Секвенирование 16S рРНК: метод идентификации видов бактерий на основе ПЦР

1. Настройка

1. При работе с микроорганизмами необходимо соблюдать надлежащую микробиологическую практику. Ко всем микроорганизмам, особенно к неизвестным образцам, следует относиться как к потенциальным патогенам. Следуйте асептическому методу, чтобы не загрязнить образцы, исследователей или лабораторию. Мойте руки до и после контакта с бактериями, используйте перчатки и носите защитную одежду.
2. Проведение оценки рисков для экспериментального протокола выделения геномной ДНК и очистки продуктов ПЦР. Некоторые реагенты могут быть вредны!
3. Чистая культура необходима для секвенирования 16S рРНК. Прежде чем приступать к выделению геномной ДНК, убедитесь, что исходный материал полностью чистый. Это можно сделать с помощью полосового покрытия для изоляции отдельных колоний. Их можно в дальнейшем выращивать на тарелках по отдельности или в бульоне, если это необходимо.
4. Требуется лабораторное оборудование:
   1. Термоамплификатор для ПЦР. Функция термоамплификатора заключается в повышении и понижении температуры в соответствии с заданной программой. При создании программы вам будет предложено ввести значения температуры и времени для каждого этапа ПЦР, а также общее количество циклов.
   2. Система электрофореза в агарозном геле. Он используется для разделения фрагментов ДНК в зависимости от их размера и заряда. В этом протоколе электрофорез в агарозном геле будет использоваться для визуализации качества выделенной геномной ДНК и продуктов ПЦР.

2. Протокол

Примечание: Продемонстрированный протокол применяется к секвенированию гена 16S рРНК из чистой культуры бактерий. Он не распространяется на метагеномные исследования.

1. Культивирование бактерий для выделения геномной ДНК (гДНК).
   1. Выращивайте свой микроорганизм на подходящей среде. На этом этапе можно использовать как жидкие, так и твердые среды. Выбирайте условия, которые дают наилучший прирост. Планируя эксперимент, имейте в виду, что медленно растущим бактериям может потребоваться несколько дней, чтобы достичь фазы позднего логарифма/стационарного роста. В соответствии с этим протоколом Bacillus subtilis 168 выращивали в лизогенном бульоне (LB) в течение ночи в встряхивающем инкубаторе, установленном при 200 об/мин, 37°C.
2. Выделение гДНК.
   1. Если бактерии выращивались на твердой среде, соскребите некоторые клетки с помощью стерильной петли и повторно суспендируйте их в 1 мл дистиллированной воды
   2. Если бактерии выращивались в жидкой среде, используйте примерно 1,5 мл ночной культуры.
   3. Гранулируйте клетки путем центрифугирования (1 минута, 12 000 - 16 000 × г), удалите надосадочную жидкость и используйте клетки для выделения гДНК с использованием коммерческого набора или стандартных протоколов [например, препарат общей ДНК CTAB (13) или фенол-хлороформная экстракция (14)]. В данной работе был использован коммерческий набор для выделения гДНК из 1,5 мл культуры B. subtilis 168 за ночь, OD₆₀₀ = 1,5,
      Примечание 1: Для некоторых грамотрицательных бактерий этот этап может быть пропущен и заменен простым высвобождением ДНК из клеток путем кипячения. Суспендируйте бактериальные гранулы в дистиллированной воде и инкубируйте в нагревательном блоке, установленном при температуре 100 °C, в течение 10 минут.<бр/> Примечание 2: Грамположительные бактериальные клетки трудно разрушить. Поэтому рекомендуется выбрать метод выделения гДНК или набор, предназначенный для выделения из этой группы бактерий.
3. Проверка качества гДНК.
   1. Проверьте качество выделенной гДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Сначала смешайте 5 мкл выделенной гДНК с 1 мкл нагрузочного красителя (6x) и загрузите образец в 0,8% агарозный гель, который содержит реагент, окрашивающий ДНК.
   2. Загрузите стандарт молекулярной массы и запустите электрофорез до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.
   3. После завершения электрофореза визуализируйте гель на подходящем трансиллюминаторе (ультрафиолетовом или синем свете). ГДНК выглядит в виде толстой высокомолекулярной полосы (более 10 кб). Пример проверки качества gDNA показан в Рисунок 3.
   4. Если гДНК проходит контроль качества (т.е. присутствует высокомолекулярная полоса и смазывание гДНК практически отсутствует), разбавьте гДНК последовательно, сначала пометив 3 пробирки микроцентрифуги следующим образом: «10x», «100x» и «1000x».
   5. Пипеткой нанесите 90 мкл стерильной дистиллированной воды в каждую из 3 пробирок.
   6. Возьмите 10 μЛ раствора гДНК и добавьте его в пробирку с маркировкой «10x».
   7. Тщательно нанесите пипетирование по всему объему (т. е. 100 мкл) вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное смешивание раствора. Затем возьмите 10 мкл раствора из этой пробирки и переложите его в пробирку с маркировкой «100x».
   8. Перемешайте, как описано выше, и повторите ту же процедуру, перелив 10 мкл раствора из пробирки "100x" в пробирку "1000x". Эти разведения будут использоваться в качестве шаблона в реакции ПЦР.

