Анализ на клеточную смерть: анализ высвобождения хрома на цитотоксическую способность

Обзор процедур

Типичный анализ ⁵¹Cr-release для измерения гибели клеток включает в себя следующие этапы:

1. Во-первых, клетки-мишени помечаются Na₂[⁵¹Cr]O₄. Это отличает их от эффекторных клеток в анализе.
2. В то время как целевые клетки мечаются, эффекторные клетки собирают и, используя метод серийного разведения, генерируют уменьшающееся титрование эффекторных клеток в 96-луночном испытательном планшете с круглым дном.
3. В конце мечения клеток-мишеней клетки сначала промывают клетки, а затем добавляют фиксированное количество клеток на пластину для анализа, которая уже содержит серию разведений эффекторных клеток.
4. Затем клеточную смесь мишень-эффектор инкубируют в течение определенного периода времени, чтобы обеспечить достаточное взаимодействие клеток с клетками-мишенями, чтобы опосредовать лизис клеток.
5. Наконец, надосадочная жидкость культуры собирается и собирается в пробирки. Количество ⁵¹Cr количественно оценивается с помощью гамма-счетчика.
6. В конце данные собираются и используются для расчета «процентного специфического клеточного лизиса» клеток-мишеней.

1. Маркировка целевых клеток ⁵¹Cr

1. Для начала подготовьте клетки-мишени (в данном случае - клеточную линию меланомы человека WM793) в одноклеточную суспензию.
2. Для этого сначала извлеките среды из колбы для культуры тканей.
3. Затем промойте клетки 5 мл 1X PBS.
4. Трипсинизируйте клетки, добавив 1 мл трипсина в планшет на ~2 минуты.
5. Осторожно постучите по колбе, чтобы оторвать ячейки от поверхности колбы.
6. Добавьте в колбу 5 мл среды RPMI и проводите ее пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить ячейки.
7. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 минут при 1200 об/мин. Сцедите надосадочную жидкость.
8. Добавьте в гранулу 10 мл среды и аккуратно проводите ее пипеткой вверх и вниз, чтобы привести клетки во взвешенное состояние.
9. Определяют концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.
10. Переложите 1x10⁶ клеток в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
11. Центрифугировать суспензию клеток в течение 5 мин при 1200 об/мин и сцедить надосадочную жидкость.
12. Кратковременно проведите вихревую пробирку, чтобы повторно суспендировать клеточную гранулу в небольшом объеме оставшейся среды.
13. Добавьте 100 μCi ⁵¹Cr непосредственно в суспензию клеток-мишеней WM793.
    Примечание: Для конкретной радиоактивности должно быть оборудовано специальное лабораторное пространство. Кроме того, должна быть достаточная свинцовая защита для безопасного хранения и использования ⁵¹Cr на всех этапах, а также надлежащие указатели, указывающие, где хранятся образцы с ⁵¹Cr. Также необходим счетчик Гейгера, оснащенный блинным щупом, для обследования пространства на предмет возможного загрязнения.
14. Добавьте к трубке небольшой кусочек радиоактивной ленты, чтобы показать, что трубка теперь радиоактивна.
15. Поместите пробирку в инкубатор с температурой 37°C со свинцовым защитным экраном и инкубируйте в течение 1 ч. Переворачивайте пробирку каждые 15-20 минут, чтобы увеличить поглощение хрома клетками-мишенями.
16. После инкубационного периода промойте целевые клетки 5 мл FBS, чтобы удалить избыток ⁵¹Cr.
17. Центрифугируйте ячейки при 1200 об/мин в течение 5 мин. Сцеживайте радиоактивные FBS в соответствующий контейнер для отходов.
18. Снова суспензируйте гранулу и промойте второй раз FBS. Проверьте гранулу на включенную радиоактивность с помощью счетчика Гейгера.
19. Ресуспендируйте гранулу в 10 мл готовой среды, достигнув клеточной концентрации 10⁵ клеток/мл.<бр/> Примечание: Этап подсчета ячеек после маркировки ⁵¹Cr здесь опущен в основном по соображениям безопасности. Можно предположить, что концентрация элементов WM793 такая же, как и до маркировки ⁵¹Cr.

