокировка
Инкубация первичных антител
Примечание: Если вы исследуете более одной мишени, убедитесь, что первичные антитела имеют разные изотипы. Рекомендуемые концентрации антител варьируются у разных производителей и должны быть титрованы перед использованием.
Инкубация вторичных антител
Примечание: Рекомендуемые концентрации антител варьируются у разных производителей и должны быть титрованы перед использованием. При зондировании более чем одной мишени вторичные антитела должны быть конъюгированы с различными флуорофорами с уникальными спектрами возбуждения/излучения. Также следует учитывать возбуждение/излучение ядерного противокрасителя (т.е. DAPI) при выборе флуорофоров. На выбор флуорофора может влиять конфигурация лазера используемого конфокального микроскопа. Конфигурация лазера машины будет определять, какие флуорофоры подходят для эксперимента.
3. Монтажные покровные стекла
4. Конфокальная визуализация
Изображение образцов на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Для данных, показанных на рисунке 2, Nikon Eclipse Ti A1R использовался с программным обеспечением NIS Elements Advanced Research. В следующем разделе подробно описана процедура съемки изображений с помощью вышеупомянутого программного обеспечения.
Конфокальная флуоресцентная микроскопия представляет собой специализированный метод визуализации для локализации белка или антигена, представляющего интерес, в образце клетки или ткани путем мечения антигена флуоресцентным красителем, конъюгированным с антителами, и обнаружения флуоресцентного сигнала. Он обеспечивает более высокое пространственное разрешение, чем широкопольная флуоресцентная микроскопия, с помощью двух точечных отверстий, расположенных в фокальных плоскостях линзы объектива, что дает ему название конфокальный. Это позволяет пользователям визуализировать окрашивание на субклеточном уровне, например, дифференцировать окрашивание поверхностной мембраной от внутриклеточного окрашивания.
Конфокальный микроскоп работает по тому же принципу, что и классический флуоресцентный микроскоп. Луч от источника света, обычно лазерного для конфокальных, отражается дихроичным зеркалом и фокусируется линзой объектива на образце. Этот свет заставляет флуорофоры излучать другую длину волны, которая проходит обратно через линзу объектива и дихроичное зеркало к камере или окуляру.
Повышенное разрешение конфокального микроскопа в основном связано с наличием двух точечных отверстий, которые представляют собой очень маленькие отверстия для прохождения света на возбуждающем и излучающем световых путях. Точечные отверстия стратегически расположены в фокальной плоскости линзы объектива. Теперь давайте перейдем к схеме расположения микроскопа сбоку, чтобы рассмотреть траекторию света. Пройдя через точечное отверстие для возбуждения, луч возбуждающего света имеет эффект исходящего из фокальной точки, что позволяет линзе объектива затем сфокусировать свет в точке на образце. Эмиссионный луч из этой фокальной точки сходится в эмиссиионном точечном отверстии, что позволяет ему проходить через него. Теперь во время возбуждения флуорофоры в пределах светового пути, выше и ниже фокальной точки, также слегка возбуждаются. В то время как излучающий свет, исходящий от фокальной точки, проходит через точечное отверстие, излучение из нефокусных точек сходится до или после точечного отверстия и, следовательно, блокируется, что приводит к снижению фоновой флуоресценции.
Цикл возбуждения-излучения-детектирования должен быть повторен для каждой точки визуализации в интересующей области, что может быть выполнено несколькими различными способами. Например, в лазерном сканирующем конфокальном используется гальванометрическое сканирующее зеркало, которое отклоняет возбуждающий свет под разными углами. Следовательно, световой луч проходит через образец в плоскости XY. Вращающийся диск конфокального использует диск с массивом точечных отверстий, который вращается для смещения расположения точечных отверстий. Это позволяет пользователям каждый раз освещать несколько небольших точек изображения в образце, постепенно покрывая всю область по мере вращения диска. В результате точечных отверстий изображение XY на детекторе представляет собой узкую Z-плоскость. Таким образом, изображения могут быть собраны из серии последовательных Z-плоскостей, часто называемых Z-стеком. На основе этих изображений соответствующее программное обеспечение может сгенерировать 3D-изображение сигнальной картины флуоресценции в образце.
В этом протоколе вы будете наблюдать иммуноокрашивание фибробластов мышей с последующей визуализацией на конфокальном микроскопе для дифференциальной визуализации белка клеточной поверхности и лизосомального белка.
