6.1: Создание колонны Виноградского: способ обогащения видов микробов в пробе отложений

1. Настройка

1. Чтобы создать колонну Виноградского, вам понадобятся некоторые основные припасы:
   • Лопата, ведро и бутылка для сбора проб в поле
   • Вертикальный прозрачный сосуд, такой как градуированный цилиндр или пластиковая бутылка для воды объемом около 1 л
   • Полиэтиленовая пленка и резинки
   • Большие миски для смешивания и большая ложка для перемешивания
   • Источник серы (яичный желток или сульфат кальция)
   • Источник органического углерода (целлюлоза, в виде измельченной газеты)
   • Источник света (солнечное окно или настольная лампа)
   • Почва или грязь, собранные в болоте, водно-болотных угодьях, прудах или ручьях
   • Вода из одной и той же среды обитания
   • Для некоторых необязательных экспериментов, описанных в этом протоколе, потребуется следующее:
     • Соль поваренная
     • Разноцветный целлофан
     • Источник железа (например, гвоздь или стальная вата)
     • Холодильник с источником света
     • Радиатор рядом с источником света
2. Если вы используете пластиковую бутылку из-под воды, отрежьте область горлышка так, чтобы колонна имела цилиндрическую форму. Снимите все обертки, чтобы свет мог проникать через пластик.
3. Сырые яйца могут содержать сальмонеллу, и с ними следует обращаться осторожно. Следует соблюдать правильную технику мытья рук. В качестве альтернативы можно использовать вареное яйцо. Кроме того, нет никакого способа узнать наверняка, загрязнена ли грязь или осадок сточными водами или другими вредными веществами. Перчатки следует использовать при замешивании грязи и установке колонны.

2. Сборка колонны Виноградского

1. С помощью лопаты выкопайте и соберите грязь в ведро. Осадочные породы должны находиться у кромки воды и полностью пропитаться водой. Вам понадобится достаточно грязи, чтобы заполнить каждую колонну Виноградского. Наберите немного воды из того же источника в бутылку для образца (требуется примерно 3000 мл на колонку).
2. В лаборатории налейте достаточно грязи в первую чашу для смешивания, чтобы заполнить ~75% объема колонны объемом 1 литр. Затем просейте их, чтобы удалить крупные камни, ветки или листья, а ложкой разбивайте комки.
3. Добавьте немного воды, которую вы собрали, в миску для смешивания во время помешивания. Добавляйте до тех пор, пока консистенция водно-грязевой смеси не станет похожей на молочный коктейль. Продолжайте следить за тем, чтобы на улице не было комочков.
4. Переложите примерно 1/3 водно-грязевого молочного коктейля во вторую миску. Добавьте яичный желток и горсть измельченной газеты и перемешайте.
5. Добавьте смесь грязи, яичного желтка и газеты в колонку, пока колонка не заполнится примерно на 1/4.
6. Добавляйте в колонку обычную водно-грязевую смесь до тех пор, пока колонка не заполнится примерно на 3/4.
7. Добавьте в колонну дополнительную воду, оставив только небольшое пространство (~ 1/2 дюйма) воздуха сверху.
8. Накройте колонку полиэтиленовой пленкой и закрепите резинкой.
9. Инкубируйте колонку на свету при комнатной температуре.
10. В течение следующих 4-8 недель отслеживайте изменения в столбце Виноградского на предмет развития разноцветных слоев и образования пузырьков, как описано в таблице 1. Кроме того, вы должны записывать время, необходимое для развития различных слоев.

3. Необязательные модификации классической колонны Виноградского

1. Добавьте в собранную грязь 25-50г соли из расчета на 1л колонки Виноградского перед добавлением воды и перемешиванием (шаг 2.3). Добавление соли отбирает галофильные (солелюбивые) бактерии.
2. Альтернативные субстраты, такие как железо, в виде гвоздя или стальной ваты, могут быть добавлены в колонку вместе с яичным желтком и измельченной газетой (шаг 2.4). Это обогатит железоокисляющие бактерии, такие как галлионелла, и будет выглядеть как слой цвета ржавчины.
3. Вместо комнатной температуры (шаг 2.9) колонку можно инкубировать возле радиатора для отбора на теплофильные (теплолюбивые) бактерии или в холодильнике с источником света для отбора на психрофильные (холодолюбивые) бактерии.
4. Количество света, получаемого колонной во время инкубации (шаг 2.9), также можно варьировать, размещая разные колонны при ярком освещении, слабом освещении или в темноте.
5. Длину волны входящего света можно ограничить, накрыв колонну целлофанами с разным затенением во время инкубации (шаг 2.9), чтобы определить, какие цвета выбирают для различных бактериальных групп.

