6.4: Чистые культуры и покрытие полос: выделение одиночных колоний бактерий из смешанной пробы

1. Настройка

1. Со всеми микробами следует обращаться так, как будто они опасны. Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки, завязывайте длинные волосы и следите за тем, чтобы любые раны были особенно хорошо защищены.
2. Подготовьте рабочее место, стерилизовав его с помощью 70% этанола.
3. Убедитесь, что агаровые планшеты, раствор (растворы) для образцов и либо коробка с предварительно стерилизованными пластиковыми петлями для инокуляции, либо металлическая петля и пламя Бунзена находятся под рукой. Одноразовые пластиковые петли обычно проходят предварительную стерилизацию. Металлические петли следует окунуть в 70% этанол, а затем держать рядом с синей областью пламени Бунзена и нагреть до раскаленного состояния. Дайте проволоке остыть, приподняв крышку пластины (лишь немного, чтобы предотвратить загрязнение) и постучав ею по застывшей среде.
4. Завершайте каждую процедуру повторной стерилизацией рабочего места и тщательным мытьем/стерилизацией рук и запястий.

2. Протокол

1. Подготовка сред
   1. Определите и приготовьте твердую среду (обычно содержащую 1,5% (по массе) агара), которая будет поддерживать используемый вид/штамм бактерий. Смешайте среду в бутылке, способной вместить в два раза больше конечного объема, чтобы избежать переполнения при автоклавировании.
   2. Простерилизуйте среду, поместив бутылку с полузатянутой крышкой в автоклав, установленный на 121°C, на 20 минут.
   3. Как следует закройте крышку, как только бутылка будет извлечена из автоклава. Если фильтрующий материал будет использоваться в ближайшее время, поместите бутылку на водяную баню, установленную на 45°C, чтобы сохранить ее в жидком состоянии. В противном случае агар затвердеет при температуре ниже 32-40°C, а затем может быть повторно нагрет (обычно с помощью микроволновой печи) до температуры плавления при 85°C.
2. Подготовка культуральной тарелки (планшетов)
   1. Отметьте основание стерильных чашек Петри (обычно 100 x 15 мм) сбоку или снизу именем экспериментатора, датой и типом носителя.
   2. Налейте 20-25 мл питательной среды для агара 45°C (предварительно приготовленной) в каждую из маркированных пластин. Если по краям появилась пена, ее следует быстро удалить с помощью обычной пипетки и стерильного наконечника.
   3. Немедленно закройте посуду всеми крышками, чтобы предотвратить загрязнение.
   4. Дайте агару застыть в течение примерно 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C. После схватывания бактериальные планшеты следует хранить в перевернутом виде при температуре 4°C, чтобы свести к минимуму образование конденсата на поверхности среды.
3. Покрытие полос
   1. Погрузите стерильную петлю в желаемый инокулянт и немедленно диспергируйте собранный образец на первом квадранте пластины с помощью зигзагообразного движения (рис. 1, I).
   2. Закройте крышку и повторно простерилизуйте петлю для прививки или соберите новую стерильную одноразовую петлю.
   3. Сделайте 3-4 штриха, расходящихся от первого квадранта (содержащего относительно плотную бактериальную популяцию) ко второму квадранту пластины (рис. 1, II).
   4. Закройте крышку и повторно простерилизуйте петлю для прививки или выбросьте одноразовую петлю и соберите новую стерильную.
   5. Повторите эту полосу из 3-4 штрихов из второго в третий квадрант, а затем из третьего в четвертый квадрант, каждый раз используя стерильную петлю (Рисунок 1, III - IV).
   6. Используя стерильную петлю, сделайте один последний зигзагообразный ход от четвертого квадранта к середине пластины (Рисунок 1, V). Распространенность бактерий в этой области будет ниже, что в идеале позволит создать отдельные колонии из одной жизнеспособной материнской клетки.
   7. Закройте крышку и (если этого требует вид бактерий) закройте парапленкой, чтобы предотвратить поступление воздуха.
   8. В зависимости от вида/штамма бактерий поместите культуральный планшет вверх ногами в подходящую среду и инкубируйте до тех пор, пока не станут видны колонии бактерий (отдельные колонии могут появиться в любой области планшета, поскольку начальная концентрация может варьироваться).
   9. Чтобы создать клональную бактериальную популяцию, прорежьте еще одну пластину, заменив инокулюм, нанесенный на исходную пластину, на клетки, выделенные из одной колонии исходной пластины.

