How does confocal microscopy achieve better resolution than wide-field fluorescence microscopy?

Confocal microscopy uses two strategically placed pinholes at the focal planes of the objective lens to block out-of-focus light. While wide-field microscopy detects fluorescence from above and below the focal plane, creating hazy background, confocal pinholes allow only light from the focal point to reach the detector. This eliminates background fluorescence and dramatically improves both spatial resolution and image contrast.

What role do pinholes play in confocal microscope imaging?

Pinholes are small holes positioned on both the excitation and emission light paths at the focal plane of the objective lens. The excitation pinhole makes the light beam appear to originate from a focal point, enabling precise focusing. The emission pinhole blocks divergent light from out-of-focus regions, allowing only in-focus fluorescence to pass through to the detector, resulting in reduced background and improved image clarity.

How can confocal microscopy distinguish between surface and intracellular protein localization?

Confocal microscopy achieves subcellular resolution by collecting images from narrow Z planes using pinholes that eliminate out-of-focus light. This enables visualization at the subcellular level, allowing researchers to differentiate between surface membrane staining and intracellular staining. The technique can reveal whether proteins are located on the cell surface or within specific organelles like lysosomes.

What is a Z-stack and how is it used in confocal microscopy?

A Z-stack is a series of consecutive images collected from adjacent focal planes throughout the depth of a sample. Because confocal pinholes restrict detection to narrow Z planes, images can be acquired sequentially from top to bottom of the specimen. Specialized software then processes these Z-stack images to generate a three-dimensional depiction of the fluorescence signal pattern, enabling visualization of protein localization in all spatial dimensions.

Why is sample fixation preferred over live cell imaging for confocal microscopy?

Fixed cells are preferred for confocal Z-stack imaging because acquiring multiple images from numerous Z planes is time-consuming and challenging with live cells. Live cells are difficult to maintain healthy during extended imaging, and their organelles constantly move, compromising image quality and 3D reconstruction accuracy. Fixed cells preserve cellular morphology and remain stationary, allowing reliable collection of high-quality image series.

How do secondary antibodies with distinct fluorescent tags enable multi-protein visualization?

When imaging multiple cellular targets, primary antibodies from different species are used to label each antigen. Fluorophore-conjugated secondary antibodies, each with unique excitation and emission spectra, then bind to their respective primary antibodies. This allows the confocal microscope to distinguish signals from different proteins using separate laser channels, enabling simultaneous visualization and co-localization analysis of multiple antigens within the same cell.

What does co-localization indicate when visualizing multiple stained proteins in confocal images?

Co-localization occurs when two or more proteins occupy the same cellular region, appearing as color overlap in merged confocal images. For example, when red and green fluorescent signals overlap, they produce yellow, indicating that both proteins are present in the same subcellular compartment. This technique reveals functional relationships between proteins, such as whether CD1d traffics through lysosomal compartments marked by LAMP-1.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия: методика определения локализации белков в фибробластах мышей

0 просмотров13:13 мин.

1. Материалы

Буферы

Буфер для промывки: 1 x стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция или магния
Фиксирующий буфер: 1% параформальдегида в PBS
Буфер для проникновения: 0,1% Triton X-100 в PBS
Блокирующий буфер: 1% бычьего сывороточного альбумина в PBS
Среда для роста клеток: DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллин/стрептомицин и L-глутамин

Оборудование

Ламинарный колпак
Увлажнённый инкубатор (37°C, 5%_CO2)
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп; здесь лазер Nikon Eclipse Ti

Материалы и реактивы

Предметные стекла камерных клеточных культур
Монтажный носитель с защитой от выцветания с DAPI (для окрашивания ядер)
Защитное стекло микроскопа
Деликатные салфетки для работы
Пипетки и наконечники

Реагенты для анализа

В этом случае использовались адгезивные клетки (первичные клетки или клеточные линии), в которых использовались мышиные фибробласты, трансфицированные CD1d (LCD1).
Первичные антитела для обнаружения клеточных мишеней; здесь были использованы крысиный антимышиный CD107a (LAMP-1) и мышиный антимышиный CD1d.
Флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, специфичные к первичным изотипам антител; здесь использовали антикрысиный IgG, конъюгированный с Alexafluor 488, и антимышиный IgG, конъюгированный с Alexafluor 647.