Рисунок 3: Электрофорез в агарозном геле гДНК, выделенной из Bacillus subtilis. Полоса 1: М - маркер молекулярной массы (сверху вниз: 10000 п.о., 8000 п.о., 6000 п.о., 5000 п.о., 4000 п.о., 3500 п.о., 3000 п.о., 2500 п.о., 2000 п.о., 1500 п.о., 1000 п.о.). Дорожка 2: гДНК - геномная ДНК, выделенная из Bacillus subtilis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Амплификация гена 16S рРНК методом ПЦР.
   заметка: Приведенный ниже протокол ПЦР оптимизирован для конкретной ДНК-полимеразы и пары праймеров 8F - 1492R (см. Таблицу 1). Для каждой пары полимеразы и праймера требуется оптимизация протокола.
   1. Разморозьте все реагенты на льду.
   2. Приготовьте мастер-смесь для ПЦР, как показано в таблице 2. Поскольку ДНК-полимераза активна при комнатной температуре, реакционную установку необходимо проводить на льду, т.е. ПЦР-пробирки и компоненты реакции должны все время находиться на льду. Подготовьте одну реакцию для каждого образца гДНК и одну реакцию для отрицательного контроля. Отрицательный контроль представляет собой смесь ПЦР без матрицы гДНК и используется для того, чтобы гарантировать, что другие компоненты реакции не будут загрязнены.
      заметка: В случае нескольких образцов обычно готовится мастер-микс. Мастер-микс – это раствор, содержащий все компоненты реакции, кроме шаблона. Это помогает отказаться от повторяющегося пипетирования, избежать ошибок при пипетировании и обеспечивает высокую консистенцию между образцами. Чтобы приготовить мастер-микс, умножьте объем каждого компонента (кроме матрицы ДНК) на количество тестируемых образцов. Смешайте все компоненты в микроцентрифужной пробирке и несколько раз наберите пипеткой весь объем вверх и вниз.
   3. Внесите 49 мкл исходной смеси в отдельные ПЦР-пробирки.
   4. Добавьте 1 мкл шаблона в пробирки с мастер-миксом. Для отрицательного контроля добавьте 1 мкл стерильной воды. Чтобы убедиться, что компоненты хорошо перемешаны, аккуратно пипетируйте смесь вверх и вниз ~10 раз с помощью пипетки, установленной на 30-50 мкл.
   5. Настройте ПЦР-аппарат с помощью программы, приведенной в таблице 3.
   6. Поместите пробирки в ПЦР-машину и запустите программу.
   7. После завершения программы проверьте качество вашего продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
   8. Успешная ПЦР-реакция с использованием пары праймеров 8F-1492R дает одну полосу размером около 1,5 кб (Рисунок 4). Если присутствуют другие полосы (т.е. неспецифические продукты), оптимизируйте программу ПЦР, регулируя температуру отжига. Если присутствует одна полоса ожидаемого размера, перейдите к следующему шагу. В данном случае реакция ПЦР с 100-кратно разбавленной матрицей гДНК дала лучший продукт, так как он имел острую полосу ожидаемого размера и не имел неспецифических продуктов. Поэтому его выбрали для очистки и отправки на секвенирование.
   9. Перед секвенированием продукт должен быть очищен от остаточных праймеров, дезоксирибонуклеотидов, полимеразы и буфера, которые присутствовали в реакции ПЦР. Продукты ПЦР могут быть выделены с помощью коммерческого набора для очистки ПЦР. Реакция ПЦР загружается в колонку, содержащую ДНК-связывающую матрицу. Продукт ПЦР связывается с колонкой, в то время как другие компоненты проходят через колонку. Затем колонку промывают с помощью промывочного буфера, и, наконец, ДНК элюируют в выбранном буфере. Убедитесь, что буфер для элюирования, входящий в комплект комплекта, совместим с секвенированием.
   10. Отправьте очищенный продукт ПЦР на секвенирование ДНК. Следуйте инструкциям по сдаче образцов для секвенирования в выбранном центре секвенирования. Для наилучшего покрытия последовательности используйте праймеры амплификации ПЦР (те же, что используются в разделе 2.4.1) в качестве праймеров для секвенирования. Здесь для секвенирования продукта ПЦР были использованы праймеры 8F и 1492R.

