Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Источник: Эндрю Дж. Ван Альст1, Рианнон М. ЛеВек1, Наталия Мартин1 и Виктор Дж. ДиРита1
1 Факультет микробиологии и молекулярной генетики, Университет штата Мичиган, Ист-Лансинг, Мичиган, Соединенные Штаты Америки
Кривые роста предоставляют ценную информацию о кинетике роста бактерий и физиологии клеток. Они позволяют определить, как бактерии реагируют на переменчивые условия роста, а также определить оптимальные параметры роста для данной бактерии. Архетипическая кривая роста проходит через четыре стадии роста: запаздывающую, экспоненциальную, стационарную и смертельную (1).
Рисунок 1: Кривая роста бактерий. Бактерии, выращенные в периодической культуре, проходят через четыре фазы роста: запаздывающую, экспоненциальную, стационарную и смертельную. Лаг-фаза — это период времени, который требуется бактериям, чтобы достичь физиологического состояния, способного к быстрому росту и делению клеток. Экспоненциальная фаза — это стадия самого быстрого роста и деления клеток, во время которой репликация ДНК, транскрипция РНК и производство белка происходят с постоянной и быстрой скоростью. Стационарная фаза характеризуется замедлением и стабилизацией роста бактерий из-за ограничения питательных веществ и/или накопления токсических промежуточных продуктов. Фаза смерти – это стадия, на которой происходит лизис клеток в результате серьезного ограничения питательных веществ.
Лаг фаза - это период времени, который требуется бактериям, чтобы достичь физиологического состояния, способного к быстрому росту и делению клеток. Это отставание происходит из-за того, что бактериям требуется время, чтобы приспособиться к новой среде. Как только необходимые клеточные компоненты генерируются в фазе лаг, бактерии вступают в экспоненциальную фазу роста, где репликация ДНК, транскрипция РНК и производство белка происходят с постоянной и быстрой скоростью (2). Скорость быстрого роста и деления клеток во время экспоненциальной фазы рассчитывается как время генерации, или время удвоения, и является самой быстрой скоростью, с которой бактерии могут реплицироваться при данных условиях (1). Время удвоения можно использовать для сравнения различных условий роста, чтобы определить, какой из них более благоприятен для роста бактерий. Фаза экспоненциального роста является наиболее воспроизводимым условием роста, поскольку физиология бактериальных клеток одинакова во всей популяции (3). Стационарная фаза следует за экспоненциальной фазой, в которой рост клеток выходит на плато. Стационарная фаза возникает из-за истощения питательных веществ и/или накопления токсичных промежуточных продуктов. Бактериальные клетки продолжают выживать на этой стадии, хотя скорость репликации и деления клеток резко снижается. Заключительной фазой является смерть, когда сильное истощение питательных веществ приводит к лизиру клеток. Особенности кривой роста, которые предоставляют больше всего информации, включают продолжительность фазы запаздывания, время удвоения и максимальную достигнутую плотность клеток.
Количественная оценка бактерий в периодической культуре может быть определена с использованием как колониеобразующих единиц, так и оптических измерений плотности. Подсчет по колониеобразующим единицам (КОЕ) обеспечивает прямое измерение количества бактериальных клеток. Стандартной единицей измерения КОЕ является количество культивируемых бактерий, присутствующих на 1 мл культуры (КОЕ/мл), определенное с помощью методов серийного разбавления и нанесения покрытий. Для каждой временной точки проводят серию разведения культуры периодического действия в соотношении 1:10, и 100 мкл каждого разведения распределяют с помощью распределителя клеток.
Рисунок 2. Схема серийного разбавления. Общий проход для разбавления из периодической культуры. Культуру периодического действия последовательно разводят в соотношении 1:10 путем переноса 1 мл предыдущего разведения в последующую пробирку, содержащую 9 мл PBS. Из каждой разрежающей пробирки 100 мкл выкладывается с помощью планшетного разбрасывателя, что представляет собой дополнительное разбавление 1:10, поскольку это составляет 1/10 объема 1 мл при расчете КОЕ/мл. Планшеты инкубируются и перечисляются по мере того, как на них вырастают клональные колонии.