4. Анализ данных

1. Через 1-3 недели должна быть видна некоторая зеленая окраска на вершине грязевого слоя классической колонны Виноградского (рис. 2А). Это первые признаки роста слоя цианобактерий.
2. Со временем продолжайте следить за появлением и эволюцией различных слоев, каждый из которых указывает на различные типы бактерий. подсказка: Обратитесь к Понятиям и Таблице 1, чтобы понять, какие бактерии вносят свой вклад в различные слои.

Рисунок 2А: Фото классической колонны Виноградского, которая инкубировалась при комнатной температуре в течение 21 дня. Обратите внимание на зеленый осадок, указывающий на цианобактерии, в верхней части колонки.

3. Если также были подготовлены модификации классической колонны Виноградского, сравните результаты каждой колонны.
   1. Понаблюдайте за слоями в каждой из измененных колонн Виноградского. Обратите внимание на следующее:
      • Имеют ли колонны одинаковое количество слоев?
      • Слои одинакового цвета и толщины?
      • Залегают ли слои на одной и той же глубине?
      • Сколько времени ушло на разработку каждой колонки?
      • Развивалась ли одна колонна медленнее остальных?

Большинство микроорганизмов Земли не могут быть культивированы в лаборатории, часто потому, что они зависят от других микробов в своих родных сообществах. Колонна Виноградского, названная в честь ее изобретателя Сергея Виноградского, представляет собой миниатюрную замкнутую экосистему, которая обогащает микробные сообщества в образце отложений, позволяя ученым изучать многие микробы, играющие жизненно важную роль в биогеохимических процессах Земли, без необходимости выделять и культивировать их по отдельности.

Как правило, грязь и вода из экосистемы, такой как пруд или болото, смешиваются. В качестве факультативного эксперимента в эту смесь может быть добавлена соль для обогащения различных видов галофилов. Далее небольшая порция смеси дополняется углеродом, обычно в виде целлюлозы из газеты, и серой, обычно из яичного желтка. В качестве еще одного необязательного эксперимента в эту смесь можно добавить ноготь, чтобы обогатить некоторые виды Gallionella. Затем эту новую смесь добавляют в прозрачную колонну так, чтобы колонна была заполнена на одну четверть. Наконец, остальная грязевая смесь и еще больше воды добавляются в колонну, пока она не заполнится до полного заполнения.

Сукцессию, которая относится к последовательному развитию различных микробных сообществ с течением времени, можно наблюдать в режиме реального времени с помощью колонки Виноградского. По мере того, как микробы растут внутри колонны, они потребляют определенные субстраты и изменяют химический состав окружающей среды. Когда их субстраты истощаются, исходные микробы отмирают, и микробы с различными метаболическими потребностями могут процветать в измененной среде. Со временем начинают формироваться заметно различимые слои, каждый из которых содержит части бактериального сообщества с различными потребностями в микросреде.

Например, фотосинтезирующие микробы, в основном состоящие из цианобактерий, образуют зеленые или красно-коричневые слои в верхней части колонны. Поскольку фотосинтез производит кислород, часто наблюдаемый в виде пузырьков в верхней части столба, образуется градиент с самой высокой концентрацией кислорода в верхней части и самой низкой в нижней части. В зависимости от доступных субстратов в анаэробном придонном слое могут расти различные микробные сообщества. Пузырьки в этом слое могут указывать на наличие метаногенов, которые создают газ метан в результате брожения. Здесь микробная ферментация целлюлозы приводит к образованию органических кислот. Сульфатные восстановители окисляют эти кислоты с образованием сульфидов, а их активность проявляется в черном осадке. Сульфид диффундирует вверх по колонне, создавая еще один градиент, где концентрации сульфидов наиболее высоки ближе к нижней части колонны и самые низкие ближе к верху. Ближе к середине колонны окислители серы утилизируют кислород сверху и сульфид снизу. При достаточном освещении развиваются фотосинтезирующие окислители серы, такие как зеленые и фиолетовые серные бактерии. Зеленые серные бактерии хорошо переносят более высокие концентрации сульфидов. Таким образом, они растут непосредственно под фиолетовыми серными бактериями. Непосредственно над этим слоем фиолетовые несерные бактерии образуют красно-оранжевый слой. О нефотосинтезирующих окислителях серы свидетельствует наличие белых нитей.

