Методики на основе иммунопреципитации: очистка эндогенных белков с помощью агарозных шариков

Иммунопреципитация, или IP, является широко используемым методом выделения представляющего интерес белка из лизата клеток или тканей или жидкости организма для определения характеристик белка или для исследования белок-белковых взаимодействий.

Процесс начинается с антитела, которое обладает высоким сродством и специфичностью к белку-мишени. Это антитело смешивается с образцом, что позволяет формировать комплексы антитело-мишень. Любой белок, связанный с белком-мишенью, также косвенно присоединяется к антителу в процессе. Далее раствор инкубируют с шариками агарозы, конъюгированными с бактериальным белком, который обладает сильным сродством к постоянной области антител. Бактериальный белок связывается с антителом и соединяет комплексы антитело-мишень с гранулами. Затем раствор центрифугируют для осаждения гранул, тем самым экстрагируя весь комплекс, содержащий связывающее антитело, целевой белок и любые взаимодействующие белки. Наконец, связанные белки извлекаются из гранул и высвобождаются друг из друга, а затем используются для дальнейшего анализа с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг.

Обычно используется несколько вариаций различных частей этого метода, таких как предварительное очищение, использование пептидных меток или магнитных шариков, или анализ других партнеров, не связывающих белки. IP может предшествовать этап предварительного очищения для удаления неспецифических антител-связывающих белков в образце и минимизации фона. Это включает в себя сначала инкубацию образца с антителами контроля изотипа, позволяющими им связываться с этими белками, а затем использование агарозных гранул для осаждения комплексов. После этого образец готов к переходу к фактическому IP.

Пептидные метки полезны, если конкретное антитело недоступно для IP. В этом случае белок-мишень может быть генетически модифицирован таким образом, чтобы он содержал пептидную эпитопную метку, а антитело против метки способно вытягивать интересующий белок. Магнитные шарики часто используются вместо агарозы для осаждения мишени. После связывания с комплексом антитело-мишень пробирка с образцом помещается в сильное магнитное поле, которое извлекает шарики из раствора. Это устраняет необходимость в центрифугировании и повышает скорость и удобство.

Иммунопреципитация также используется для изучения ДНК или РНК-связывающих белков и известна как иммунопреципитация хроматина и иммунопреципитация РНК соответственно. Эти вариации полезны для поиска и устранения неисправностей и адаптации метода к различным экспериментальным приложениям. В этом видео вы узнаете, как предварительно очистить лизат клеток и выполнить иммунопреципитацию для извлечения интересующего вас белка, а затем провести вестерн-блоттинг для подтверждения эксперимента.

Для начала поместите предварительно собранные ячейки в микроцентрифугу и вращайте со скоростью 13 тысяч оборотов в минуту в течение трех минут. После отжима удаляют надосадочную жидкость и затем ресуспендируют клетки в 500 микролитрах лизисного буфера RIPA с PMSF. Теперь разрушьте клетки с помощью нескольких быстрых импульсов с помощью вихря, а затем несколько раз аспирируйте лизат с помощью иглы 25 калибра, прикрепленной к шприцу, стараясь не создавать пузыри. Поместите клетки на лед на 15 минут. После инкубации образцов на льду центрифугируйте лизат в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Наклейте этикетку на новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. После отжима переложите надосадочную жидкость в только что помеченную пробирку и выбросьте гранулы. Затем предварительно очистите лизат от загрязняющих веществ, которые неспецифически связываются либо с шариками агарозы, либо с первичным антителом, добавив 20 микролитров белка A/G плюс-агарозы и один микрограмм антитела контроля изотипа к лизату, который в данном примере является контролем изотипа IgG1 у мыши. Инкубируйте трубку на ротаторе в холодном помещении в течение 30 минут. После вращения лизата в холодильной камере в течение 30 минут центрифугируйте образец при 3200 об/мин в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия. Извлеките пробирку из центрифуги и переложите предварительно очищенную надосадочную жидкость в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитров с маркировкой. Выбросьте гранулы.

Теперь определите концентрацию белка в клеточном лизате, выполнив анализ Брэдфорда. Метка семь 1. 5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки от одного до шести и берут образец и аликвотируют 1000 микролитров реагента Брэдфорда в каждую пробирку. Шесть трубок будут использоваться для построения стандартной кривой путем добавления различных количеств известных количеств BSA в каждую трубку. Суммы, которые необходимо добавить, перечислены в этой таблице. В седьмую пробирку с образцом добавьте один микролитр предварительно очищенного лизата. Поместите по 200 микролитров из каждой из семи пробирок в отдельные лунки 96-луночного планшета с плоским дном, повторяя каждый образец в трех экземплярах так, чтобы получилось три столбца по семь образцов. Считывание показаний с помощью считывателя пластин с использованием длины волны 595 нанометров. После создания стандартной кривой в Excel рассчитайте концентрацию белка предварительно очищенного лизата.

Затем пометьте две 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки - одну как контрольную, а другую как тестовую, которая в данном примере будет антителом c-myc. Поместите 500 микрограммов предварительно очищенного лизата в каждую из этих пробирок, а затем доведите общий объем для каждой пробирки до 500 микролитров с помощью буфера для лизиса. Далее добавьте в пробирку тестовой группы два микрограмма антитела против c-mic. Для контроля добавьте два микрограмма антитела мышиного контроля изотипа IgG1. После того, как антитела будут добавлены в пробирки, поместите образцы на ротатор в холодную комнату и инкубируйте в течение двух часов. Теперь добавьте агарозные бусины. Для этого рекомендуется отрезать конец наконечника пипетки, а затем, используя этот модифицированный наконечник, добавить в каждую пробирку 200 микролитров агарозных шариков Protein A/G PLUS. Инкубируйте трубки на ротаторе в холодном помещении на ночь.

