Анализ на клеточную смерть: анализ высвобождения хрома на цитотоксическую способность

В этом видео вы узнаете, как проводить анализ высвобождения хрома и определять цитотоксический потенциал эффекторных клеток.

Иммунные клетки отвечают за выявление и удаление потенциально опасных клеток, таких как раковые или инфицированные вирусом клетки, из организма, что является неотъемлемой частью иммунного ответа. Некоторые иммунные клетки, такие как Т-клетки и NK-клетки, обладают свойством, известным как цитотоксический потенциал, который заключается в способности идентифицировать клетки-мишени и секретировать белки, которые вызывают деградацию белка, лизис и гибель этих клеток-мишеней. Количественная оценка цитотоксического потенциала имеет решающее значение для измерения активации и активности иммунных клеток, и для этой цели обычно используется анализ высвобождения хрома.

Этот метод позволяет сравнивать циотоксичность, индуцированную конкретными типами иммунных клеток в различных условиях, что ценно для изучения иммунотерапии рака и заболеваний, связанных с иммунитетом. Для начала клетки-мишени, такие как раковые клетки, инкубируются с радиоактивным изотопом хром-51, который поглощается клетками. Затем эти радиоактивно меченые клетки культивируют совместно с выделенными представляющими интерес иммунными клетками, также называемыми эффекторными клетками, в круглой нижней 96-луночной пластине для облегчения взаимодействия между двумя типами клеток.

Общая настройка анализа включает в себя инкубацию определенного количества клеток-мишеней с различными концентрациями иммунных клеток, а также соответствующий контроль. Совместное культивирование позволяет эффекторным клеткам индуцировать апоптоз и лизис в клетках-мишенях, что приводит к высвобождению внутриклеточного хрома 51 в надосадочную жидкость. Затем, в заранее оптимизированный момент времени, надосадочная жидкость, содержащая высвобожденный хром, собирается из всех скважин. Хром 51, будучи радиоактивным, спонтанно претерпевает радиоактивный распад, испуская гамма-излучение. Уровни гамма-излучения в надосадочной жидкости из всех лунок в пластине для анализа представляют собой поддающийся количественной оценке результат лизиса клеток-мишеней. Это измеряется с помощью гамма-счетчика, который затем используется для определения цитотоксического потенциала иммунных клеток.

Для начала клетки-мишени, клеточная линия меланомы человека WM793 в данном примере, получают в одноклеточную суспензию. Для этого сначала извлеките среду из колбы для культуры тканей и промойте клетки пятью миллилитрами 1Х ПБС. Сцедите PBS, а затем добавьте в тарелку один миллилитр трипсина примерно на две минуты. Осторожно постучите по колбе, чтобы освободить ячейки от поверхности колбы, а затем добавьте в колбу пять миллилитров среды RPMI. Пипеткой проведите средой вверх и вниз, чтобы собрать клетки, и добавьте эту суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Поместите пробирку в центрифугу на пять минут при 1200 об/мин. Затем извлеките среду из пробирки, следя за тем, чтобы не нарушить клеточную гранулу. Осторожно поверните дно пробирки, чтобы разрушить клеточную гранулу, и добавьте в пробирку 10 миллилитров среды. Затем аккуратно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы привести клетки во взвешенное состояние. Далее определяют концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и переносят два миллилитра исходной клеточной суспензии в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Поместите пробирку в центрифугу и гранулируйте ячейки со скоростью 12 сотен об/мин в течение пяти минут. После центрифугирования вылейте излишки среды из пробирки в контейнер для отходов. Кратковременно проведите вихревую пробирку, чтобы повторно суспендировать клеточную гранулу в небольшом объеме оставшейся среды.

Затем подготовьтесь к использованию Chromium 51, переместившись в лабораторное пространство, предназначенное для этой конкретной радиоактивности. Для безопасного хранения и использования Chromium 51 на всех этапах должна быть достаточная свинцовая защита, а также надлежащие указатели, указывающие, где хранятся образцы с Chromium 51. Счетчик Гейгера, оснащенный блинным щупом, также необходим для подачи в пространство на предмет возможного загрязнения.

После настройки для правильного использования радиоактивности добавьте 100 микрокюри хрома 51 непосредственно в суспензию клетки-мишени. Затем добавьте к трубке небольшой кусочек радиоактивной ленты, чтобы указать, что образец и пробирка теперь радиоактивны. Поместите пробирку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия со свинцовым щитком и инкубируйте в течение часа, переворачивая пробирку каждые 15–20 минут.

Пока целевые клетки мечатся, приготовьте одноклеточную суспензию эффекторных клеток. В этом примере моноядерные клетки периферической крови человека, или PDMC, были выделены из цельной крови методом стандартного центрифугирования с градиентом плотности до концентрации 5 умно-10 на 6-й. Перенесите эту суспензию эффекторных клеток в одноразовый резервуар для реагентов, а затем добавьте по 200 микролитров этой суспензии в каждую лунку ряда В 96-луночной пластине с круглым дном. Затем добавьте по 100 микролитров RPMI в каждую лунку в ряду от C до G пластины.