2. Протокол

Подготовка к окрашиванию антителами

Засев ячеек

Ресуспендируйте интересующие клетки в питательных средах.
Затем засейте 500 мкл клеточной суспензии/на лунку в лунки 4-луночного камерного скольжения. (Здесь клетки LCD1 засеивали в соотношении 2,5x10⁵ клеток/камеру в 500 мкл питательной среды. Плотность посева может варьироваться в зависимости от клеточной линии).
Инкубируйте предметное стекло камеры в течение ночи в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C, чтобы клетки прилипли к стеклу.
На следующий день отсадите среду из каждой лунки, а затем промойте клетки 1X 500 мкл PBS.

Фиксация

Чтобы зафиксировать клетки, добавьте в каждую лунку 500 μл 1% раствора параформальдегида и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
После инкубации соберите параформальдегид в соответствующий контейнер для опасных жидких отходов.
Затем промойте ячейки 3 раза 500 мкл PBS, чтобы удалить остатки фиксатора.

Пермеабилизация

Пермеабилизируйте клетки путем инкубации с 500 мкл пермеабилизационного буфера/лунки в течение 15 минут при комнатной температуре.
Затем кратковременно промойте клетки 3 раза 500 μл PBS.

Блокировка

Инкубируйте клетки в каждой лунке с блокирующим буфером объемом 500 мкл в течение 1 часа при 4°C, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.

Инкубация первичных антител

Отсадите блокирующий буфер из затворных камер.
Затем добавьте в клетки 500 мкл разбавленного раствора первичного антитела. (Здесь анти-CD107a (LAMP-1) разбавляли в соотношении 1:500, а анти-CD1d использовали в неразбавленном виде (моноклональное антитело 1H6 было любезно предоставлено доктором Рэнди Бруткевичем)).
Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 4°C.

Примечание: Если вы исследуете более одной мишени, убедитесь, что первичные антитела имеют разные изотипы. Рекомендуемые концентрации антител варьируются у разных производителей и должны быть титрованы перед использованием.

Инкубация вторичных антител

Аспирируйте первичный раствор антитела из лунок.
Промыть камеры колодца 4 раза 500 μл PBS.
Затем добавьте по 500 мкл разбавленного раствора вторичного антитела в каждую лунку. (Здесь оба вторичных антитела - антимышиный IgG Alexafluor 647 и антикрысиный IgG Alexafluor 488 были разведены в соотношении 1:2000 в блокирующем буфере).
Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч в темное время суток.
После инкубации аспирируйте раствор вторичного антитела.
Промойте камеры 4 раза 500 мкл PBS, чтобы удалить все несвязанные вторичные антитела.

Примечание: Рекомендуемые концентрации антител варьируются у разных производителей и должны быть титрованы перед использованием. При зондировании более чем одной мишени вторичные антитела должны быть конъюгированы с различными флуорофорами с уникальными спектрами возбуждения/излучения. Также следует учитывать возбуждение/излучение ядерного противокрасителя (т.е. DAPI) при выборе флуорофоров. На выбор флуорофора может влиять конфигурация лазера используемого конфокального микроскопа. Конфигурация лазера машины будет определять, какие флуорофоры подходят для эксперимента.

3. Монтажные покровные стекла

Для начала аккуратно снимите патронники с затвора.
Затем держите предметное стекло под углом над деликатной рабочей жидкостью, протрите и удалите жидкость с краев, не касаясь ячеек.
Добавьте по 1 капле антивыцветающего монтажного материала, содержащего ядерное пятно DAPI, на каждый участок элементов.
Затем поместите покровное стекло размером 20 мм x 60 мм на предметное стекло, удерживая его за края кончиками пальцев. (Избегайте образования пузырьков над клетками, так как они мешают визуализации).
Сотрите лишний монтажный материал по бокам деликатной рабочей салфеткой и храните слайды в темноте при комнатной температуре до недели.