После инкубации извлеките пробирки из вращателя и вращайте лизаты в микроцентрифуге, чтобы вытянуть шарики вниз. После завершения отжима извлеките пробирки из центрифуги и отасадите надосадочную жидкость из каждой пробирки. Далее промойте бусины, используя 500 микролитров 1X Dulbecco's PBS. Поместите пробирки в микроцентрифугу и вращайте в течение 30 секунд при температуре четыре градуса Цельсия. После этого удаляют надосадочную жидкость. Повторите шаги промывки и центрифугирования еще один раз, в общей сложности два раза. Извлеките пробирки из микроцентрифуги и отасуньте буфер из каждой пробирки. С помощью гелевых насадок удалите остатки буфера из шариков, удерживая шарики на льду, чтобы вымыть связанный белок.

В этом примере белок элюируют в рабочий буфер SDS-PAGE путем кипячения для вестерн-блоттинга. Для этого суспендируйте шарики в 20 микролитрах загрузочного красителя SDS-PAGE, содержащего бета-меркаптоэтанол, или BME. Прокипятите образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы отделить иммунокомплексы от шариков. Затем центрифугируйте шарики на максимальной скорости в течение 10 секунд при комнатной температуре. Извлеките пробирки из микроцентрифуги и подержите их в штативе при комнатной температуре. С помощью наконечников для загрузки геля аккуратно пипеткой отбирают образцы из шариков и загружают их в лунки с градиентом от 4 до 15% геля SDS-PAGE. В дополнение к образцам загрузите дорожку с белковой лестницей, а также дорожку с предварительно очищенным лизатом, который будет служить в качестве контроля загрузки. Как только гель будет загружен, запустите его при напряжении 100 вольт.

После того, как фронт красителя достигнет дна геля, что должно занять примерно один час, остановите гель и сделайте сэндвич вестерн-блоттинг, следя за тем, чтобы мембрана PVDF находилась между гелем и катодом. Поместите бутерброд Western blot в передаточный аппарат и перенесите белки на геле на мембрану в течение одного часа при напряжении 100 вольт. После завершения переноса поместите мембрану в пять миллилитров блока, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с мембраной. Покачивайте на низкой температуре в течение часа при комнатной температуре. Когда сработает таймер, снимите блокирующий буфер. Добавьте к мембране пять миллилитров блокирующего буфера с антителом для обнаружения. Здесь используется антитело против c-myc, которое отличается от того, которое используется для вытягивания.

Инкубируйте блотку в течение ночи, при четырех градусах Цельсия на коромысле при низкой настройке. После инкубации удалите антитела и блокирующий буфер. Промойте кляксу, используя пять миллилитров TBST в течение пяти минут при комнатной температуре, на коромысле при низкой температуре. Этот этап стирки следует повторить от двух до пяти раз, в общей сложности от трех до шести стирок, используя свежий TBST для каждой стирки. Добавьте в блоттинг пять миллилитров одного к 1000 вторичного антитела и блокирующего буфера. В этом случае вторичным антителом является HRP-меченая антикроличья легкая цепь. Инкубируйте кляксу на коромысле при низкой настройке для одного нашего при комнатной температуре. Далее снимите буфер и промойте кляксу пятью миллилитрами TBST. Выдержите эту стирку на коромысле при низкой температуре в течение пяти минут при комнатной температуре. Повторите эту стирку в общей сложности от шести до 12 стирок, каждая из которых содержит свежие пять миллилитров TBST. Удалите остатки смывки, сначала слив жидкость с кляксы. Затем с помощью пинцета промокните край кляксы на лабораторной салфетке, чтобы удалить лишнюю жидкость, а затем поместите кляксу в свежую емкость. Затем накройте блотку 1X хемилюминесцентным реагентом для обнаружения и инкубируйте в течение одной минуты.

Работая быстро, промокните край кляксы на лабораторной салфетке, чтобы удалить излишки реагента для обнаружения, а затем поместите кляксу на поверхность лотка Imager. Изображение с помощью хемилюминесцентной программы для захвата нескольких временных точек от 10 до 30 секунд. После того, как изображение блота будет получено, выберите изображение с оптимальной видимостью канала, а затем экспортируйте это изображение. Перед перемещением кляксы используйте имидж-сканер, чтобы сфотографировать блот, чтобы зафиксировать местоположение лестницы. Затем экспортируйте это изображение. Наконец, используя программное обеспечение для подготовки слайдов, такое как PowerPoint, выровняйте полосы и изображения лестницы, чтобы сформировать одно изображение.

На этом изображении показан результат вестерн-блоттинга для иммунопреципитации белка c-myc из клеток тимоцитов. Слева направо полосы представляют контроль изотипа, c-myc IP и предварительно очищенный вход лизата. Полоса справа представляет собой объединенное изображение лестницы молекулярных масс. Сильная полоса с концентрацией около 25 килодальтон относится к легкой цепи, а полоса с концентрацией 50 килодальтон относится к тяжелой цепи связывающего антитела и не специфична для ИП или образцов. C-myc имеет толчок около 67 килодальтон на вестерн-блоттинге и обычно виден чуть ниже лестничной полосы в 75 килодальтон. В этом блоттинге полоса c-myc видна на второй полосе, но отсутствует на первой, что указывает на то, что антитело IP успешно вытянуло c-myc. В предварительно очищенной полосе лизата нет видимой полосы, что позволяет предположить, что этот белок имеет низкий уровень эндогенной экспрессии.