Для начала, используя стерильные методы, повторно суспендируйте интересующие клетки в 500 микролитрах питательной среды на лунку, а затем засейте их в лунки четырехлуночной камеры. Здесь мы используем мышиные фибробласты, которые были трансфицированы для экспрессии антигенпрезентирующей молекулы CD1d. Чтобы клетки прилипли к стеклу, поместите предметное стекло камеры в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение ночи. Утром отсасывайте среду из каждой лунки, а затем один раз промойте клетки 500 микролитрами PBS в течение нескольких секунд.
Чтобы закрепить клетки, добавьте в каждую лунку по 500 микролитров 1% раствора параформальдегида, и выдержите 15 минут при комнатной температуре. После инкубации соберите параформальдегид в соответствующий контейнер для опасных жидких отходов, а затем удалите остатки фиксатора, промыв клетки три раза PBS в течение нескольких секунд.
Чтобы обеспечить проникновение антител в клетки, добавьте в каждую лунку по 500 микролитров пермеабилизационного буфера и инкубируйте на стенде в течение 15 минут при комнатной температуре. После пермеабилизации кратковременно промойте клетки три раза 500 микролитрами PBS. Затем добавьте 500 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител.
Приготовьте первичные антитела, анти-CD1d и анти-LAMP-1, в соответствующих рабочих концентрациях. Затем отсадите буфер из лунок и покройте клетки в каждой лунке 500 микролитрами разбавленного раствора первичного антитела, а затем инкубируйте предметное стекло на плоской поверхности в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующее утро разведите вторичные антитела, в данном случае антитела против мыши и крысы с четкими флуоресцентными метками, в блокирующем буфере до соответствующих рабочих концентраций. Далее отсадите из лунок первичный раствор антитела, а затем четыре раза промойте клетки 500 микролитрами PBS. Затем добавьте по 500 микролитров разведенного раствора вторичного антитела в каждую лунку, и выдерживайте при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. После инкубации аспирируйте раствор вторичного антитела и четыре раза промойте лунки 500 микролитрами PBS, чтобы удалить любые несвязанные вторичные антитела.
Чтобы смонтировать образцы после окончательной промывки, осторожно отсоедините и снимите камеры с затвора. Чтобы удалить остатки PBS, держите предметное стекло под углом над деликатной протиркой и удалите жидкость с краев, не касаясь ячеек. После удаления избытка PBS добавьте по одной капле защитной от выцветания монтажной среды, содержащей ядерное окрашивание DAPI, на каждый участок элементов. Затем возьмите покровное стекло размером 20 на 60 миллиметров и, используя только кончики пальцев, начните медленно опускать покровное стекло по обоим краям, стараясь избежать образования пузырьков над ячейками. Сотрите с предметных стекол лишний монтажный материал с помощью деликатной рабочей салфетки и храните слайды в темноте при комнатной температуре до недели.
Чтобы начать визуализацию клеток, сначала нажмите на значок программного обеспечения NIS на рабочем столе. Оказавшись в окне управления, нажмите на вкладку TiPad вверху, и выберите желаемый объект для изображения. Затем загрузите слайд с ячейками в рабочую область и расположите его по центру объектива. Затем на вкладке A1plus Compact GUI рядом с вкладкой TiPad настройте лазеры, подходящие для используемых флуорофоров. Нажмите на символ шестеренки, чтобы открыть меню настроек красителя и спектра. Как только откроется меню настроек красителя и спектра, выберите необходимые каналы и установите лазер для каждого канала. Затем выберите соответствующие выбросы в выпадающем меню под первым дихроичным зеркалом. Затем в окне A1plus Compact GUI нажмите на Ch.Series, чтобы настроить серию линейных каналов, которая определяет, будут ли используемые лазеры воздействовать на образец одновременно или последовательно.
После этого начните сканирование, нажав на значок со стрелкой вверху. На этом этапе, во время получения изображения в реальном времени, в окне A1plus Compact GUI нажмите на скользящую шкалу и измените размер отверстия, чтобы ограничить свет вне фокуса. Затем отрегулируйте настройки высокого напряжения и смещения для каждого лазера до соответствующих уровней с помощью скользящих шкал, чтобы обеспечить обнаружение конкретного окрашивания и ограничить любое потенциальное фоновое окрашивание. Если имеется образец положительного окрашивания, начните с визуализации этого образца для каждого канала, чтобы убедиться, что настройки лазера обеспечивают оптимальное соотношение сигнал/шум. После установки оптимальных значений высоковольтного напряжения и смещения для каждого лазера перейдите на вкладку «Захват нейтрального излучения», а затем выберите значок Z, чтобы настроить параметры для серии z.
