What is the main purpose of immunoprecipitation in protein research?

Immunoprecipitation isolates a specific protein of interest from cell or tissue lysate using an antibody with high affinity and specificity for the target. The technique enables protein characterization and investigation of protein-protein interactions. Any proteins bound to the target protein are indirectly attached to the antibody during the process, allowing researchers to study protein complexes and their components.

How do agarose beads function in the immunoprecipitation process?

Agarose beads are conjugated to a bacterial protein that binds strongly to the constant region of antibodies. When added to the antibody-target complex solution, the bacterial protein on the beads connects the antibody-target complexes to the beads. Centrifugation then precipitates the beads, extracting the entire complex containing the antibody, target protein, and any interacting proteins for further analysis.

Why is the pre-clearing step important before immunoprecipitation?

Pre-clearing removes non-specific antibody-binding proteins from the sample to minimize background contamination. The sample is first incubated with isotype control antibodies that bind these proteins, then agarose beads precipitate the complexes. This step reduces non-specific binding in the final product, ensuring that only the target protein and its genuine interacting partners are isolated during the actual immunoprecipitation.

What are peptide tags and when are they used in immunoprecipitation?

Peptide tags are epitope sequences genetically added to target proteins when a specific antibody is unavailable for immunoprecipitation. An antibody against the tag can then pull out the protein of interest. This approach is particularly useful for recombinant proteins, as antibodies against epitope tags like myc or flag are typically strong and effective, making optimization easier than with antibodies against endogenous proteins.

How does Western blot analysis verify successful immunoprecipitation?

After immunoprecipitation, the isolated protein is resolved using SDS-PAGE and transferred to a membrane for Western blot analysis. A different detection antibody than the one used for pull-down is applied to verify the correct protein was isolated. The presence of a band at the expected molecular weight confirms successful pull-down, while absence of bands in control lanes indicates specificity and minimal non-specific binding.

What are the advantages of using magnetic beads instead of agarose beads in immunoprecipitation?

Magnetic beads offer improved speed and convenience over agarose beads. After binding to the antibody-target complex, the sample tube is placed in a strong magnetic field to extract the beads from the solution. This eliminates the need for centrifugation, making the procedure faster and more efficient, particularly useful for high-throughput applications or when processing multiple samples simultaneously.

What specialized variations of immunoprecipitation exist for studying different molecular interactions?

Chromatin immunoprecipitation studies DNA-binding proteins, while RNA immunoprecipitation analyzes RNA-binding proteins. These variations adapt the core immunoprecipitation method for different experimental applications. Additionally, producing monoclonal antibodies using hybridomas provides high-quality, specific antibodies essential for optimizing immunoprecipitation protocols across diverse research contexts.

Методики на основе иммунопреципитации: очистка эндогенных белков с помощью агарозных шариков

0 просмотров13:46 мин.

1. Иммунопреципитация с использованием белка A/G плюс агарозные шарики

Препарат клеточного лизата

Центрифугируйте 10⁸ тимоцитов в микроцентрифуге при 13 000 об/мин в течение 3 минут и удалите надосадочную жидкость.
Примечание: Количество клеток будет варьироваться в зависимости от уровня экспрессии желаемого белка и выбранного типа клеток.
Повторно суспендируйте клетки в буфере для лизиса RIPA объемом 500 мкл с PMSF.
Разрушайте клетки с помощью нескольких быстрых импульсов с помощью вихря, а затем несколько раз аспирируйте лизат с помощью иглы 25 G, прикрепленной к шприцу.
Примечание: Избегайте создания пузырей. Используйте иглу большего размера, например иглу 21G, для больших типов клеток.
Инкубируйте лизат клеток на льду в течение 10 мин.
Центрифугируйте лизат при 13 000 об/мин в течение 15 мин при 4°C.
Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку с маркировкой для микроцентрифуги.

Предварительное очистка

Добавьте в лизат 20 μL белка A/G PLUS агарозные гранулы и 1 μг антитела контроля изотипа (здесь используется антитело контроля изотипа IgG1 мыши).
Примечание: Выбор используемого антитела изотипа будет зависеть от используемого белок-специфического антитела на более позднем этапе опускания.
Инкубировать смесь лизатов на вращателе центрифуги в холодильной камере (4°C) в течение 30 мин.
Центрифугирование образца при 3200 об/мин в течение 30 с при 4°C.
Переложите предварительно очищенную надосадочную жидкость в свежую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой. Выбросьте гранулы.

Определение концентрации белка

Определите концентрацию белка в клеточном лизате, выполнив анализ Брэдфорда.
Аликвот 1000 мкл реагента Брэдфорда в 7 микроцентрифужных пробирок.
Добавьте следующее количество стандартного белка БСА (2 мг/мл) в 6 пробирок (Таблица 1).

Номер трубки	Объем БСА (мкл) (2 мг/мл)	Концентрация белка (μг/μл)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Таблица 1: Стандартные количества белка БСА

В пробирку 7^th добавьте 1 мкл предварительно очищенного лизата.
Примечание: Чтобы убедиться, что концентрация образца находится в пределах диапазона обнаружения анализа, приготовьте и проанализируйте также разведение лизата 1:2 или 1:5.
Поместите по 200 мкл из каждой из 7 пробирок в отдельные лунки 96-луночного планшета с плоским дном, повторяя каждый образец в трех экземплярах.
Считывание пластины на считывателе пластин под углом волны 595 нм.
Постройте стандартную кривую в excel и рассчитайте концентрацию белка в предварительно очищенном лизате.

