Кривые роста: построение кривых роста с использованием колониеобразующих единиц и измерений оптической плотности

1. Настройка

1. Необходимые лабораторные материалы: жидкие среды, затвердевшие агаровые среды, колбы Эрленмейера, пробирки объемом 15 мл, фосфатно-солевой буфер (PBS), распространитель бактериальных клеток, 70% этанол и спектрофотометр. Все растворы и стеклянная посуда должны быть стерилизованы перед использованием.
2. Подготовьте рабочую станцию путем стерилизации 70% этанолом. Работайте рядом с горелкой Бунзена, чтобы предотвратить загрязнение среды.
3. При работе с бактериями следует использовать надлежащие средства индивидуальной защиты и асептическую технику. При работе с бактериальными культурами требуется лабораторный халат и перчатки.
4. Рецепты буферов, растворов и реагентов
   1. Фосфатно-солевой буфер (PBS) (8).
   2. Бульон Лурия-Бертани (LB) (9).

2. Протокол

1. Подготовка СМИ
   1. Определите питательные среды, с помощью которых будут выращиваться бактерии, и приготовьте жидкий бульон и твердый агаровый (1,5% по объему агара) в отдельных автоклавируемых бутылках. Здесь приготовили бульон LB и агар LB для выращивания Escherichia coli.
   2. Стерилизовать среду с полузакрытой крышкой в автоклаве при температуре 121 °C в течение 35 мин.
   3. Для агаровых сред после автоклавирования поместить на водяную баню, установленную на 50 °С, на 30 минут для остывания. После остывания налейте 20-25 мл агаровой среды в круглые чашки Петри размером 100x15 мм. Перед использованием дайте пластинам застыть в течение 24 часов при комнатной температуре.
2. Первоначальная подготовка бактерий
   1. Из замороженного исхода бактерии отделяют для изоляции на выбранных средах агара для получения изолятов с одной колонией. Инкубировать в допустимых для выбранных бактерий условиях роста. Здесь E. coli наносится на LB-агар и инкубируется при 37 °C в течение ночи (16-18 часов).
   2. С помощью стерильной петли посева выберите одну колонию из полосовой пластины и закиньте 4 мл жидкой среды в пробирку объемом 15 мл и выращивайте в условиях, допустимых для выбранных бактерий. Здесь E. coli выращивается при температуре 37 °C с встряхиванием при 210 об/мин в течение ночи (16-18 часов).
3. Настройка кривой роста
   1. Подготовка ростовой колбы
      1. Автоклавы соответствующего размера колбы Эрленмейера. Как правило, используется соотношение среды к общему объему колбы 1:5. Здесь в колбе объемом 500 мл используется среда объемом 100 мл LB.
      2. С помощью серологической пипетки перенесите стерильную среду в колбу Эрленмейера.
   2. Приготовление серий разбавлений
      1. Нанесите этикетки на 15 мл пробирок: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 и -9, распределив по 9 мл PBS в каждую. Эти цифры соответствуют коэффициенту разрежения, используемому для расчета КОЕ/мл. Для каждой точки времени сбора требуется новый набор пробирок. (Рисунок 2)
   3. Подготовка агаровых пластин
      1. Этикеточные таблички с указанием времени сбора и коэффициента разбавления. Для каждой временной точки будет одна пластина для каждого разбавления.
4. Протокол кривой роста
   1. Инокуляция сред
      1. Используя жидкую культуру на ночь, приготовленную в рамках шага 2.2.2, инокулируют среду колбы объемом 1:1000 культуры. Здесь 100 мкл жидкой культуры на ночь добавляется к 100 мл LB среды.
      2. Взбейте среду, чтобы равномерно распределить бактерии.
   2. Коллекция временных поинтов
      1. Настройка условий роста
         1. Поместите колбу в экспериментальные условия роста, выбранные для данной бактерии. Для быстрорастущих бактерий их следует использовать часто, а для медленно растущих бактерий их можно использовать с более длительными интервалами. Здесь E. coli выращивается при температуре 37°C с встряхиванием со скоростью 210 оборотов в минуту (об/мин) и снятием временных точек каждые 1 час.
      2. Измерение оптической плотности (OD600)
         1. В каждой временной точке, включая начальную временную точку (t = 0), извлеките 1 мл бактериальной культуры и распределите в кювету спектрофотометра.
         2. Протрите кювету и запишите оптическую плотность на длине волны 600 нм. Если показания оптической плотности больше 1,0, разбавьте 100 мкл культуры 1:10 с 900 мкл свежей среды, запишите оптическую плотность и умножьте это значение на 10 для измерения OD600.
      3. Измерение колониеобразующей единицы (КОЕ/мл)
         1. В каждый момент времени извлеките 1 мл бактериальной культуры и распределите в стеклянную пробирку -1, содержащую 9 мл PBS.
         2. Для серии разведения последовательно перетекайте 1 мл из пробирки -1 вниз по всем пробиркам разбавления в пробирку -9, делая вихревую обработку после каждого переноса. (Рисунок 2)
         3. Для каждого разведения дозируйте 100 мкл клеточной суспензии на соответственно маркированный агаровый планшет с твердой средой. (Рисунок 2)
         4. С помощью распределителя ячеек, стерилизованного в этаноле, пропущенного через пламя горелки Бунзена и охлажденного прикосновением к поверхности агара, распределите 100 мкл клеточной суспензии до тех пор, пока поверхность агаровой пластины не станет сухой.
         5. Инкубируйте разложенные тарелки вверх дном при температуре, способствующей росту бактерий. Здесь E. coli инкубируется при 37°C.
         6. После инкубации, как только появятся видимые колонии, подсчитайте количество колоний бактерий на каждой пластине и запишите эти значения вместе с связанным с ними коэффициентом разведения для всех пластин в каждой временной точке.

3. Анализ данных и результаты

1. График кривой роста оптической плотности (OD600)
   1. Постройте график зависимости оптической плотности (OD600) от времени в полулогарифмическом масштабе. (Рисунок 3)
2. График кривой роста колониеобразующей единицы (КОЕ/мл)
   1. Для каждой временной точки выберите пластину разведения, в которой количество колоний находилось в диапазоне 30-300 бактерий. Умножьте количество колоний на коэффициент разбавления, а затем на 10, так как спред 100 мкл считается дополнительным разбавлением 1:10 при расчете КОЕ/мл.
      
   2. Нанесите график зависимости колонообразующих единиц от времени в полулогарифмическом масштабе. (Рисунок 4)
3. Связь оптической плотности и колониеобразующих единиц
   1. Постройте график зависимости колониеобразующих единиц от оптической плотности на линейной шкале для показаний OD600, меньших или равных 1,0 OD600, поскольку соотношение между OD600 и КОЕ/мл менее точно, чем 1,0 OD600. Здесь нанесены первые шесть временных точек. (Рисунок 5)
   2. Сгенерируйте линию тренда линейной регрессии, отображающую уравнение и значение R².
4. Определение времени удвоения бактерий
   1. Используя график кривой роста колониеобразующей единицы, во время экспоненциальной фазы определите две точки на графике с самым крутым наклоном между ними, чтобы рассчитать время удвоения.
   2. Расчет времени удвоения
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁, где t₁ = Временная точка 1 и t₂ = Временная точка 2
      3. , где b = количество бактерий в t₂, B = количество бактерий в t₁, и n = количество поколений. Производно из: .
      4. Рассчитайте время удвоения с помощью: