Чистые культуры и покрытие полос: выделение одиночных колоний бактерий из смешанной пробы

1. Настройка

1. Со всеми микробами следует обращаться так, как будто они опасны. Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки, завязывайте длинные волосы и следите за тем, чтобы любые раны были особенно хорошо защищены.
2. Подготовьте рабочее место, стерилизовав его с помощью 70% этанола.
3. Убедитесь, что агаровые планшеты, раствор (растворы) для образцов и либо коробка с предварительно стерилизованными пластиковыми петлями для инокуляции, либо металлическая петля и пламя Бунзена находятся под рукой. Одноразовые пластиковые петли обычно проходят предварительную стерилизацию. Металлические петли следует окунуть в 70% этанол, а затем держать рядом с синей областью пламени Бунзена и нагреть до раскаленного состояния. Дайте проволоке остыть, приподняв крышку пластины (лишь немного, чтобы предотвратить загрязнение) и постучав ею по застывшей среде.
4. Завершайте каждую процедуру повторной стерилизацией рабочего места и тщательным мытьем/стерилизацией рук и запястий.

2. Протокол

1. Подготовка сред
   1. Определите и приготовьте твердую среду (обычно содержащую 1,5% (по массе) агара), которая будет поддерживать используемый вид/штамм бактерий. Смешайте среду в бутылке, способной вместить в два раза больше конечного объема, чтобы избежать переполнения при автоклавировании.
   2. Простерилизуйте среду, поместив бутылку с полузатянутой крышкой в автоклав, установленный на 121°C, на 20 минут.
   3. Как следует закройте крышку, как только бутылка будет извлечена из автоклава. Если фильтрующий материал будет использоваться в ближайшее время, поместите бутылку на водяную баню, установленную на 45°C, чтобы сохранить ее в жидком состоянии. В противном случае агар затвердеет при температуре ниже 32-40°C, а затем может быть повторно нагрет (обычно с помощью микроволновой печи) до температуры плавления при 85°C.
2. Подготовка культуральной тарелки (планшетов)
   1. Отметьте основание стерильных чашек Петри (обычно 100 x 15 мм) сбоку или снизу именем экспериментатора, датой и типом носителя.
   2. Налейте 20-25 мл питательной среды для агара 45°C (предварительно приготовленной) в каждую из маркированных пластин. Если по краям появилась пена, ее следует быстро удалить с помощью обычной пипетки и стерильного наконечника.
   3. Немедленно закройте посуду всеми крышками, чтобы предотвратить загрязнение.
   4. Дайте агару застыть в течение примерно 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C. После схватывания бактериальные планшеты следует хранить в перевернутом виде при температуре 4°C, чтобы свести к минимуму образование конденсата на поверхности среды.
3. Покрытие полос
   1. Погрузите стерильную петлю в желаемый инокулянт и немедленно диспергируйте собранный образец на первом квадранте пластины с помощью зигзагообразного движения (рис. 1, I).
   2. Закройте крышку и повторно простерилизуйте петлю для прививки или соберите новую стерильную одноразовую петлю.
   3. Сделайте 3-4 штриха, расходящихся от первого квадранта (содержащего относительно плотную бактериальную популяцию) ко второму квадранту пластины (рис. 1, II).
   4. Закройте крышку и повторно простерилизуйте петлю для прививки или выбросьте одноразовую петлю и соберите новую стерильную.
   5. Повторите эту полосу из 3-4 штрихов из второго в третий квадрант, а затем из третьего в четвертый квадрант, каждый раз используя стерильную петлю (Рисунок 1, III - IV).
   6. Используя стерильную петлю, сделайте один последний зигзагообразный ход от четвертого квадранта к середине пластины (Рисунок 1, V). Распространенность бактерий в этой области будет ниже, что в идеале позволит создать отдельные колонии из одной жизнеспособной материнской клетки.
   7. Закройте крышку и (если этого требует вид бактерий) закройте парапленкой, чтобы предотвратить поступление воздуха.
   8. В зависимости от вида/штамма бактерий поместите культуральный планшет вверх ногами в подходящую среду и инкубируйте до тех пор, пока не станут видны колонии бактерий (отдельные колонии могут появиться в любой области планшета, поскольку начальная концентрация может варьироваться).
   9. Чтобы создать клональную бактериальную популяцию, прорежьте еще одну пластину, заменив инокулюм, нанесенный на исходную пластину, на клетки, выделенные из одной колонии исходной пластины.