Затем планшеты инкубируют в течение ночи и перечисляют клональные колонии. Планшет для разбавления, на котором было выращено 30-300 колоний, используется для расчета КОЕ/мл для данного момента времени (4, 5). Стохастические вариации количества колоний до 30 подвержены большей погрешности при расчете КОЕ/мл, а подсчет колоний более 300 может быть недооценен из-за скученности и перекрытия колоний. Используя коэффициент разбавления для данной пластины, можно рассчитать КОЕ периодической культуры для каждой временной точки.
Оптическая плотность дает мгновенное приближение количества бактериальных клеток, измеренное с помощью спектрофотометра. Оптическая плотность – это мера поглощения частиц света, которые проходят через 1 см культуры и обнаруживаются фотодиодным датчиком (6). Оптическая плотность культуры измеряется по отношению к заготовке среды и увеличивается по мере увеличения бактериальной плотности. Для бактериальных клеток при измерении оптической плотности обычно используется длина волны 600 нм (OD600) (4). Путем создания стандартной кривой, связывающей колониеобразующие единицы и оптическую плотность, измерение оптической плотности может быть использовано для быстрого приближения количества бактериальных клеток в культуре партии. Однако это соотношение начинает ухудшаться уже на 0,3 OD600, поскольку клетки начинают менять форму и накапливать внеклеточные продукты в среде, влияя на показания оптической плотности по отношению к КОЕ (7). Эта ошибка становится более выраженной во время неподвижной фазы и фазы смерти.
Здесь Escherichia coli выращивается в бульоне Лурия-Бертани (LB) при температуре 37°C в течение 30 часов (7). Были построены как кривые роста КОЕ/мл, так и кривые роста оптической плотности, а также стандартная кривая, связывающая оптическую плотность с КОЕ.
Рисунок 3. Оптическая плотность Escherichia coli на кривой роста 600 нм длины волны (OD600). Значения оптической плотности отбирали непосредственно со спектрофотометра после гашения стерильными средами LB. Значения OD600 больше 1,0 разбавляли в соотношении 1:10 путем объединения 100 мкл культуры с 900 мкл свежего LB, снова измеряли, а затем умножали на 10 для получения значения OD600. Этот шаг предпринимается в связи с тем, что точность измерений спектрофотометра снижается при высокой плотности ячеек. Начиная с кривой, лаг-фаза простирается примерно до 1 часа роста, переходит в экспоненциальную фазу от 2 часов до 7 часов, затем начинает выходить на плато, входя в стационарную фазу. Однако фаза смерти не является резким переходом, так как оптическая плотность постепенно начинает снижаться после 15 часов.
Рисунок 4. Кривая роста Escherichia coli на миллилитр (КОЕ/мл). Значения КОЕ/мл для каждой временной точки рассчитывали на планшете для разбавления, содержащем 30-300 колоний. Начиная с кривой, фаза лага простирается примерно до 2 часов роста, переходит в экспоненциальную фазу от 2 часов до 7 часов, затем начинает выходить на плато, переходя в стационарную фазу. Однако фаза смерти не является резким переходом, так как КОЕ/мл постепенно начинает снижаться через 15 часов с пика 2 x 109 до примерно 5 x 108 через 30 часов.
Рисунок 5. Кривая стандартизации для КОЕ/мл в сравнении с OD600. Линейная регрессия может быть использована для соотнесения этих единиц таким образом, чтобы оптическая плотность могла быть использована для приближения плотности бактериальных клеток. Оптическая плотность может быть использована для обеспечения мгновенной аппроксимации КОЕ/мл периодической культуры. Здесь показаны только первые шесть временных точек, так как соотношение между OD600 и КОЕ/мл менее точно за пределами 1,0 OD600, поскольку форма клеток и внеклеточные продукты начинают накапливаться по мере того, как бактерии вступают в стационарную фазу, что происходит вскоре после достижения 1,0 OD600. Изменения в форме клеток и внеклеточных продуктах в среде влияют на показания оптической плотности и, следовательно, влияют на соотношение между оптической плотностью и количеством бактерий в культуре.