В чашке Петри, если одна бактерия подвергается нескольким раундам бесполого размножения, это приведет к образованию клональной колонии. Тем не менее, получение одной бактерии из смешанного образца, такого как почвенная суспензия, может быть затруднено. Если взять одну петлю этой гетерогенной культуры, она может содержать до одного триллиона отдельных бактерий. Чтобы распространить такое количество бактерий на поверхность агаровой пластины и получить одну колонию, даже используя зигзагообразную схему, петлю нужно было бы непрерывно провести по поверхности достаточного количества пластин, расположенных рядом, чтобы окружить весь остров Свободы. Очевидно, что ученые на самом деле не используют так много пластин. Вместо этого они используют технику, называемую покрытием полос.

Метод полосовой пластины основан на прогрессивном разбавлении бактериального образца и выполняется на поверхности твердой среды одной чашки Петри. Для начала поверхность носителя визуально делится на пять секций, назначая четыре фрагмента окружности в качестве первых четырех секций, а центр пластины — в качестве пятого. Это позволит эффективно создать пять медиатарелок из одной чашки Петри. Затем, используя петлю с желаемым инокулюмом, первый участок просекается зигзагообразным узором. Затем либо используется новая одноразовая петля, либо, в случае с проволочной петлей, ее стерилизуют бунзеновской горелкой, поджигая до тех пор, пока она не раскалится докрасна по длине провода. Это использование новой петли, или петли пламенной стерилизации, удаляет любые оставшиеся бактериальные клетки, способствуя разведению бактерий. Затем горячий контур охлаждается на воздухе в течение нескольких секунд, прежде чем его протащат через первую секцию, чтобы создать три-четыре отдельные линии, каждая из которых несет только часть бактерий во вторую секцию. Остальные секции проделываются таким же образом, каждый раз используя стерильную петлю и один проход через предыдущую полосу.

Используя этот цикл стрижки и стерилизации, концентрацию бактерий в каждой последующей секции следует разбавлять таким образом, чтобы в последней секции содержалось всего несколько дискретно расположенных бактерий. После инкубации эти дискретные бактерии размножаются, образуя изолированные клональные колонии дочерних клеток, которые называются колониеобразующими единицами, или КОЕ. Они могут быть собраны и повторно обработаны, чтобы гарантировать, что последующая работа включает только один тип бактерий, называемый чистой культурой. Помимо выделения отдельных колоний из смешанной бактериальной культуры, метод полосового покрытия также используется для отбора штаммов, специфичных для среды, определения морфологии бактериальных колоний или идентификации различных видов бактерий. В этом видео мы продемонстрируем, как выделить колонии одиночных бактерий из суспензии образца смешанных бактерий с помощью метода полосового покрытия.

Для начала наденьте лабораторные перчатки и халат. Далее простерилизуйте рабочее место с использованием 70% этанола. Затем выберите подходящую среду, которая будет поддерживать используемые виды бактерий или штаммы, и начните приготовление среды. Здесь обычный агар LB готовится путем взвешивания десяти граммов предварительно разработанной порошкообразной среды и 7,5 граммов агара. Добавьте взвешенные, высушенные компоненты в стеклянную бутылку, которая способна вместить в два раза больше конечного объема, чтобы избежать переполнения. Затем добавьте в бутылку 500 миллилитров воды, и закройте ее полуплотно крышкой. Простерилизуйте среду, поместив бутылку в автоклав, установленный на 121 градус Цельсия, на двадцать минут. После этого используйте термостойкие перчатки или горячую подставку, чтобы извлечь носитель из машины, а затем сразу же поверните крышку бутылки, чтобы плотно закрыть ее.