компонент	Конечная концентрация	Объем на реакцию	Объем на x реакций (мастер-микс)
5x Реакционный буфер	1x	10 μл	10 мкл × х
10 мМ dNTP	200 мкМ	1 μл	1 мкл × х
10 мкМ Праймер 8F	0,5 мкМ	2,5 мкл	2,5 мкл × х
10 μМ Грунтовка 1492R	0,5 мкМ	2,5 мкл	2,5 мкл × х
Фузионная полимераза	1 единица	0,5 мкл	0,5 мкл × х
Шаблон ДНК *	- T	1 μл	- T
ддН2О	- T	32,5 мкл	32,5 мкл × х
Общий объем		50 μл	49 мкл × х

Таблица 2: Компоненты ПЦР-реакции. * используйте 10x, 100x или 1000x разбавленную gDNA из шага 2.3.

шаг	температура	Время	Циклов
Первичная денатурация	98°C	30 сек
денатурация	98°C	10 сек	25-30
отжиг	60°C	30 сек
расширение	72°C	45 сек
Окончательное продление	72°C	7 мин
держать	4°C	∞

Таблица 3: Программа ПЦР для амплификации гена 16S рРНК.

Рисунок 4: Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР амплифицируется с использованием праймеров 8F и 1492R и гДНК в качестве матрицы. Образец гДНК из B. subtilis (см. рис. 3) разбавляли в 10, 100 и 1000 раз для проверки наилучшего результата. Полоса 1: М - маркер молекулярной массы (сверху вниз: 10000 п.о., 8000 п.о., 6000 п.о., 5000 п.о., 4000 п.о., 3500 п.о., 3000 п.о., 2500 п.о., 2000 п.о., 1500 п.о., 1000 п.о., 750 п.о., 500 п.о., 250 п.о.). Полоса 2: Реакция ПЦР с разбавленным в 10 раз шаблоном. Полоса 3: Реакция ПЦР с разбавленным в 100 раз шаблоном. Полоса 4: Реакция ПЦР с разбавленным в 1000 раз шаблоном. Полоса 5: (С-) - отрицательный контроль (реакция без матрицы ДНК). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ данных и результаты

Примечание: Продукт ПЦР секвенируется с использованием прямого (здесь 8F) и обратного (здесь 1492R) праймеров. Таким образом, генерируются два набора последовательностей данных, один для прямого и один для обратного праймера. Для каждой последовательности генерируются по меньшей мере два типа файлов: i) текстовый файл, содержащий последовательность ДНК, и ii) хроматограмма ДНК, которая показывает качество выполнения секвенирования.

1. Для прямого праймера откройте хроматограмму и внимательно изучите последовательность. Идеальная хроматограмма для качественной последовательности должна иметь равномерно расположенные пики и небольшое количество фоновых сигналов или их отсутствие (Рисунок 5A).
2. Если хроматограмма не высокого качества, последовательность должна быть отброшена, или текстовый файл последовательности должен быть пересмотрен в соответствии со следующим:
   1. Наличие двойных пиков по всей хроматограмме указывает на наличие множественных матриц ДНК. Это может быть в том случае, если бактериальная культура не была чистой. Такую последовательность следует отбросить (рисунок 5B).
   2. Неоднозначная хроматограмма может возникнуть из-за наличия пиков разного цвета в одном и том же месте. Одной из наиболее распространенных ошибок является наличие двух пиков разного цвета в одном и том же положении и неправильное назначение оснований программным обеспечением для секвенирования (рисунок 5C). Вручную исправьте все неправильно назначенные нуклеотиды и отредактируйте их в текстовом файле.
   3. Хроматограммы с низким разрешением могут привести к «широким пикам», которые часто приводят к неправильному подсчету нуклеотидов в этих областях (Рисунок 5D). Эту ошибку трудно исправить, и поэтому возможные несоответствия на дальнейшем этапе юстировки не следует рассматривать как достоверные.
   4. Плохое качество чтения хроматограммы и наличие множественных пиков обычно наблюдается на 5' и 3' концах последовательности. Некоторые программы секвенирования автоматически удаляют эти фрагменты низкого качества (Рисунок 5E), и нуклеотиды не включаются в текстовый файл. Если ваша последовательность не была усечена автоматически, определите фрагменты низкого качества (например, слабый сигнал, перекрывающиеся пики, потеря разрешения) на концах и удалите соответствующие основания из текстового файла.

