Методики на основе иммунопреципитации: очистка эндогенных белков с помощью агарозных шариков

1. Иммунопреципитация с использованием белка A/G плюс агарозные шарики

Препарат клеточного лизата

1. Центрифугируйте 10⁸ тимоцитов в микроцентрифуге при 13 000 об/мин в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость.
   Примечание: Количество клеток будет варьироваться в зависимости от уровня экспрессии желаемого белка и выбранного типа клеток.
2. Повторно суспендируйте клетки в буфере для лизиса RIPA объемом 500 мкл с PMSF.
3. Разрушайте клетки с помощью нескольких быстрых импульсов с помощью вихря, а затем несколько раз аспирируйте лизат с помощью иглы 25 G, прикрепленной к шприцу.
   Примечание: Избегайте создания пузырей. Используйте иглу большего размера, например иглу 21G, для больших типов клеток.
4. Инкубируйте лизат клеток на льду в течение 10 мин.
5. Центрифугируйте лизат при 13 000 об/мин в течение 15 мин при 4°C.
6. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку с маркировкой для микроцентрифуги.

Предварительное очистка

7. Добавьте в лизат 20 μL белка A/G PLUS агарозные гранулы и 1 μг антитела контроля изотипа (здесь используется антитело контроля изотипа IgG1 мыши).
   Примечание: Выбор используемого антитела изотипа будет зависеть от используемого белок-специфического антитела на более позднем этапе опускания.
8. Инкубировать смесь лизатов на вращателе центрифуги в холодильной камере (4°C) в течение 30 мин.
9. Центрифугирование образца при 3200 об/мин в течение 30 с при 4°C.
10. Переложите предварительно очищенную надосадочную жидкость в свежую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой. Выбросьте гранулы.

Определение концентрации белка

11. Определите концентрацию белка в клеточном лизате, выполнив анализ Брэдфорда.
12. Аликвот 1000 мкл реагента Брэдфорда в 7 микроцентрифужных пробирок.
13. Добавьте следующее количество стандартного белка БСА (2 мг/мл) в 6 пробирок (Таблица 1).

Номер трубки	Объем БСА (мкл) (2 мг/мл)	Концентрация белка (μг/μл)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Таблица 1: Стандартные количества белка БСА

14. В пробирку 7^th добавьте 1 мкл предварительно очищенного лизата.
    Примечание: Чтобы убедиться, что концентрация образца находится в пределах диапазона обнаружения анализа, приготовьте и проанализируйте также разведение лизата 1:2 или 1:5.
15. Поместите по 200 мкл из каждой из 7 пробирок в отдельные лунки 96-луночного планшета с плоским дном, повторяя каждый образец в трех экземплярах.
16. Считывание пластины на считывателе пластин под углом волны 595 нм.
17. Постройте стандартную кривую в excel и рассчитайте концентрацию белка в предварительно очищенном лизате.

Потянуть вниз

18. Пометьте две свежие микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл — одну как «контрольную», а другую как «тестовую», которая в данном примере является c-myc.
19. Поместите в каждую из этих пробирок по 500 г предварительно очищенного лизата.
    Примечание: Количество используемого здесь белка будет зависеть от количества белка, который необходимо очистить.
20. Доведите общий объем каждой пробирки до 500 мкл с помощью буфера для лизиса.
21. Добавьте 2 мкг антитела против c-myc в пробирку тестовой группы и 2 мкг мышиного контрольного антитела изотипа IgG1 в контрольную группу.
    Примечание: Количество антител будет зависеть от эффективности антител и количества целевого белка.
22. Инкубируйте пробирки на ротаторе в холодильной камере (4°C) в течение 2 ч.
23. Добавьте 20 μL белка A/G плюс агарозные шарики в каждую пробирку.
    Примечание: Рекомендуется использовать наконечники для пипеток с отрезанным концом, чтобы предотвратить повреждение шариков.
24. Инкубировать на ротаторе в холодном помещении (4°C) в течение ночи.
    Примечание: В зависимости от целевого белка и эффективности антитела, этот шаг может варьироваться от 1 часа до ночи.
25. Центрифугируйте пробирки при 3200 об/мин в течение 30 с 4°C, чтобы вытянуть шарики вниз.
26. Отсасывайте надосадочную жидкость из каждой трубки.
    Примечание: Целевой белок теперь связан с бусинами.
27. Промойте шарики два раза, используя 500 μL 1X Dulbecco's PBS.
28. Центрифугирование пробирок при 3200 об/мин в течение 30 с 4°C.
    Примечание: Для более строгой промывки, используйте более строгие буферы, такие как RIPA.
29. Отсасывайте буфер из каждой трубки. С помощью гелевых наконечников удалите остатки буфера из гранул и держите шарики на льду, чтобы разбавить белок.
    Примечание: В этом примере белок элюируется в буфер SDS-PAGE путем кипячения гранул для вестерн-блоттинга. Этот подход подходит для проверки результатов ИП или для изучения белок-белковых взаимодействий. Для других последующих применений, таких как очистка белков для структурного или ферментативного анализа, используются более сложные системы, такие как эпитопные метки (flag-tag или myc-tag), чтобы избежать элюирования антитела интересующим белком.