Для использования в тот же день дайте среде остыть, поместив бутылку на водяную баню, нагретую примерно до 45 градусов Цельсия, чтобы сохранить среду в жидком состоянии. В качестве альтернативы носитель можно оставить при комнатной температуре для хранения в твердом состоянии. При необходимости разогрейте бутылку в микроволновой печи, слегка приоткрыв крышку, чтобы расплавить среду, и дайте ей остыть на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия.

Далее возьмите рукав со стерильными чашками Петри, и перманентным маркером пометьте их именами исследователя и СМИ, а также датой. Затем переложите необходимый объем среды в стерильный сосуд, и при необходимости добавьте антибиотики или другие чувствительные компоненты. Здесь 50 миллилитров среды смешиваются со 100 микролитрами канамицина для получения конечной концентрации 25 микрограммов на миллилитр. Поворачивайте трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение добавленных компонентов по всему фильтрующему материалу. Медленно, чтобы избежать образования пузырьков, налейте от 20 до 25 миллилитров питательной среды с температурой около 45 градусов Цельсия в каждую из пластин. При появлении пузырьков или пены быстро удалите их с помощью обычной пипетки и стерильного наконечника. Затем немедленно замените все крышки, чтобы предотвратить загрязнение. Дайте агару застыть при комнатной температуре не менее двух часов или на ночь. После затвердевания храните культуральные планшеты вверх дном при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы свести к минимуму конденсацию на поверхности среды.

Чтобы прорезать выбранную культуру, сначала возьмите чистую тарелку для культуры и снимите крышку. Работая быстро, погрузите одноразовую стерильную петлю в желаемый инокулюм, а затем немедленно проведите петлю по первому квадранту пластины зигзагообразным движением. Установите на место крышку посуды, выбросьте использованную петлю для прививки, а затем выберите новую стерильную петлю. Используя новую петлю, сделайте три-четыре штриха, пересекающие исходную линию тампона, расходящуюся от первого квадранта, которая должна содержать относительно плотную популяцию бактерий во второй квадрант. Закройте крышку еще раз и выбросьте петлю. С новой петлей повторите это действие еще раз, но на этот раз с полосами из второго в третий квадрант. Затем снова с помощью нового цикла сделайте еще одну полосу от третьего к четвертому участку пластины. Наконец, с помощью свежей петли сделайте последний зигзагообразный ход от четвертого квадранта к центру пластины. Распространенность бактерий в этой области будет ниже, что в идеале позволит создать отдельные колонии из одной жизнеспособной материнской клетки.

Установите на место крышку тарелки и, если это подходит для вида бактерий, закройте пластину пара-пленкой, чтобы предотвратить поток воздуха. Переверните тарелку с культурой вверх дном, чтобы не допустить стекания конденсата, а затем поставьте при подходящей для роста температуре. Здесь инкубатор устанавливается на 37 градусов по Цельсию. Дайте планшету инкубироваться, пока не станут видны колонии бактерий. Чтобы создать клональную бактериальную популяцию, выберите одну дискретную колонию из этой пластины. Теперь с помощью стерильной петли коснитесь целевой колонии и, как и раньше, сделайте полосу в первом квадранте новой пластины. Продолжайте поочередно стерилизовать петлю и полосы по оставшимся квадрантам пластины, как показано ранее, заканчивая зигзагом к центру. Закройте тарелку и поставьте ее инкубироваться, пока не сформируются отдельные колонии. Как только эти колонии будут выращены, они, как правило, будут представлять собой чистые клональные штаммы.

Начальная полосовая пластина может содержать колонии, происходящие из клеток разных видов бактерий или клеток с различным генетическим составом, в зависимости от чистоты образца. Путем последующего выделения одной колонии, где все единицы происходят от общей материнской клетки, при второй процедуре полосирования образуется относительно клональная бактериальная популяция, пригодная для дальнейшей характеристики или инокуляции в бульон.