Такие условия, как освещение и температура, также могут варьироваться для обогащения других сообществ. В этом видео вы узнаете, как построить колонну Виноградского, а также варьировать условия выращивания и субстраты для обогащения конкретных микробных сообществ.

Во-первых, найдите подходящую водную экосистему, например, пруд или болото. Образцы отложений должны поступать из области у кромки воды и быть полностью насыщены водой. Затем с помощью лопаты и ведра соберите один-два литра пропитанной грязи. Затем возьмите примерно три литра пресной воды из того же источника и вернитесь в лабораторию с полевыми образцами.

В лаборатории наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки. Теперь перелейте примерно 750 миллилитров грязи в миску для смешивания. Затем просейте грязь, чтобы удалить большие камни, ветки или листья, и с помощью ложки разбейте любые комки. Далее добавьте немного свежей воды в миску для смешивания и перемешайте большой ложкой. Добавляйте воду до тех пор, пока консистенция водно-грязевой смеси не станет похожей на молочный коктейль. Продолжайте следить за тем, чтобы на улице не было комочков.

В качестве дополнительного эксперимента выберите галофильные бактерии, добавив от 25 до 50 миллиграммов соли в грязевую смесь.

Затем переложите примерно 1/3 водно-грязевой смеси во вторую миску для смешивания. Добавьте в миску один яичный желток и горсть измельченной газеты. Далее добавляем эту смесь в столбик, пока она не заполнится примерно на 1/4. Далее добавьте водно-грязевую смесь без яйца и газеты в колонку, пока она не заполнится примерно на 3/4. Затем добавьте еще воды в колонну, оставив сверху пространство 1/2 дюйма. Накройте колонку полиэтиленовой пленкой и закрепите ее резинкой.

Инкубируйте столбик на свету возле окна при комнатной температуре в течение следующих четырех-восьми недель. На протяжении всего инкубационного периода не реже одного раза в неделю следите за изменениями в столбике Виноградского на предмет развития разноцветных слоев и образования пузырьков. Кроме того, запишите время, необходимое для проявления различных слоев.

Еще одна модификация, которую можно сделать, — это инкубация колонны возле радиатора для отбора термофильных бактерий или в холодильнике для отбора психрофильных бактерий. Изменяйте условия освещения, размещая разные колонны при ярком освещении, слабом освещении или в темноте для инкубации. В качестве альтернативы можно ограничить длину волны входящего света, покрыв колонку целлофаном разных оттенков, чтобы определить, какие цвета выбирают для разных бактериальных групп. Для еще одного необязательного эксперимента, чтобы обогатить железоокисляющие бактерии, добавьте гвоздь в смесь грязи и воды перед добавлением газеты и яичного желтка.

Через одну-две недели о росте слоя цианобактерий свидетельствует зеленая или красно-коричневая пленка поверх грязевого слоя классической колонны Виноградского. С течением времени наблюдается внешний вид и эволюция различных слоев, каждый из которых указывает на различные типы присутствующих бактерий. Сравнивая колонну, выращенную в темноте, с традиционной колонной Виноградского, мы видим, что темная обработка дает черный слой в нижней части колонны, что указывает на сульфатредуцирующие бактерии.

Темная колонна также может давать другие несушки, в зависимости от других условий инкубации. Кроме того, темный столбец не дает ни зеленого слоя цианобактерий, ни красного, фиолетового или зеленого слоев, указывающих на фиолетовые несерные, фиолетовые серные и зеленые серные бактерии соответственно. Рост этих групп зависит от света.