Затем, получая изображение образца в реальном времени, сначала установите нижнюю часть, найдя нижнюю часть изображения и нажав кнопку внизу. Затем найдите верхнюю позицию образца и нажмите верхнюю кнопку. Задайте размер шага, введя предпочтительный размер шага в микронах для каждого шага или указав, сколько всего шагов необходимо. Чтобы выбрать желаемый размер/разрешение изображения в пикселях, нажмите на окно Aiplus Compact GUI и под значком размера выберите желаемое разрешение.
Чтобы уменьшить шум изображения, вы можете выбрать выпадающее меню рядом с символом тета, чтобы усреднить выбранное количество изображений. После этого перейдите на вкладку «Запустить сейчас» в меню «Захват ND», чтобы начать визуализацию образца. После того, как создание образа будет завершено, сохраните изображение, нажав на файл, затем сохраните его как, что приведет к экспорту файла изображения с расширением dot-nd2. Наконец, повторите процесс для каждого из остальных образцов.
В этом эксперименте мышиные фибробласты, экспрессирующие поверхностный гликопротеин ген CD1d, были зафиксированы, иммуноокрашены и визуализированы на конфокальном микроскопе. На этом изображении показана отдельная секция стека Z при 40-кратном увеличении, где CD1d окрашен в красный цвет. Образец был покрыт лизосомальным маркером LAMP-1 зеленого цвета. Ядерное окрашивание DAPI использовалось для демонстрации ядер клеток.
На составном изображении, где три разных канала объединены, появление желтого цвета является результатом перекрытия красного и зеленого каналов и указывает на область, где CD1d и LAMP-1 совместно локализованы в лизосомах. Области, в которых присутствует только один цвет, указывают на присутствие CD1d или LAMP-1 без колокализации. На этом изображении показана 3D-визуализация ячеек, построенных на основе изображений, захваченных в z-стеке, и этот метод позволил построить вид сбоку этой группы ячеек. На следующем рисунке показан срез z-стека при 100-кратном увеличении, демонстрирующий паттерны экспрессии этих двух белков более подробно. Розовый контур в правой части изображения отображает поперечное сечение x-координаты, обозначенной розовой линией на изображении, которая представляет вид сбоку на розовой линии. Аналогичным образом, синий контур в нижней части изображения показывает поперечное сечение y-координаты, обозначенной синей линией на изображении, которая представляет вид спереди на синей линии. 3D-рендеринг изображения z-стека позволяет пользователям просматривать изображение в 3D, визуализируя все плоскости x, y и z. Это может быть использовано для изучения совместной локализации различных окрашиваний в разных областях клетки.
Конфокальная флуоресцентная микроскопия представляет собой специализированный метод визуализации для локализации белка или антигена, представляющего интерес, в образце клетки или ткани путем мечения антигена флуоресцентным красителем, конъюгированным с антителами, и обнаружения флуоресцентного сигнала. Он обеспечивает более высокое пространственное разрешение, чем широкопольная флуоресцентная микроскопия, с помощью двух точечных отверстий, расположенных в фокальных плоскостях линзы объектива, что дает ему название конфокальный. Это позволяет пользователям визуализировать окрашивание на субклеточном уровне, например, дифференцировать окрашивание поверхностной мембраной от внутриклеточного окрашивания.
Конфокальный микроскоп работает по тому же принципу, что и классический флуоресцентный микроскоп. Луч от источника света, обычно лазерного для конфокальных, отражается дихроичным зеркалом и фокусируется линзой объектива на образце. Этот свет заставляет флуорофоры излучать другую длину волны, которая проходит обратно через линзу объектива и дихроичное зеркало к камере или окуляру.
Повышенное разрешение конфокального микроскопа в основном связано с наличием двух точечных отверстий, которые представляют собой очень маленькие отверстия для прохождения света на возбуждающем и излучающем световых путях. Точечные отверстия стратегически расположены в фокальной плоскости линзы объектива. Теперь давайте перейдем к схеме расположения микроскопа сбоку, чтобы рассмотреть траекторию света. Пройдя через точечное отверстие для возбуждения, луч возбуждающего света имеет эффект исходящего из фокальной точки, что позволяет линзе объектива затем сфокусировать свет в точке на образце. Эмиссионный луч из этой фокальной точки сходится в эмиссиионном точечном отверстии, что позволяет ему проходить через него. Теперь во время возбуждения флуорофоры в пределах светового пути, выше и ниже фокальной точки, также слегка возбуждаются. В то время как излучающий свет, исходящий от фокальной точки, проходит через точечное отверстие, излучение из нефокусных точек сходится до или после точечного отверстия и, следовательно, блокируется, что приводит к снижению фоновой флуоресценции.
