Серийные разведения и осаждение: микробиологическое перечисление

1. Настройка

1. Блок-схема с перечислением всех материалов, пошаговым протоколом эксперимента и методом утилизации материалов должна быть записана в лабораторном блокноте и храниться рядом с экспериментальным рабочим местом.
2. Рабочие места должны быть стерилизованы соответствующим антисептиком (70% этанола), а экспериментатор должен снизить риск загрязнения, надев чистую лабораторную одежду, которая также защищает их от аномалий воздействия. Подходящая одежда включает, помимо прочего, лабораторный халат, латексные или нитриловые перчатки, гуглы, респираторы и закрытую обувь. Очень важно всегда поддерживать асептическую технику.
3. Приготовьте 90 мл 0,45% физиологического раствора. С помощью чистого мерного цилиндра отмерьте 90 мл стерильной воды и перелейте ее в чистую колбу Эрленмейера с маркировкой 0,45% физиологического раствора. Взвесьте 0,405 г хлорида натрия (Sigma-Aldrich NaCl S9888) и добавьте его в колбу с маркировкой 0,45% физиологического раствора. Перемешивайте до тех пор, пока не останется видимого растворенного вещества.
4. По завершении экспериментатор должен повторно простерилизовать все поверхности и отбросить все нежелательные организмы, запасы разбавителя, чашки Петри или одноразовые инокуляционные петли в соответствии с рекомендациями OSHA. Лабораторную одежду можно снимать перед мытьем рук.

2. Подготовка СМИ

1. Подбирайте среды, которые подходят для культивирования нужного организма. В большинстве сценариев бульон обеспечит достаточный рост бактерий. Поскольку здесь желательны организмы из протокола Виноградского, была собрана колонка, состоящая из карбоната кальция, серы, целлюлозы и грязи, и оставлена в покое на 7 дней. Указанная колонна разделена на аэробный, микроаэрофильный и анаэробный участки.
2. Выберите среду, подходящую для осаждения интересующего организма. В качестве отвердителя обычно используется добавка в жидкую среду микробиологическим агаром. ЛБ среда/агар достаточна при отборе проб из аэробной, микроаэрофильной и анаэробной областей указанной колонны. Примечание: Образцы из микроаэрофильной области не отбирались для этой процедуры. Тем не менее, эти организмы следует культивировать в банках со свечами. Введение свечи в эту камеру выращивания перед запечатыванием создает среду с низким содержанием кислорода, подходящую для микроаэрофильной пролиферации.
3. Поскольку мы хотим приготовить 250 мл, используйте колбы Эрленмейера объемом 500 мл (или больше), чтобы предотвратить выкипание при автоклавировании. Подпишите одну "Бульон", а другую "Агар".
4. Определите количество среды, необходимое для создания каждого раствора, следуя рекомендациям производителя по концентрации. Используемый здесь агар LB готовится путем смешивания 25 г/л со сверхчистой водой. Для нашего объема 250 мл требуется раствор из 6,25 фунта агара/250 мл воды. Аналогичным образом, бульон LB готовится путем смешивания того же соотношения бульона LB и воды. Поскольку он не дополнен затвердевающим веществом, он не затвердевает при охлаждении.
5. Взвесьте среду и смешайте ее с водой в пропорциях, соответствующих рекомендациям производителя. Добавьте 6,25 г LB Agar в колбу с надписью «Agar» и 6,25 г LB Broth в колбу с надписью «Broth». Добавьте по 250 мл сверхчистой воды в каждую колбу.
6. Оберните каждую колбу алюминиевой фольгой и стерилизуйте среду в автоклаве не менее 15 минут при температуре 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм.
7. Используя термостойкую перчатку или прокладку, после завершения цикла извлеките колбы из автоклава и поместите их на водяную баню при температуре 40-50°C.
8. Как только будет достигнута соответствующая температура, вылейте содержимое колбы с надписью «Бульон» в колбу Эрленмейера объемом 250 мл или колбу с круглым дном. Пометьте колбу объемом 250 мл "solution₀".
9. Приобретите стерильные чашки Петри размером 10 x 15 мм размером 10 x 15 мм и промаркируйте их датой, названием, типом используемой среды и зоной колонны Виноградского, из которой будут собираться организмы.
10. Снимите колбу с надписью «Агар» с водяной бани и начните наливать в каждую из 10 чашек Петри. В каждое блюдо следует добавлять не более 15 мл. Это также можно сделать с помощью пипетки и серологической пипетки объемом 25 мл для повышения точности. Используйте стерильный наконечник для пипетки, чтобы удалить все присутствующие пузырьки, а затем накройте крышками пластин и оставьте застывать на ночь.

3. Получение разбавителя

1. Подготовьте десять пробирок, способных хранить 20 мл и более, в штативе и пометьте их маркировкой Т1-Т10. Номер каждой пробирки согласуется с коэффициентом разбавления, которому он соответствует (т.е. T4 = 1x10^-4 или 0,0001 или 1/10 000 от исходной концентрации).
2. Пипет 9 мл 0,45% физиологического раствора в каждую из 10 пробирок.
3. Солевые заготовки теперь готовы к стерилизации автоклавом. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы покрыть каждую из 10 пробирок, а затем переложите их на штатив для пробирок, совместимый с автоклавом. Стерилизовать не менее 15 минут при температуре 121°C, 15 фунтов на квадратный дюйм.
4. Снимите заготовки в термостойких перчатках и дайте остыть. Накройте крышкой и храните при температуре 4°C до тех пор, пока пробирки не нагреются до комнатной температуры или когда они остынут на ощупь.