Время удвоения также было определено равным 15 минутам и 19 секундам. На основе этих данных можно визуализировать способность к росту LB для E. coli и использовать их для сравнения между различными средами или бактериями.
1. Настройка
2. Протокол
3. Анализ данных и результаты
, где b = количество бактерий в t2, B = количество бактерий в t1, и n = количество поколений. Производно из: . Бактерии размножаются с помощью процесса, называемого делением клетки, в результате которого образуются две идентичные дочерние клетки. Если условия для роста благоприятны, популяции бактерий будут расти в геометрической прогрессии.
Кривые роста бактерий отображают количество бактерий в культуре в зависимости от времени. Типичная кривая роста проходит через четыре стадии: фаза запаздывания, экспоненциальная фаза, стационарная фаза и фаза смерти. Фаза запаздывания — это время, которое требуется бактериям, чтобы достичь состояния, в котором они могут быстро расти и делиться. После этого бактерии переходят в экспоненциальную фазу, характеризующуюся быстрым ростом и делением клеток. Скорость экспоненциального роста бактериальной культуры в течение этой фазы может быть выражена как время удвоения, самая высокая скорость, с которой бактерии могут размножаться при определенных условиях. Затем следует стационарная фаза, когда рост бактериальных клеток выходит на плато, а темпы роста и смертности выравниваются из-за истощения питательных веществ в окружающей среде. Наконец, бактерии вступают в фазу гибели. Именно здесь резко снижается рост бактерий и серьезное истощение питательных веществ приводит к лизиру клеток.
Для количественной оценки количества бактерий, присутствующих в культуре, и построения кривой роста можно использовать два метода. Первый из них осуществляется с помощью колониеобразующих единиц, или КОЕ. Для получения КОЕ в определенные моменты времени проводится от одной до десяти серий из девяти разведений. Первое из этих разведений, отрицательное в данном примере, содержит 9 мл PBS и 1 мл бактериальной культуры. В результате получается коэффициент разбавления 1:10. Затем 1 мл этого раствора переносится в следующую пробирку, отрицательные два, в результате чего коэффициент разбавления составляет 1:100. Этот процесс продолжается до последней трубки, отрицательной девятки, в результате чего итоговый коэффициент разбавления составляет 1:1 миллиард. После этого наносится по 100 микролитров каждого разведения. Затем планшеты инкубируют и подсчитывают клональные колонии. Пластина для разбавления для заданного момента времени, который растет от 30 до 300 колоний, используется для расчета КОЕ на миллилитр для этого момента времени.
Вторым распространенным методом измерения концентрации бактерий является оптическая плотность. Оптическая плотность культуры может быть измерена мгновенно, по отношению к бланку среды, с помощью спектрофотометра. Как правило, для этих измерений используется длина волны 600 нанометров, также называемая OD600, которая увеличивается по мере увеличения плотности клеток. Несмотря на то, что оптическая плотность менее точна, чем у КОЕ, она удобна, потому что ее можно получить мгновенно и для этого требуется относительно небольшое количество реагентов. Оба метода могут быть использованы вместе для создания стандартной кривой, которая более точно аппроксимирует количество бактериальных клеток в культуре. В этом видео вы узнаете, как получить КОЕ и измерения OD600 из последовательных разведений E. coli. Затем будут построены две кривые роста с использованием измерений КОЕ и OD600 соответственно, прежде чем они будут связаны стандартной кривой.
При работе с бактериями важно использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как лабораторный халат и перчатки, а также соблюдать надлежащую технику асептики.
После этого простерилизуйте рабочую станцию с 70% этанолом. Сначала приготовьте бульон LB и твердую агаровую среду LB в отдельных автоклавируемых бутылках. После частичного закрытия крышек флаконов стерилизуйте среду в автоклаве, установленном на 121 градус Цельсия, в течение 35 минут. Далее дайте агаровой среде остыть на водяной бане, установленной на 50 градусов Цельсия, в течение 30 минут. После остывания налейте от 20 до 25 мл в каждую чашку Петри. После этого дайте пластинам застыть в течение 24 часов при комнатной температуре.