Потянуть вниз

Пометьте две свежие микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл — одну как «контрольную», а другую как «тестовую», которая в данном примере является c-myc.
Поместите в каждую из этих пробирок по 500 г предварительно очищенного лизата.
Примечание: Количество используемого здесь белка будет зависеть от количества белка, который необходимо очистить.
Доведите общий объем каждой пробирки до 500 мкл с помощью буфера для лизиса.
Добавьте 2 мкг антитела против c-myc в пробирку тестовой группы и 2 мкг мышиного контрольного антитела изотипа IgG1 в контрольную группу.
Примечание: Количество антител будет зависеть от эффективности антител и количества целевого белка.
Инкубируйте пробирки на ротаторе в холодильной камере (4°C) в течение 2 ч.
Добавьте 20 μL белка A/G плюс агарозные шарики в каждую пробирку.
Примечание: Рекомендуется использовать наконечники для пипеток с отрезанным концом, чтобы предотвратить повреждение шариков.
Инкубировать на ротаторе в холодном помещении (4°C) в течение ночи.
Примечание: В зависимости от целевого белка и эффективности антитела, этот шаг может варьироваться от 1 часа до ночи.
Центрифугируйте пробирки при 3200 об/мин в течение 30 с 4°C, чтобы вытянуть шарики вниз.
Отсасывайте надосадочную жидкость из каждой трубки.
Примечание: Целевой белок теперь связан с бусинами.
Промойте шарики два раза, используя 500 μL 1X Dulbecco's PBS.
Центрифугирование пробирок при 3200 об/мин в течение 30 с 4°C.
Примечание: Для более строгой промывки, используйте более строгие буферы, такие как RIPA.
Отсасывайте буфер из каждой трубки. С помощью гелевых наконечников удалите остатки буфера из гранул и держите шарики на льду, чтобы разбавить белок.
Примечание: В этом примере белок элюируется в буфер SDS-PAGE путем кипячения гранул для вестерн-блоттинга. Этот подход подходит для проверки результатов ИП или для изучения белок-белковых взаимодействий. Для других последующих применений, таких как очистка белков для структурного или ферментативного анализа, используются более сложные системы, такие как эпитопные метки (flag-tag или myc-tag), чтобы избежать элюирования антитела интересующим белком.

2. Проверка IP-адреса с помощью анализа вестерн-блота

Электрофорез SDS-PAGE:

Повторно суспендируйте шарики в 20 мкл загрузочного красителя SDS-Page, содержащего β-меркапто-этонол.
Кипятите образцы при температуре 95 °C в течение 5 минут
Центрифугируйте шарики при 13 000 об/мин в течение 10 с при комнатной температуре.
С помощью наконечников для загрузки геля тщательно пипетируйте полученные из бусин образцы и загрузите их в лунки с градиентом 4-15% геля SDS-PAGE.
В дополнение к образцам загрузите дорожку с белковой лестницей, а также дорожку с предварительно очищенным лизатом, который будет служить в качестве контроля загрузки.
Работайте при напряжении 100 В, пока передняя часть красителя не достигнет дна геля (~1 час).

Анализ вестерн-блота:

Сделайте сэндвич вестерн-блот, убедившись, что мембрана из ПВДФ находится между гелем и красным катодом.
Передача в течение 1 часа при 100 В.
Поместите мембрану в блокирующий буфер объемом 5 мл при комнатной температуре на 1 ч на коромысле при низкой температуре, чтобы блокировать неспецифические участки связывания белка.
Примечание: Объемы блокирующего буфера, первичного антитела, вторичного антитела и смывов могут потребоваться для блотов большего размера.
Инкубируйте блот с 5 мл антител анти-c-myc в блокирующем буфере в течение ночи при 4°C на коромысле при низкой настройке.
Примечание: Антитело, используемое здесь, должно отличаться от того, которое используется на этапе pull-down.
Промойте кляксу 3-6 раз, используя 5 мл TBST, каждое стирание 5 минут при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке.
Инкубируйте блот с меченым HRP вторичным антителом против легкой цепи кролика в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке.
Примечание: Выбор вторичного антитела будет зависеть от первичного антитела, используемого для вестерн-блоттинга. Кроме того, в протоколе используется специфичная для легкой цепи вторичная структура, поскольку белок-мишень близок по молекулярной массе к тяжелой цепи антитела. Если целевой белок близок к 50 кДа, используйте легкую цепь, специфичную для вторичного белка. Если целевой белок близок к 25 кДа, используйте специфичный для тяжелой цепи вторичный .
Промойте кляксу 3-6 раз, используя 5 мл TBST, каждое стирание 5 минут при комнатной температуре на коромысле при низкой настройке.
Удалите жидкость с кляксы и промокните край кляксы на лабораторных салфетках, чтобы удалить излишки жидкости.
Покройте блоттинг 1x хемилюминесцентным реагентом для обнаружения и инкубируйте в течение 1 мин.
Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в быстрой последовательности, так как реагент для обнаружения чувствителен к свету и времени.
Нанесите край кляксы на лабораторные салфетки, чтобы удалить излишки реагента для обнаружения.
Поместите кляксу на поверхность лотка имидж-сканера.
Примечание: Хемилюминесцентные блоты также можно визуализировать с помощью пленки.
Изображение с помощью 'Хемилюминесцентная программа' для захвата нескольких временных точек от 10 с до 5 минут.
Примечание: Оптимальное время может меняться в зависимости от количества белка и качества антител.
Выберите изображение с оптимальной видимостью канала, а затем экспортируйте его.
Перед перемещением кляксы сфотографируйте кляксу с помощью тепловизора, чтобы зафиксировать местоположение лестницы. Затем экспортируйте это изображение.
С помощью программного обеспечения для подготовки слайдов (например, PowerPoint) выровняйте полосы и изображения лестницы, чтобы сформировать одно изображение.