2. Подготовка эффекторных клеток

1. Можно использовать различные эффекторные клетки, такие как Т-клетки человека или мыши и NK-клетки. В данном примере использовали ПМЦ, выделенные из цельной крови методом стандартного центрифугирования с градиентом плотности (до концентрации 5х106).
2. Для начала добавьте 100 мкл среды для культуры тканей в каждую лунку одного из рядов (здесь ряд А, см. таблицу 1) 96-луночного планшета с круглым дном. В этом случае эффекторные клетки не добавляются, и они будут служить «пробелом» для определения «минимального/спонтанного высвобождения ⁵¹Cr» из клеток-мишеней.

Таблица 1: Схема анализа высвобождения ⁵¹Cr: Строка A - Клетки-мишени (10⁴ клеток/ 100 μл), инкубированные только со средой (генерирует «пустоту» для определения «минимального/спонтанного высвобождения ⁵¹Cr»). Ряды от B до C- лунки, содержащие различные соотношения эффекторов: клеток-мишеней (E:T) в диапазоне от 50:1 до 1,5:1. Ряд H - клетки-мишени (10⁴ клеток/100 μл), инкубированные с 1% NP-40 (NP-40 лизирует клетки-мишени, генерируя «максимальное или общее высвобождение ⁵¹Cr»). Каждое соотношение E:T проверяется в трех экземплярах для каждого экспериментального условия. Колонка 1-3 - нестимулированные PBMC и колонка 4-6 - CpG-стимулированные PBMC.

3. Затем сгенерируйте 2-кратное серийное разведение клеток PBMC (в трех экземплярах для каждого экспериментального условия), чтобы получить концентрацию эффекторных клеток в диапазоне от 5x105 до 15 625 клеток/100 мкл среды (здесь строки от B до G).
   Примечание: В этом примере соотношение начальный эффектор: клетка-мишень (E:T) равно 50:1. Однако это соотношение может корректироваться в зависимости от специфики эксперимента.
4. Оставьте последнюю строку пустой (в данном случае строку H), не добавляя в эти лунки никаких ячеек эффекторов. (Эта строка будет использоваться для генерации значений "общее количество отсчетов/мин, или (c. p. m)" или "максимальное высвобождение ⁵¹Cr").
5. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37°C до тех пор, пока целевые клетки не будут готовы к добавлению.

3. Добавление ^{в анализ 51}меченых Cr целевых клеток WM793

1. После инкубационного периода извлеките целевые клетки из инкубатора и промойте 5 мл FBS, чтобы удалить избыток ⁵¹Cr.
2. Центрифугируйте ячейки со скоростью 1200 об/мин в течение 5 минут, используя специальную центрифугу.
3. Удалите смывку FBS (радиоактивную надосадочную жидкость) в соответствующий контейнер для отходов.
4. Повторите этап промывки, повторно суспензив гранулу в свежих 5 мл FBS.
5. Снова центрифугируйте ячейки при 1200 об/мин в течение 5 минут.
6. Наконец, повторно суспендируйте гранулу в 10 мл готовой среды.
7. Налейте суспензию клеток WM793 с маркировкой ⁵¹Cr (10⁵ клеток/мл) в одноразовый резервуар для реагентов.
8. Затем добавьте 100 мкл этих меченых клеток-мишеней в каждую лунку 96-луночного эффекторного клеточного планшета с помощью многоканальной пипетки.
9. Затем добавьте 100 мкл 1% NP-40 (в воду) в ряд лунок, лишенных каких-либо эффекторных клеток (в данном случае ряд H). 1% NP-40 будет лизировать клетки-мишени, и, таким образом, эти лунки будут служить контрольными для определения «общего количества в минуту, или (c. p. m)» или максимального выброса ⁵¹Cr.
10. Закрепите крышку на пластине, добавив небольшой кусочек газопроницаемой ленты с каждой стороны пластины, и поместите кусок радиоактивной ленты на крышку, чтобы указать, что она содержит ⁵¹Cr.
11. Кратко центрифугируйте планшет при 1200 об/мин. Если используется только одна экспериментальная пластина, добавьте в центрифугу балансировочную пластину.
    Примечание: Важно использовать центрифугу с маркировкой для работы с радиоактивными образцами.
12. Снимите пластину с центрифуги.
13. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C с небольшим кусочком свинцового экрана над пластиной для дополнительной безопасности. Инкубировать в течение 16 часов, чтобы обеспечить лизис клеток-мишеней.
    Примечание: Инкубационный период может варьироваться от 4 до 18 часов в зависимости от используемых эффекторных клеток и используемого потенциального механизма убийства.