Для получения изолятов одиночной колонии, которые впоследствии будут использоваться для получения жидкой бактериальной культуры, используйте ранее замороженный исход и надлежащую технику нанесения полос для выделения E. coli для выделения на LB-агаре. Инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. После этого охладите стерилизованную пламенем петлю инокуляции на агаре, прежде чем выбрать одну колонию из прожилочной пластины. Внесите 4 мл жидкой среды в пробирку объемом 15 мл. Затем вырастите E. coli при 37 градусах Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 210 об/мин.
Чтобы настроить объем бактериальной культуры в масштабе 1:1000, который будет использоваться в кривой роста, сначала приобретите автоклавную колбу Эрленмейера объемом 500 мл. Затем с помощью серологической пипетки объемом 50 мл перенесите 100 мл стерильной среды в колбу. Затем пометьте девять пробирок по 15 мл последовательно как от одного до девяти. Эти числа соответствуют коэффициенту разведения, который будет использоваться для расчета колониеобразующей единицы, или КОЕ. Затем добавьте 9 мл 1X PBS в каждую пробирку. После этого пометьте подготовленные агаровые пластины соответствующими временными точками и коэффициентами разбавления, которые будут выращиваться. В этом примере с E. coli, после начальной точки времени, точки времени берутся один раз в час. Используя заранее приготовленную на ночь жидкую культуру E. coli, засейте среду в автоклавную колбу Эрленмейера объемом 1:1000 объема. Взбейте среду, чтобы равномерно распределить бактерии.
После гашения спектрофотометра очистите кювету безворсовой салфеткой. Затем выдавите 1 мл культуры в кювету и поместите ее в спектрофотометр, чтобы получить оптическую плотность культуры в нулевой момент времени. Затем вырастите E. coli при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 210 об/мин. В каждой временной точке после нулевой временной точки извлекайте еще 1 мл бактериальной культуры из колбы и повторяйте измерение оптической плотности. Если показания оптической плотности больше 1,0, разведите 100 микролитров бактериальной культуры с 900 микролитрами свежей среды, а затем измерьте оптическую плотность еще раз. Это значение можно умножить на 10 для измерения наружного диаметра 600.
Чтобы получить измерение колониеобразующей единицы для каждой временной точки, извлеките дополнительно 1 мл бактериальной культуры из колбы в каждый момент времени. Выдавите бактериальную культуру в отрицательную одну пробирку и перемешайте вортекс. Затем проведите серию разведения, сначала перенеся 1 мл из отрицательной одной пробирки в отрицательную две пробирки и перемешайте вихрь. Переведите 1 мл из отрицательной пробирки в отрицательную тройку и перемешайте. Продолжайте этот последовательный перенос вниз по всем разводящим трубкам к отрицательной девятой трубке. Для каждого разведения нанесите 100 микролитров клеточной суспензии на соответствующую маркировочную пластину. При каждом разведении стерилизуйте распределитель клеток в этаноле, пропустите его через пламя горелки Бунзена и охладите, прикоснувшись к поверхности агара вдали от инокулята. Затем с помощью разбрасывателя ячеек распределите клеточную суспензию до тех пор, пока поверхность агаровой пластины не станет сухой. Инкубируйте пластины вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия. Как только появятся видимые колонии, подсчитайте количество колоний бактерий на каждой пластине. Запишите эти значения и связанные с ними коэффициенты разрежения для каждой пластины в каждый момент времени.
Чтобы создать кривую роста OD 600, убедившись, что все точки данных правильно введены в таблицу, выберите все временные точки и соответствующие им данные. Чтобы построить график кривой роста колониеобразующей единицы, выберите пластину разведения, где количество колоний находится в диапазоне от 30 до 300 бактерий для каждой временной точки. Умножьте количество колоний на коэффициент разведения, а затем на десять. Это связано с тем, что разброс в 100 микролитров считается дополнительным разведением 1:10 при расчете колониеобразующих единиц на миллилитр. После этого нанесите график зависимости единиц формирования колонии от времени в полулогарифмическом масштабе.