4. Культивирование целевого организма

1. Инокулируйте "раствор₀" с одной колонией из предварительно покрытой прожилками пластины или 50 μл замороженного поголовья. Дайте целевому организму время для репликации, поместив инокулированный «раствор₀» в инкубатор при температуре 37°C на ночь с встряхиванием (при необходимости). (Примечание: Во избежание загрязнения колба должна быть закрыта. Если целевой организм является аэробным, используйте стерильную марлю и ватные пробки для предотвращения загрязнения. Если вы оцениваете области столбца Виноградского, просто удалите по 1 грамму из каждой желаемой зоны (аэробной и анаэробной для целей данного исследования) и ресуспендируйте в Т1, прежде чем переходить к шагу 5.3.

5. Серийное разведение

1. Достаньте из инкубатора колбу с надписью «Питательный бульон» и энергично встряхните.
2. Впрыскивайте 1 мл "раствора₀" в пробирку с маркировкой Т1. Вихрь Т1. Если вы оцениваете экспланты Виноградского, взвесьте 1 грамм нужной зоны и добавьте ее к Т1 перед вортексом. (Примечание: 1 мл здесь используется для простоты - также можно использовать меньшие или большие объемы разбавителя).
3. Удалите 1 мл из пробирки Т1 и добавьте его в пробирку Т2. Вихрь Т2.
4. Удалите 1 мл из пробирки Т2 и добавьте его в пробирку Т3. Вихрь Т3.
5. Удалите 1 мл из пробирки Т3 и добавьте его в пробирку Т4. Вихрь Т4.
6. Извлеките 1 мл из пробирки Т4 и добавьте его в пробирку Т5. Вихрь Т5.
7. Извлеките 1 мл из пробирки Т5 и добавьте его в пробирку Т6. Вихрь Т6.
8. Удалите 1 мл из пробирки Т6 и добавьте его в пробирку Т7. Вихрь Т7.
9. Удалите 1 мл из пробирки Т7 и добавьте его в пробирку Т8. Вихрь Т8.
10. Удалите 1 мл из пробирки Т8 и добавьте его в пробирку Т9. Вихрь Т9.
11. Удалите 1 мл из пробирки Т9 и добавьте его в пробирку Т10.

6. Покрытие разворота

1. Нанесите 100 мкл разведенного образца из Т1 непосредственно на чашку Петри. Этот шаг можно, но не обязательно, повторять для каждой трубки.
2. Приобретите стерильный одноразовый стержень для распыления или простерилизуйте стеклянный стержень. Двигаясь по часовой стрелке/против часовой стрелки, скользите горизонтальной частью разбрасывающего стержня, чтобы равномерно распределить образец внутри чашки Петри.
3. Повторите для каждой зоны колонны Виноградского, которая должна быть оценена.
4. Инкубируйте планшеты в инкубаторе при температуре 37°C в течение 24 часов. Для анаэробных организмов используют анаэробную камеру.

7. Полосы

1. Выберите подходящее разведение вашего целевого организма. Например, раствор₄ даст 1/10 000-е разведение от вашей первоначальной концентрации. Как правило, для перечисления микробов оцениваются разведения 1/1 000^th (T3/раствор), 1/1 000 000^th (T6/Solution₆) и 1/1 000 000 000^th (T9/Solution₉).
2. Используя пластиковую стерильную одноразовую инокуляционную петлю или многоразовую металлическую инокуляционную петлю, которая находилась под огнем не менее 10 секунд, погрузите в нужный раствор из шага 5. Откалиброванные посевные петли должны пропускать 0,01 мл. (Внимание: не позволяйте сгоревшей петле контактировать с бактериями сразу после снятия с огня)
3. Слегка приподнимите крышку чашки Петри с одной стороны, чтобы только петля для прививки могла получить доступ к агару. Проведите петлей для прививки по верхней части фильтрующего материала зигзагообразным образом, стараясь не повредить агар. Опустите крышку чашки Петри.
4. Используйте новую одноразовую петлю для прививки или повторно простерилизуйте многоразовую петлю.
5. Поверните пластину примерно на 1/3^rd (~118°) и уменьшите частоту зигзагообразного движения.
6. Опять же, используйте новую одноразовую петлю или повторно простерилизуйте металлическую петлю перед последним вращением и снова уменьшите частоту зигзага. Опустите крышку чашки Петри.
7. Повторяйте шаги 7.2 - 7.6 до тех пор, пока по крайней мере три чашки Петри не будут проточены для трех различных разведений, используя новую одноразовую петлю или повторно обжигая многоразовую петлю (Рисунок 2).
8. Поместите чашки Петри с прожилками в инкубатор с температурой 37°C на ночь. Для анаэробных организмов используют анаэробную камеру.

8. Анализ данных и результаты

1. Культуры собирали из кислородной и бескислородной зон 7-дневной виноградской колонны. Эти зоны пригодны для гетеротрофных и железоокисляющих анаэробов соответственно.
2. Колоночные экспланты последовательно разбавляли перед нанесением полос или распылением на пластины LB Agar.
3. Стрикинг выявил смешанную популяцию из каждой из оцениваемых зон Виноградского. Раскладные тарелки дали аналогичные результаты.
4. Чтобы рассчитать КОЕ/мл или КОЕ/г, усредните количество подсчитанных колоний из трех планшетов. Умножьте среднее количество колоний на коэффициент разбавления и разделите на количество аликвот. Например, если в среднем 65 колоний были подсчитаны на планшетах, инокулированных 0,1 мл раствора₆} (T6), то описанная ранее формула будет равна 650 000 000 КОЕ/мл.
5. Изолированные колонии теперь могут быть выбраны из каждой пластины для использования в анализах обогащения для определения видовой идентичности.