Теперь начните выполнять последовательные разведения PBMC, чтобы получить диапазон номеров эффекторных клеток, сначала удалив 100 микролитров клеток в лунках в строке B и добавив их в строку C. Затем дополнительно разбавьте эффекторные клетки, перенеся 100 микролитров клеток из строки C в строку D. Продолжайте серийное разведение. Как только строка G будет достигнута, переместите 100 микролитров из лунок, чтобы в каждой лунке этого ряда остался конечный объем в 100 микролитров. Затем добавьте 100 микролитров среды для культивирования тканей в лунки в ряду А, чтобы она служила контролем для спонтанного высвобождения хрома 51 из клеток-мишеней, так как в этот ряд не следует добавлять эффекторные клетки. Затем поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, пока целевые клетки не будут готовы к добавлению.

После инкубационного периода извлеките целевые клетки из инкубатора и промойте 5 миллилитрами FBS, чтобы удалить избыток хрома 51. Затем поместите пробирку в специальную центрифугу и вращайте со скоростью 1200 об/мин в течение 5 минут. Удалите радиоактивную промывку FBS в соответствующий контейнер для отходов и повторите этап промывки, повторно суспензив гранулу в свежих 5 миллилитрах FBS. Поместите пробирку в специальную центрифугу и снова вращайте ячейки со скоростью 1200 об/мин в течение 5 минут. Удалите вторую промойку и проверьте гранулу на включенную радиоактивность с помощью счетчика Гейгера. Наконец, повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах готовой среды и вылейте меченую суспензию клеток-мишеней с хромом 51 в одноразовый резервуар для реагентов. Затем добавьте 100 микролитров этих меченых клеток-мишеней в каждую лунку 96-луночной эффекторной клеточной пластины. Затем добавьте 100 микролитров 1% NP-40 в воду в лунки в ряду H, чтобы лизировать все целевые клетки в каждом ряду. Эти скважины будут использоваться в качестве контрольных для определения общего количества отсчетов в минуту, или cpm.

Теперь, когда пластина подготовлена, закрепите крышку, добавив небольшой кусочек ленты с каждой стороны пластины, и поместите кусок радиоактивной ленты на крышку, чтобы указать, что она содержит хром 51. Затем поместите планшет в центрифугу, предназначенную для работы с радиоактивными образцами. Если используется только одна экспериментальная пластина, добавьте в центрифугу балансировочную пластину. Установите центрифугу на 1200 об/мин и доведите пластину до скорости. Достигнув скорости, остановите машину. Снимите пластину с центрифуги. Затем поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с небольшим кусочком свинцового щита над пластиной для дополнительной безопасности. Инкубируйте в течение 16 часов, чтобы дать клеткам-мишеням возможность лизироваться.

По окончании инкубационного периода осторожно снимите ленту по краю пластины, и снимите крышку. Затем поместите рамку для сбора урожая на тарелку, убедившись, что маленькие фильтрующие диски установлены на месте для каждой из ватных пробок. Теперь медленно и аккуратно вдавите ватные пробки в лунки. Примерно через десять секунд ослабьте давление на ватные пробки, а затем переложите ватные пробки на трубки. Поместите каждую из этих трубок во вторичную трубку FACS. Наконец, загрузите пробирки FACS на гамма-счетчик и запустите выборки, чтобы количественно определить количество хрома-51, выделяемого в каждом состоянии. Внимательно запишите порядок, в котором трубки были загружены в прилавок.

Здесь нестимулированные PBMC были добавлены к первым 3 полосам, а стимулированные CPG PMBC были добавлены к полосам с 4 по 6. В этом примере количество отсчетов в минуту было внесено в ячейки электронной таблицы таким же образом, как образцы были разложены на исходной табличке, и были рассчитаны средние значения трех чисел. Например, для первого условия ячейки А1, А2 и А3 были усреднены в ячейке I3. После того, как средние значения определены, по этой формуле можно рассчитать процент конкретного лизиса для каждого условия. Например, чтобы рассчитать процент специфического лизиса для нестимулированных клеток, которые имели отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням 50 к 1, спонтанный CPM, который в данном примере составляет 1164,67, был вычтен из экспериментального CPM, 1129. 67. Затем это число можно разделить на разницу между максимальным CPM и спонтанным CPM, а затем умножить на 100, чтобы получить процент специфического лизиса. Затем это вычисляется для каждого условия. Затем эти данные могут быть построены на графике, чтобы показать сравнение отношения E к T с процентом специфического лизиса как для нестимулированных PBMC, так и для PBMC, стимулированных CPG. В этом примере эффекторные клетки, стимулированные ЦПГ, более эффективно убивали клетки-мишени по мере увеличения соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Это увеличение не наблюдалось у нестимулированных PBMC, что указывает на необходимость стимуляции CPG для наблюдаемого увеличения лизиса клеток-мишеней.