Цикл возбуждения-излучения-детектирования должен быть повторен для каждой точки визуализации в интересующей области, что может быть выполнено несколькими различными способами. Например, в лазерном сканирующем конфокальном используется гальванометрическое сканирующее зеркало, которое отклоняет возбуждающий свет под разными углами. Следовательно, световой луч проходит через образец в плоскости XY. Вращающийся диск конфокального использует диск с массивом точечных отверстий, который вращается для смещения расположения точечных отверстий. Это позволяет пользователям каждый раз освещать несколько небольших точек изображения в образце, постепенно покрывая всю область по мере вращения диска. В результате точечных отверстий изображение XY на детекторе представляет собой узкую Z-плоскость. Таким образом, изображения могут быть собраны из серии последовательных Z-плоскостей, часто называемых Z-стеком. На основе этих изображений соответствующее программное обеспечение может сгенерировать 3D-изображение сигнальной картины флуоресценции в образце.
В этом протоколе вы будете наблюдать иммуноокрашивание фибробластов мышей с последующей визуализацией на конфокальном микроскопе для дифференциальной визуализации белка клеточной поверхности и лизосомального белка.
Для начала, используя стерильные методы, повторно суспендируйте интересующие клетки в 500 микролитрах питательной среды на лунку, а затем засейте их в лунки четырехлуночной камеры. Здесь мы используем мышиные фибробласты, которые были трансфицированы для экспрессии антигенпрезентирующей молекулы CD1d. Чтобы клетки прилипли к стеклу, поместите предметное стекло камеры в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение ночи. Утром отсасывайте среду из каждой лунки, а затем один раз промойте клетки 500 микролитрами PBS в течение нескольких секунд.
Чтобы закрепить клетки, добавьте в каждую лунку по 500 микролитров 1% раствора параформальдегида, и выдержите 15 минут при комнатной температуре. После инкубации соберите параформальдегид в соответствующий контейнер для опасных жидких отходов, а затем удалите остатки фиксатора, промыв клетки три раза PBS в течение нескольких секунд.
Чтобы обеспечить проникновение антител в клетки, добавьте в каждую лунку по 500 микролитров пермеабилизационного буфера и инкубируйте на стенде в течение 15 минут при комнатной температуре. После пермеабилизации кратковременно промойте клетки три раза 500 микролитрами PBS. Затем добавьте 500 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител.
Приготовьте первичные антитела, анти-CD1d и анти-LAMP-1, в соответствующих рабочих концентрациях. Затем отсадите буфер из лунок и покройте клетки в каждой лунке 500 микролитрами разбавленного раствора первичного антитела, а затем инкубируйте предметное стекло на плоской поверхности в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующее утро разведите вторичные антитела, в данном случае антитела против мыши и крысы с четкими флуоресцентными метками, в блокирующем буфере до соответствующих рабочих концентраций. Далее отсадите из лунок первичный раствор антитела, а затем четыре раза промойте клетки 500 микролитрами PBS. Затем добавьте по 500 микролитров разведенного раствора вторичного антитела в каждую лунку, и выдерживайте при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. После инкубации аспирируйте раствор вторичного антитела и четыре раза промойте лунки 500 микролитрами PBS, чтобы удалить любые несвязанные вторичные антитела.
Чтобы смонтировать образцы после окончательной промывки, осторожно отсоедините и снимите камеры с затвора. Чтобы удалить остатки PBS, держите предметное стекло под углом над деликатной протиркой и удалите жидкость с краев, не касаясь ячеек. После удаления избытка PBS добавьте по одной капле защитной от выцветания монтажной среды, содержащей ядерное окрашивание DAPI, на каждый участок элементов. Затем возьмите покровное стекло размером 20 на 60 миллиметров и, используя только кончики пальцев, начните медленно опускать покровное стекло по обоим краям, стараясь избежать образования пузырьков над ячейками. Сотрите с предметных стекол лишний монтажный материал с помощью деликатной рабочей салфетки и храните слайды в темноте при комнатной температуре до недели.