Эти графики, полученные с помощью измерений OD 600 и КОЕ соответственно, могут предоставить ценную информацию о кинетике роста E. coli. Оптическая плотность и колониеобразующие единицы могут быть взаимосвязаны, так что КОЕ на миллилитр можно оценить по измерениям наружного диаметра 600, что сэкономит время и материалы в будущих экспериментах.
Для этого построите график зависимости колониеобразующих единиц от оптической плотности на линейной шкале для показаний наружного диаметра 600, меньших или равных 1. 0. После этого сгенерируйте линию тренда линейной регрессии в формате Y = MX + B, где M — наклон, а B — y-пересечение. Щелкните правой кнопкой мыши по точкам данных и выберите «Добавить линию тренда» и «Линейный». Затем установите флажок, чтобы отобразить уравнение на диаграмме и отобразить значение R в квадрате на диаграмме. Значение R-квадрат является статистическим измерением того, насколько близко данные совпадают с подогнанной линией регрессии. В этом примере первые 6 временных точек нанесены с наружным диаметром 600 по оси x и КОЕ на миллилитр по оси y. В будущих экспериментах с теми же условиями роста эти значения наклона и y-точки могут быть включены в это уравнение для оценки КОЕ по показаниям наружного диаметра 600. Затем посмотрите на график кривой роста колониеобразующей единицы. Во время экспоненциальной фазы определите две временные точки с самым крутым уклоном между ними. Чтобы рассчитать время удвоения, сначала вычислите изменение времени между выбранными временными точками. Затем рассчитайте смену поколений с помощью приведенного здесь уравнения. Здесь нижний регистр b — это количество бактерий в момент времени три, а верхний регистр B — количество бактерий во второй момент времени. Наконец, разделите изменение во времени на смену поколений. В этом примере время удвоения равно 0. 26 часов или 15 минут и 19 секунд. Сравнение времени удвоения при различных экспериментальных методах лечения позволяет определить наилучшие условия роста для определенного вида бактерий. Таким образом, лечение с наименьшим временем удвоения будет наиболее оптимальным из тестируемых условий.
Бактерии размножаются с помощью процесса, называемого делением клетки, в результате которого образуются две идентичные дочерние клетки. Если условия для роста благоприятны, популяции бактерий будут расти в геометрической прогрессии.
Кривые роста бактерий отображают количество бактерий в культуре в зависимости от времени. Типичная кривая роста проходит через четыре стадии: фаза запаздывания, экспоненциальная фаза, стационарная фаза и фаза смерти. Фаза запаздывания — это время, которое требуется бактериям, чтобы достичь состояния, в котором они могут быстро расти и делиться. После этого бактерии переходят в экспоненциальную фазу, характеризующуюся быстрым ростом и делением клеток. Скорость экспоненциального роста бактериальной культуры в течение этой фазы может быть выражена как время удвоения, самая высокая скорость, с которой бактерии могут размножаться при определенных условиях. Затем следует стационарная фаза, когда рост бактериальных клеток выходит на плато, а темпы роста и смертности выравниваются из-за истощения питательных веществ в окружающей среде. Наконец, бактерии вступают в фазу гибели. Именно здесь резко снижается рост бактерий и серьезное истощение питательных веществ приводит к лизиру клеток.
Для количественной оценки количества бактерий, присутствующих в культуре, и построения кривой роста можно использовать два метода. Первый из них осуществляется с помощью колониеобразующих единиц, или КОЕ. Для получения КОЕ в определенные моменты времени проводится от одной до десяти серий из девяти разведений. Первое из этих разведений, отрицательное в данном примере, содержит 9 мл PBS и 1 мл бактериальной культуры. В результате получается коэффициент разбавления 1:10. Затем 1 мл этого раствора переносится в следующую пробирку, отрицательные два, в результате чего коэффициент разбавления составляет 1:100. Этот процесс продолжается до последней трубки, отрицательной девятки, в результате чего итоговый коэффициент разбавления составляет 1:1 миллиард. После этого наносится по 100 микролитров каждого разведения. Затем планшеты инкубируют и подсчитывают клональные колонии. Пластина для разбавления для заданного момента времени, который растет от 30 до 300 колоний, используется для расчета КОЕ на миллилитр для этого момента времени.