4. Конфокальная визуализация

Изображение образцов на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Для данных, показанных на рисунке 2, Nikon Eclipse Ti A1R использовался с программным обеспечением NIS Elements Advanced Research. В следующем разделе подробно описана процедура съемки изображений с помощью вышеупомянутого программного обеспечения.

Чтобы начать визуализацию клеток, откройте «Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research», нажав на «значок программного обеспечения NIS».
Далее в окне управления нажмите на вкладку «TiPad» и выберите нужный объект для визуализации. (Здесь был использован первый объектив с 40-кратным увеличением).
Загрузите слайд с ячейками на сцену и расположите его по центру под объективом.
Теперь на вкладке «A1plus Compact GUI» настройте лазеры, подходящие для используемых флуорофоров. Нажмите на символ шестеренки, чтобы открыть меню настроек красителя и спектра, выберите необходимые каналы и установите лазер для каждого канала.
Затем выберите соответствующие выбросы в выпадающем меню под первым дихроичным зеркалом.
Затем в окне «A1plus Compact GUI» нажмите на «Ch. Series», чтобы настроить серию линейных каналов, которая определяет, будут ли используемые лазеры одновременно или последовательно воздействовать на образец. (Здесь были выбраны последовательные проходы, начиная с канала 1, затем канала 2, затем 4).
После этого начните сканирование, нажав на значок «Наконечник стрелки» вверху. На этом этапе, пока изображение находится в реальном времени, в окне «A1plus Compact GUI» нажмите на скользящую шкалу и измените размер отверстия, чтобы обеспечить ограничение расфокусированного света. (Здесь использовалась самая низкая доступная настройка (0,5).
Затем отрегулируйте настройки «высокого напряжения» и «смещения» для каждого лазера до соответствующих уровней, используя скользящие шкалы, чтобы обеспечить обнаружение конкретного окрашивания, ограничивая при этом любое потенциальное фоновое окрашивание. Если имеется образец с положительным окрашиванием, начните с визуализации этого образца для каждого канала, чтобы убедиться, что настройки лазера обеспечивают оптимальное соотношение сигнал/шум.
Внимание: высокая интенсивность лазера в течение длительного времени может вызвать фотообесцвечивание.
После установки оптимальных значений высоковольтного напряжения и смещения для каждого лазера перейдите на вкладку «Захват нейтральных зарядов», а затем выберите значок «Z», чтобы настроить параметры для серии Z. Затем, получая изображение образца в реальном времени, сначала установите нижнюю часть, найдя нижнюю часть изображения и нажав кнопку «низ», затем найдите верхнюю позицию образца и нажмите кнопку «верх». Установите размер шага, введя предпочтительный размер шага в μm для каждого шага или указав, сколько всего шагов необходимо.
После настройки параметров z-серии выберите желаемый размер/разрешение изображения в пикселях. Для этого нажмите на окно «A1plus Compact GUI» и под значком «размер» выберите желаемое разрешение. Чтобы уменьшить шум изображения, можно выбрать выпадающее меню рядом с символом «ø», чтобы усреднить выбранное количество изображений.
Теперь нажмите на вкладку «Выполнить» в меню «Захват ND», чтобы начать визуализацию образца.
После того, как создание образа будет завершено, сохраните изображение, нажав «Файл», затем «Сохранить как», после чего файл изображения будет экспортирован с расширением «.nd2». Наконец, повторите процесс для каждого из остальных образцов.

Источник: Доминик Р. Боллино¹, Эрик А. Легензов², Тоня Дж. Уэбб¹
¹ Кафедра микробиологии и иммунологии, Медицинский факультет Университета Мэриленда и…