4. Сбор надосадочной жидкости

1. По окончании инкубационного периода осторожно снимите ленту по краю пластины и снимите крышку.
2. Затем поместите рамку для сбора урожая на тарелку, убедившись, что маленькие фильтрующие диски установлены на месте для каждой из хлопчатобумажных пробок. Это обеспечит сбор бесклеточного надосадочной жидкости.
3. Теперь медленно и аккуратно вдавите ватные пробки в лунки.
4. Примерно через 10 секунд ослабьте давление на ватные пробки, а затем перенесите ватные пробки на трубки.
5. Поместите каждую из этих трубок во вторичную трубку FACS.
6. Наконец, загрузите пробирки FACS на гамма-счетчик и запустите образцы для количественного определения количества ⁵¹Cr, выделяемого в каждом состоянии. Образцы обычно измеряются в течение 1 минуты, что позволяет легко определить «количество в минуту».
7. Внимательно запишите порядок, в котором трубки были загружены в прилавок.

5. Анализ данных

1. В этом случае нестимулированные PBMC были добавлены в первые три столбца, а CpG-стимулированные PBMC (CpG ODN, (1 мкг/мл) в течение 24 ч) были добавлены в столбцы 4-6. Смотрите таблицу 2.

г. г. г. г. г. г. . . г. . г. г. г. . . г. г. г. г. г. . г. г. год . . г. г. г. . г. г. Кабель Кабель г. Кабель Кабель Кабель Кабель Кабель Кабель Кабель Кабель Кабель Эмультация Кабель

	1	2	3	4	5	6	7	8
a	1251	1157	1086	917	1118	1140
В	1832	1986 г	1971 г	No 7629	7913	8180
С	1677	1739 г	1428	No 5454	5055	No 5268
Г	1638	1552	1734 г	No 4239	No 3582	No 3786
Е	1658 г	1580	1339	2818	2623	2750
Ф	1579 г	1472	1483	2028	1779 г	1769 г
Г	1326	1325	1184	1801 г	1654	1565
Ч	9220	9367	8067	8774	9647	8236
я	Среднее значение A1,A2,A3 ->		1164,67	Спонтанное c.p.m		1058.33
J	Среднее значение B1,B2,B3 ->		1929,67	9,91%		7907.33	87.50%	50:1
К	Среднее значение C1,C2,C3 ->		1614.67	5,83%		No 5259	53,67%	25:1
Л	Среднее значение D1,D2,D3 ->		1641.33	6,17%		No 3869	35.91%	12.5:1
М	Среднее значение E1,E2,E3 ->		1525,67	4.68%		2730.33	21,36%	6.25:1
Н	Среднее значение F1,F2,F3 ->		1511.33	4,49%		1858.67	10.22%	3.12:1
О	Среднее значение G1,G2,G3 ->		1278,33	1,47%		1673.33	7,86%	1.56:1
П	Среднее значение H1,H2,H3 ->		8884.67	Максимальный c.p.m.		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-стим PBMC	Соотношение E:T

Таблица 2: ⁵¹данные анализа выброса Cr: значения данных "Counts per minute" / 'c. p. m", средние значения c. p. m и рассчитанные процентные значения специфического лизиса.

2. Собранные данные (количество отсчетов в минуту, т.е. c.p.m) вносились в ячейки электронной таблицы таким же образом, как образцы были разложены в исходной табличке.
3. Сначала были рассчитаны средние значения тройных чисел. Таблица 2 - ячейки I3 - P3, для нестимулированных PBMC и клетки I6 - P6, для CpG-стимулированных PBMC.
4. После определения средних значений процент специфического лизиса для каждого условия был рассчитан по следующей формуле-
   
   
5. Процент специфического лизиса рассчитывали для каждого состояния (табл. 2 - клетки J4 - O4 для нестимулированных PBMC и J7 - O7 для нестимулированных PBMC).