Вторым распространенным методом измерения концентрации бактерий является оптическая плотность. Оптическая плотность культуры может быть измерена мгновенно, по отношению к бланку среды, с помощью спектрофотометра. Как правило, для этих измерений используется длина волны 600 нанометров, также называемая OD600, которая увеличивается по мере увеличения плотности клеток. Несмотря на то, что оптическая плотность менее точна, чем у КОЕ, она удобна, потому что ее можно получить мгновенно и для этого требуется относительно небольшое количество реагентов. Оба метода могут быть использованы вместе для создания стандартной кривой, которая более точно аппроксимирует количество бактериальных клеток в культуре. В этом видео вы узнаете, как получить измерения КОЕ и OD600 из последовательных разведений E. coli по времени. Затем будут построены две кривые роста с использованием измерений КОЕ и OD600 соответственно, прежде чем они будут связаны стандартной кривой.
При работе с бактериями важно использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как лабораторный халат и перчатки, а также соблюдать надлежащую технику асептики.
После этого простерилизуйте рабочую станцию с 70% этанолом. Сначала приготовьте бульон LB и твердую агаровую среду LB в отдельных автоклавируемых бутылках. После частичного закрытия крышек флаконов стерилизуйте среду в автоклаве, установленном на 121 градус Цельсия, в течение 35 минут. Далее дайте агаровой среде остыть на водяной бане, установленной на 50 градусов Цельсия, в течение 30 минут. После остывания налейте от 20 до 25 мл в каждую чашку Петри. После этого дайте пластинам застыть в течение 24 часов при комнатной температуре.
Для получения одиночных колоний изолятов, которые впоследствии будут использоваться для получения жидкой бактериальной культуры, используйте ранее замороженный исходный материал и надлежащую технику покрытия полос для выделения E. coli для выделения на LB-агаре. Инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. После этого охладите стерилизованную пламенем петлю инокуляции на агаре, прежде чем выбрать одну колонию из прожилочной пластины. Внесите 4 мл жидкой среды в пробирку объемом 15 мл. Затем вырастите кишечную палочку при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 210 оборотах в минуту.
Чтобы настроить объем бактериальной культуры в масштабе 1:1000, который будет использоваться в кривой роста, сначала приобретите автоклавную колбу Эрленмейера объемом 500 мл. Затем с помощью серологической пипетки объемом 50 мл перенесите 100 мл стерильной среды в колбу. Затем пометьте девять пробирок по 15 мл последовательно как от одного до девяти. Эти числа соответствуют коэффициенту разведения, который будет использоваться для расчета колониеобразующей единицы, или КОЕ. Затем добавьте 9 мл 1X PBS в каждую пробирку. После этого пометьте подготовленные агаровые пластины соответствующими временными точками и коэффициентами разбавления, которые будут выращиваться. В этом примере с кишечной палочкой, после начальной точки времени, точки времени берутся один раз в час. Используя заранее приготовленную на ночь жидкую культуру E. coli, засейте среду в автоклавную колбу объемом 500 мл Эрленмейера объемом 1:1000. Взбейте среду, чтобы равномерно распределить бактерии.
После гашения спектрофотометра очистите кювету безворсовой салфеткой. Затем выдавите 1 мл культуры в кювету и поместите ее в спектрофотометр, чтобы получить оптическую плотность культуры в нулевой момент времени. Затем выращивайте кишечную палочку при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 210 оборотах в минуту. В каждой временной точке после нулевой временной точки извлекайте еще 1 мл бактериальной культуры из колбы и повторяйте измерение оптической плотности. Если показания оптической плотности больше 1,0, разведите 100 микролитров бактериальной культуры с 900 микролитрами свежей среды, а затем измерьте оптическую плотность еще раз. Это значение можно умножить на 10 для измерения наружного диаметра 600.
