Тестирование чувствительности к антибиотикам: эпсилометрические тесты для определения значений МПК двух антибиотиков и оценки синергии антибиотиков

1. Испытания эпсилометра (E-тесты)

1. Настройка
   1. Наденьте перчатки и лабораторный халат
   2. Подготовьте рабочее пространство, стерилизовав его с помощью 70% этанола
   3. Сбор агаровых пластин Мюллера-Хинтона (пластины MHA)
2. Подготовка стандарта Макфарланда по мутности No 0.5
   1. Приготовьте 1% раствор хлорида бария (BaCl₂):
      Добавьте 1 грамм безводного хлорида бария (BaCl₂) в 100 мл дистиллированной воды. Вихрь хорошо.
   2. Приготовьте 1% раствор серной кислоты (H₂SO₄):
      Добавьте 1 мл концентрированного H₂SO₄ в 99 мл дистиллированной воды. Вихрь хорошо.
   3. Приготовьте стандарт Макфарланда по мутности No 0.5:
      50 мкл раствора BaCl₂ в 5 мл 1% H₂SO₄. Хорошо проработайте вихревой раствор, чтобы получить мутную суспензию.
   4. Храните стандарт мутности по Макфарланду No 0,5 в пробирке, покрытой фольгой. Хранить при температуре 25°C не более 6 месяцев. Перед применением хорошо перемешайте до однородного раствора.
3. Подготовка пластин MHA
   1. Соскребите Streptococcus бактерии группы G с кровяной агаровой пластиной с помощью стерильной петли. Смешайте с 1 мл физиологического раствора и перемешайте до состояния суспензии бактерий.
   2. Сравните суспензию со стандартом Макфарланда No 0,5 для достижения той же мутности, чтобы иметь тот же размер инокулята во время экспериментов. Отрегулируйте концентрацию с помощью дополнительного физиологического раствора или бактерий.
   3. Привите пластины MHA с помощью стерильного аппликатора с ватным наконечником. Аккуратно промокните пластину, чтобы покрыть поверхность. Воспользуйтесь одним из трех методов, описанных ниже (1.4-1.6).
4. Одиночный тест на устойчивость к антибиотикам. Streptococcus группа G, устойчивость к пенициллину G или гентамицину
   1. Поместите тест-полоску E-теста (пенициллин G или гентамицин) в центр пластины MHA (Рисунок 1 A,B).
   2. