6.3: Обогащение культур: культивирование аэробных и анаэробных микробов на селективных и дифференциальных средах

1. Подготовка

1. Прежде чем начать, тщательно вымойте руки и наденьте перчатки соответствующего размера.
2. Рабочую поверхность простерилизовать 5% гипохлоритом натрия (отбеливателем) и тщательно высушить.
3. Поместите петлю для прививки в пустую колбу Эрленмейера объемом 120 мл так, чтобы она не касалась столешницы во время работы.

2. Среда роста и культуры

1. Соберите из холодильника четыре тарелки солевого агара маннита (MSA), метиленового синего агара эозина (EMB) и восемь триптических соевых агаров (TSA) (их можно купить в магазине).
2. Поместите пластины на очищенную рабочую зону.
3. Соберите следующие отварные культуры: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и Proteus vulgaris. Соблюдайте осторожность: поскольку это аэробные организмы, крышки трубок должны быть слегка ослаблены.
4. Поместите все культуры в штатив для пробирок на очищенную рабочую поверхность.

3. Перенос культур и инкубация

1. Встаньте или сядьте на скамейку, имея все материалы под рукой.
2. Чтобы использовать асептический метод для переноса бактерий на пластину, сначала обжарьте петлю, пока она не начнет светиться оранжевым цветом, а затем дайте ей остыть на воздухе.
3. Пока петля остывает, возьмите отвар культуры кишечной палочки, а затем откройте крышку с помощью мизинца.
4. Быстро прокалите отверстие трубки. Это предотвращает загрязнение.
5. Опустите петлю в трубку и поместите микроорганизм на первый квадрант пластины EMB.
6. После того, как будет выполнена первая полоса, зажгите петлю, а затем выполните вторую полосу, пересекающую первую полосу только один или два раза. Это позволит изолировать одну колонию и определить, есть ли какое-либо загрязнение.
7. Повторяйте это до тех пор, пока все четыре квадранта пластины не будут покрыты полосами.
8. Теперь перенесите каждый из остальных четырех организмов таким же образом, чтобы конечным продуктом была одна пластина MSA, одна пластина EMB и две отдельные пластины TSA на организм.
9. После того, как все организмы будут перенесены, разожгите петлю в последний раз и уберите ее.
10. Поместите по 1 тарелке TSA с каждым организмом в газовый пакет, а затем встряхните пакетик с газом, прежде чем поместить его в камеру вместе с пластинами. Плотно закройте.
11. Инкубируйте все планшеты при температуре 37°C в течение ночи.
12. Простерилизуйте рабочую поверхность в последний раз 5% отбеливателем.

4. Чтение и запись результатов

1. Извлеките планшеты из инкубатора и поставьте их на чистый лабораторный стол
2. Обратите внимание на рост организмов на каждой пластине в вашей лабораторной тетради. В частности, сделайте подробные заметки по следующим вопросам:
   1. Количество и размер колоний (если таковые имеются) на каждой пластине, для каждого штамма с покрытием
   2. Внешний вид агара вокруг любых колоний, растущих на пластинах МСА
   3. Появление любых колоний, растущих на пластинах EMB
   4. Различия в росте между планшетами TSA, выращенными снаружи и внутри газовой упаковки

Бактерии способны населять практически любую среду на Земле, от пустынной тундры до тропических лесов. Эта способность колонизировать совершенно разные ниши обусловлена их приспособляемостью и огромным метаболическим разнообразием, что позволяет им использовать широкий спектр молекул для производства энергии. Именно это огромное разнообразие приводит к тому, что менее 1% видов бактерий на планете считаются пригодными для культивирования, и это возможно только благодаря пониманию их специфических метаболических и экологических потребностей.

Выполнение манипуляций со средой и окружающей средой в лаборатории не только позволяет исследователям экспериментировать с поиском оптимальных условий для культивирования интересующего вида, но и обеспечивает обогащение, процесс изменения условий для отбора конкретных видов из смешанной культуры. Некоторые виды микробов являются универсалами и способны переносить широкий спектр состояний или сред. Такие организмы могут легко расти в лабораторных условиях, но их рост также может быть предотвращен, если предоставить им экстремальную среду обитания, что может помочь, если цель состоит в том, чтобы обогатить организмы из смешанной культуры, которые толерантны к этим условиям.

Привередливые организмы могут быть культивируемыми, но только при соблюдении определенных условий. Например, для видов Neisseria или Haemophilus требуется среда, содержащая частично расщепленные эритроциты и высокую концентрацию углекислого газа, что также может препятствовать росту других видов. Экстремофилы названы так за их предпочтение экстремальных условий, таких как очень низкие или высокие температуры, условия пониженного или отсутствующего кислорода, а также в присутствии высокого содержания соли. Эти условия, вероятно, невыносимы для большинства других микробов.

Для дальнейшего обогащения интересующего организма некоторые типы сред содержат индикаторы, которые дают представление о метаболизме организма. Маннитовый солевой агар подавляет рост организмов, чувствительных к высокому содержанию соли. Грамотрицательные бактерии обычно не могут выжить, но грамположительные стафилококки могут процветать. Кроме того, агар MSA указывает на любые колонии, способные ферментировать маннит, потому что кислые побочные продукты ферментации превращают метиловый красный индикатор в среде в ярко-желтый цвет. Это может позволить более конкретный выбор вида.