Чтобы начать визуализацию клеток, сначала нажмите на значок программного обеспечения NIS на рабочем столе. Оказавшись в окне управления, нажмите на вкладку TiPad вверху, и выберите желаемый объект для изображения. Затем загрузите слайд с ячейками в рабочую область и расположите его по центру объектива. Затем на вкладке A1plus Compact GUI рядом с вкладкой TiPad настройте лазеры, подходящие для используемых флуорофоров. Нажмите на символ шестеренки, чтобы открыть меню настроек красителя и спектра. Как только откроется меню настроек красителя и спектра, выберите необходимые каналы и установите лазер для каждого канала. Затем выберите соответствующие выбросы в выпадающем меню под первым дихроичным зеркалом. Затем в окне A1plus Compact GUI нажмите на Ch.Series, чтобы настроить серию линейных каналов, которая определяет, будут ли используемые лазеры воздействовать на образец одновременно или последовательно.
После этого начните сканирование, нажав на значок со стрелкой вверху. На этом этапе, во время получения изображения в реальном времени, в окне A1plus Compact GUI нажмите на скользящую шкалу и измените размер отверстия, чтобы ограничить свет вне фокуса. Затем отрегулируйте настройки высокого напряжения и смещения для каждого лазера до соответствующих уровней с помощью скользящих шкал, чтобы обеспечить обнаружение конкретного окрашивания и ограничить любое потенциальное фоновое окрашивание. Если имеется образец положительного окрашивания, начните с визуализации этого образца для каждого канала, чтобы убедиться, что настройки лазера обеспечивают оптимальное соотношение сигнал/шум. После установки оптимальных значений высоковольтного напряжения и смещения для каждого лазера перейдите на вкладку «Захват нейтрального излучения», а затем выберите значок Z, чтобы настроить параметры для серии z.
Затем, получая изображение образца в реальном времени, сначала установите нижнюю часть, найдя нижнюю часть изображения и нажав кнопку внизу. Затем найдите верхнюю позицию образца и нажмите верхнюю кнопку. Задайте размер шага, введя предпочтительный размер шага в микронах для каждого шага или указав, сколько всего шагов необходимо. Чтобы выбрать желаемый размер/разрешение изображения в пикселях, нажмите на окно Aiplus Compact GUI и под значком размера выберите желаемое разрешение.
Чтобы уменьшить шум изображения, вы можете выбрать выпадающее меню рядом с символом тета, чтобы усреднить выбранное количество изображений. После этого перейдите на вкладку «Запустить сейчас» в меню «Захват ND», чтобы начать визуализацию образца. После того, как создание образа будет завершено, сохраните изображение, нажав на файл, затем сохраните его как, что приведет к экспорту файла изображения с расширением dot-nd2. Наконец, повторите процесс для каждого из остальных образцов.
В этом эксперименте мышиные фибробласты, экспрессирующие поверхностный гликопротеин ген CD1d, были зафиксированы, иммуноокрашены и визуализированы на конфокальном микроскопе. На этом изображении показана отдельная секция стека Z при 40-кратном увеличении, где CD1d окрашен в красный цвет. Образец был покрыт лизосомальным маркером LAMP-1 зеленого цвета. Ядерное окрашивание DAPI использовалось для демонстрации ядер клеток.
На составном изображении, где три разных канала объединены, появление желтого цвета является результатом перекрытия красного и зеленого каналов и указывает на область, где CD1d и LAMP-1 совместно локализованы в лизосомах. Области, в которых присутствует только один цвет, указывают на присутствие CD1d или LAMP-1 без колокализации. На этом изображении показана 3D-визуализация ячеек, построенных на основе изображений, захваченных в z-стеке, и этот метод позволил построить вид сбоку этой группы ячеек. На следующем рисунке показан срез z-стека при 100-кратном увеличении, демонстрирующий паттерны экспрессии этих двух белков более подробно. Розовый контур в правой части изображения отображает поперечное сечение x-координаты, обозначенной розовой линией на изображении, которая представляет вид сбоку на розовой линии. Аналогичным образом, синий контур в нижней части изображения показывает поперечное сечение y-координаты, обозначенной синей линией на изображении, которая представляет вид спереди на синей линии. 3D-рендеринг изображения z-стека позволяет пользователям просматривать изображение в 3D, визуализируя все плоскости x, y и z. Это может быть использовано для изучения совместной локализации различных окрашиваний в разных областях клетки.
Immunology
101.3K Просмотры
Immunology
25.9K Просмотры
Immunology
251.3K Просмотры
Immunology
30.4K Просмотры
Immunology
83.4K Просмотры
Immunology
46.3K Просмотры
Immunology
57.6K Просмотры
Immunology
91.1K Просмотры
Immunology
26.1K Просмотры
Immunology
24.2K Просмотры
Immunology
152.5K Просмотры