Чтобы получить измерение колониеобразующей единицы для каждой временной точки, извлеките дополнительно 1 мл бактериальной культуры из колбы в каждый момент времени. Выдавите бактериальную культуру в отрицательную одну пробирку и перемешайте вортекс. Затем проведите серию разведения, сначала перенеся 1 мл из отрицательной одной пробирки в отрицательную две пробирки и перемешайте вихрь. Переведите 1 мл из отрицательной пробирки в отрицательную тройку и перемешайте. Продолжайте этот последовательный перенос вниз по всем разводящим трубкам к отрицательной девятой трубке. Для каждого разведения нанесите 100 микролитров клеточной суспензии на соответствующую маркировочную пластину. При каждом разведении стерилизуйте распределитель клеток в этаноле, пропустите его через пламя горелки Бунзена и охладите, прикоснувшись к поверхности агара вдали от инокулята. Затем с помощью разбрасывателя ячеек распределите клеточную суспензию до тех пор, пока поверхность агаровой пластины не станет сухой. Инкубируйте пластины вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия. Как только появятся видимые колонии, подсчитайте количество колоний бактерий на каждой пластине. Запишите эти значения и связанные с ними коэффициенты разрежения для каждой пластины в каждый момент времени.
Чтобы создать кривую роста OD 600, убедившись, что все точки данных правильно введены в таблицу, выберите все временные точки и соответствующие им данные. Чтобы построить график кривой роста колониеобразующей единицы, выберите пластину разведения, где количество колоний находится в диапазоне от 30 до 300 бактерий для каждой временной точки. Умножьте количество колоний на коэффициент разведения, а затем на десять. Это связано с тем, что разброс в 100 микролитров считается дополнительным разведением 1:10 при расчете колониеобразующих единиц на миллилитр. После этого нанесите график зависимости единиц формирования колонии от времени в полулогарифмическом масштабе.
Эти графики, полученные с помощью измерений OD 600 и КОЕ соответственно, могут предоставить ценную информацию о кинетике роста E. coli. Оптическая плотность и колониеобразующие единицы могут быть взаимосвязаны, так что КОЕ на миллилитр можно оценить по измерениям наружного диаметра 600, что сэкономит время и материалы в будущих экспериментах.
Для этого построите график зависимости колониеобразующих единиц от оптической плотности на линейной шкале для показаний наружного диаметра 600, меньших или равных 1. 0. После этого сгенерируйте линию тренда линейной регрессии в формате Y = MX + B, где M — наклон, а B — y-пересечение. Щелкните правой кнопкой мыши по точкам данных и выберите «Добавить линию тренда» и «Линейный». Затем установите флажок, чтобы отобразить уравнение на диаграмме и отобразить значение R в квадрате на диаграмме. Значение R-квадрат является статистическим измерением того, насколько близко данные совпадают с подогнанной линией регрессии. В этом примере первые 6 временных точек нанесены с наружным диаметром 600 по оси x и КОЕ на миллилитр по оси y. В будущих экспериментах с теми же условиями роста эти значения наклона и y-точки могут быть включены в это уравнение для оценки КОЕ по показаниям наружного диаметра 600. Затем посмотрите на график кривой роста колониеобразующей единицы. Во время экспоненциальной фазы определите две временные точки с самым крутым уклоном между ними. Чтобы рассчитать время удвоения, сначала вычислите изменение времени между выбранными временными точками. Затем рассчитайте смену поколений с помощью приведенного здесь уравнения. Здесь нижний регистр b — это количество бактерий в момент времени три, а верхний регистр B — количество бактерий во второй момент времени. Наконец, разделите изменение во времени на смену поколений. В этом примере время удвоения равно 0. 26 часов или 15 минут и 19 секунд. Сравнение времени удвоения при различных экспериментальных методах лечения позволяет определить наилучшие условия роста для определенного вида бактерий. Таким образом, лечение с наименьшим временем удвоения будет наиболее оптимальным из тестируемых условий.
Microbiology
136.8K Просмотры
Microbiology
335.2K Просмотры
Microbiology
140.3K Просмотры
Microbiology
180.3K Просмотры
Microbiology
205.9K Просмотры
Microbiology
98.4K Просмотры
Microbiology
385.8K Просмотры
Microbiology
197.1K Просмотры
Microbiology
91.7K Просмотры
Microbiology
42.4K Просмотры
Microbiology
32.8K Просмотры