Другая распространенная среда для обогащения, эозин метиленовый синий, содержит эозин и метиленовый синий красители, которые токсичны для грамположительных организмов. Он также содержит лактозу и бактерии на этих пластинах, которые могут ферментировать, это приведет к образованию кислот, которые снижают pH, способствуя поглощению красителя. Эти колонии поглощают большое количество пигмента и выглядят темными и металлическими. В этой лаборатории вы будете выращивать четыре различных тестовых организма в трех различных средах, а затем в аэробных и анаэробных условиях, прежде чем наблюдать за их развитием.

Перед началом эксперимента тщательно вымойте руки и высушите их, прежде чем надеть лабораторные перчатки соответствующего размера. Затем простерилизуйте рабочую поверхность 5% отбеливателем, тщательно протерев ее. Далее возьмите стерильную петлю для прививки и поместите ее ручкой вниз в пустую колбу объемом 125 миллилитров так, чтобы она не касалась поверхности скамейки. Затем достаньте из холодильника четыре тарелки маннитового солевого агара, или MSA, четыре тарелки агара Eosin Methylene Blue, EMB, и восемь тарелок триптического соевого агара, или TSA. Среда TSA является неселективной средой для выращивания, которая будет использоваться для двух различных условий окружающей среды. Наконец, соберите интересующие вас культуры в штативе для пробирок. Здесь будут выращивать кишечную палочку, золотистый стафилококк, эпидермис стафилококк и протей обыкновенный.

Для начала зажгите горелку Бунзена, которая будет использоваться для стерилизации инструментов. Затем поместите под рукой одну пластину MSA, одну пластину EMB и две пластины TSA. Затем выберите одну из бактериальных культур. Вы привите все четыре эти пластины первой культурой. Свободной рукой возьмите петлю для прививки, а затем стерилизуйте ее в пламени горелки до тех пор, пока она не начнет светиться оранжевым цветом в течение пары секунд. Дайте петле остыть на воздухе. Затем откройте трубку для бульона и быстро прокалите отверстие. Окуните петлю в культуру, а затем нанесите микроорганизм на первый квадрант первой пластины. Затем снова простерилизуйте петлю пламенем и прорежьте второй квадрант. Повторите это действие стерилизации пламенем, а затем полос, чтобы завершить третий и четвертый квадранты. Полосатизация таким образом должна дать изолированные колонии, а также подтвердить, что культура не заражена.

Теперь установите крышку на место и наклейте на дно пластины название бактерии, тип носителя, дату и ваши инициалы. Затем повторите нанесение полос с использованием одной и той же бактериальной культуры для каждой из оставшихся трех пластин, каждый раз стараясь маркировать их. Теперь, когда первая культура прожила, повторите эти шаги для других бактерий, чтобы получить одну инокулированную пластину MSA, одну пластину EMB и две пластины TSA для каждого вида. После того, как все организмы будут перенесены, разожгите петлю в последний раз.

Чтобы определить, какие организмы могут расти в среде с пониженным содержанием кислорода, откройте герметичную газовую камеру и поместите внутрь один набор из четырех бактериальных планшетов TSA. Затем поместите в камеру пакетик с анаэробным кондиционированием и плотно закройте его. Наконец, поместите все пластины, в том числе те, которые находятся внутри герметичной газовой камеры, в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. В дальнейшем проверяйте планшеты каждые 24-48 часов, чтобы дать колониям время для роста и метаболизма любых индикаторных реагентов.

Чтобы оценить, насколько хорошо различные виды бактерий реагировали на каждое условие роста, сначала изучите планшеты на предмет роста и запишите, какие виды были способны производить колонии на каждом типе среды и в анаэробных и аэробных условиях. Обратите внимание на цвет растущих организмов, а также на размеры и форму колоний.

Среда солевого агара маннита селективна к грамположительным организмам, способным выживать в 6. 5% хлорида натрия. В данном эксперименте это означало, что грамотрицательные E. coli и P. vulgaris не росли из-за высоких концентраций соли. Однако S. epidermis и S. aureus смогли вырасти, подтвердив, что они грамположительны. Кроме того, существует явная разница между этими двумя видами, потому что S. aureus способен ферментировать маннит, превращая метиловый красный индикатор в среде в ярко-желтый цвет из-за кислотных побочных продуктов брожения. В случае S. epidermis этого не наблюдалось.

Среда ЭМБ, с другой стороны, является селективной для грамотрицательных организмов, потому что красители эозина и метиленового синего токсичны для грамположительных клеток. Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий предотвращает проникновение этих токсичных красителей в клетки, что означает, что они способны расти. Кроме того, эта среда указывает на то, способен ли присутствующий вид бактерий ферментировать лактозу. Здесь колонии кишечной палочки приобретают темно-фиолетовый цвет, иногда с зеленым металлическим блеском, указывающим на ферментацию. P. vulgaris растет на этой среде, но не ферментирует лактозу и поэтому приобретает светло-розоватый или фиолетовый оттенок от присутствия красителя. В анаэробных условиях виды бактерий на средах TSA все еще должны расти, но могут делать это очень плохо по сравнению с теми, которые имеют достаточное количество кислорода. Это связано с тем, что ни один из испытуемых видов не является облигатным анаэробом.

Подобные эксперименты по обогащению среды роста могут помочь выделить конкретный вид из смешанной выборки. Они также могут помочь определить оптимальные условия роста для различных видов бактерий в лабораторных условиях, тем самым способствуя дальнейшим исследованиям.