2. Проверка IP-адреса с помощью анализа вестерн-блота

Электрофорез SDS-PAGE:

1. Повторно суспендируйте шарики в 20 мкл загрузочного красителя SDS-Page, содержащего β-меркапто-этонол.
2. Кипятите образцы при температуре 95 °C в течение 5 минут
3. Центрифугируйте шарики при 13 000 об/мин в течение 10 с при комнатной температуре.
4. С помощью наконечников для загрузки геля тщательно пипетируйте полученные из бусин образцы и загрузите их в лунки с градиентом 4-15% геля SDS-PAGE.
5. В дополнение к образцам загрузите дорожку с белковой лестницей, а также дорожку с предварительно очищенным лизатом, который будет служить в качестве контроля загрузки.
6. Работайте при напряжении 100 В, пока передняя часть красителя не достигнет дна геля (~1 час).

Анализ вестерн-блота:

7. Сделайте сэндвич вестерн-блот, убедившись, что мембрана из ПВДФ находится между гелем и красным катодом.
8. Передача в течение 1 часа при 100 В.
9. Поместите мембрану в блокирующий буфер объемом 5 мл при комнатной температуре на 1 ч на коромысле при низкой температуре, чтобы блокировать неспецифические участки связывания белка.
   Примечание: Объемы блокирующего буфера, первичного антитела, вторичного антитела и смывов могут потребоваться для блотов большего размера.
10. Инкубируйте блот с 5 мл антител анти-c-myc в блокирующем буфере в течение ночи при 4°C на коромысле при низкой настройке.
    Примечание: Антитело, используемое здесь, должно отличаться от того, которое используется на этапе pull-down.
11. Промойте кляксу 3-6 раз, используя 5 мл TBST, каждое стирание 5 минут при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке.
12. Инкубируйте блот с меченым HRP вторичным антителом против легкой цепи кролика в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке.
    Примечание: Выбор вторичного антитела будет зависеть от первичного антитела, используемого для вестерн-блоттинга. Кроме того, в протоколе используется специфичная для легкой цепи вторичная структура, поскольку белок-мишень близок по молекулярной массе к тяжелой цепи антитела. Если целевой белок близок к 50 кДа, используйте легкую цепь, специфичную для вторичного белка. Если целевой белок близок к 25 кДа, используйте специфичный для тяжелой цепи вторичный .
13. Промойте кляксу 3-6 раз, используя 5 мл TBST, каждое стирание 5 минут при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке.
14. Удалите жидкость с кляксы и промокните край кляксы на лабораторных салфетках, чтобы удалить излишки жидкости.
15. Покройте блоттинг 1x хемилюминесцентным реагентом для обнаружения и инкубируйте в течение 1 мин.
    Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в быстрой последовательности, так как реагент для обнаружения чувствителен к свету и времени.
16. Нанесите край кляксы на лабораторные салфетки, чтобы удалить излишки реагента для обнаружения.
17. Поместите кляксу на поверхность лотка имидж-сканера.
    Примечание: Хемилюминесцентные блоты также можно визуализировать с помощью пленки.
18. Изображение с помощью 'Хемилюминесцентная программа' для захвата нескольких временных точек от 10 с до 5 минут.
    Примечание: Оптимальное время может меняться в зависимости от количества белка и качества антител.
19. Выберите изображение с оптимальной видимостью канала, а затем экспортируйте его.
20. Перед перемещением кляксы сфотографируйте кляксу с помощью тепловизора, чтобы зафиксировать местоположение лестницы. Затем экспортируйте это изображение.
21. С помощью программного обеспечения для подготовки слайдов (например, PowerPoint) выровняйте полосы и изображения лестницы, чтобы сформировать одно изображение.