Рисунок 5: Примеры устранения неполадок при секвенировании ДНК. А) Пример качественной последовательности хроматограммы (равномерно распределенные, однозначные пики). Б) Некачественная последовательность, которая обычно возникает в начале хроматограммы. Серая зона считается низкокачественной и автоматически удаляется программным обеспечением для секвенирования. Больше оснований можно обрезать вручную. В) Наличие двойных вершин (обозначается стрелками). Нуклеотид, обозначенный красной стрелкой, был прочитан секвенсором как «T» (красный пик), но синий пик сильнее, и его также можно интерпретировать как «C». Г) Перекрывающиеся пики указывают на загрязнение ДНК (т.е. более одного шаблона). Д) Потеря разрешения и так называемые «широкие пики» (обозначенные прямоугольником), которые препятствуют надежному вызову базы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Повторите шаги 3.1 и 3.2 для обратной грунтовки.
4. Наконец, соберите прямую и обратную последовательности в одну непрерывную последовательность. Хороший прогон секвенирования дает последовательность до 1100 п.о. Учитывая, что продукт ПЦР имеет длину ~1500 п.о., последовательности, полученные с использованием прямых и обратных праймеров, должны частично перекрываться.
   1. Объедините две последовательности с помощью программы сборки последовательностей ДНК, например, с помощью бесплатного инструмента, такого как CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
   2. Вставьте две последовательности в формате FASTA в указанное поле. Нажмите кнопку «Отправить» и дождитесь получения результатов.
   3. Чтобы просмотреть собранную последовательность, нажмите "Contigs" на вкладке результатов. Для просмотра деталей центровки нажмите "Сведения о сборке".
      Примечание 1: Если для сборки contig используется программное обеспечение CAP3, нет необходимости преобразовывать последовательность обратного праймера в обратно-комплементарную; Однако этот шаг может понадобиться, если используется другая программа.
      Примечание 2: Формат FASTA — это текстовый формат для представления нуклеотидной последовательности. Первая строка (строка описания) в файле FASTA начинается с символа «>», за которым следует имя или уникальный идентификатор последовательности. За строкой описания следует нуклеотидная последовательность. Вставьте свои последовательности в следующий формат:
      
      >sequence_frw_primer
      Вставьте свою последовательность из текстового файла здесь
      >sequence_rvs_primer
      Вставьте свою последовательность из текстового файла сюда
5. Проведите поиск в базе данных, посетив веб-сайт Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
   1. Выберите инструмент «Nucleotide BLAST», чтобы сравнить свою последовательность с базой данных.
   2. Введите свою последовательность (контиг, собранный в версии 3.5) в текстовое поле «Последовательность запроса», затем выберите базу данных «Последовательности 16S рРНК (бактерии и археи)» в меню прокрутки вниз.
   3. Нажмите кнопку "BLAST" внизу страницы. Будут возвращены наиболее похожие последовательности. Пример результата BLAST показан в Рисунок 6. В представленном эксперименте лидером является штамм B. subtilis 168, демонстрирующий 100% идентичность с последовательностью, доступной в базе данных BLAST.
   4. Если верхнее попадание не показывает 100% идентичность, перейдите к выравниванию и проверьте наличие несоответствий. При нажатии на верхнее попадание, вы будете перенаправлены к деталям выравнивания. Выровненные нуклеотиды будут соединены короткими вертикальными линиями, в то время как несовпадающие нуклеотиды имеют зазор между ними. Вернитесь к хроматограмме, которую вы получили от компании, занимающейся секвенированием, и повторите последовательность, уделяя особое внимание несоответствующей области. Исправьте последовательность, если обнаружены дополнительные ошибки. Запустите BLAST еще раз, используя исправленную последовательность.

Рисунок 6: Пример исхода нуклеотидного BLAST. В качестве запрашиваемой последовательности использовалась последовательность гена 16S рРНК из чистой культуры B. subtilis 168. Верхний хит показывает 100% идентичность (подчеркнуто) со штаммом B. subtilis 168, как и ожидалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.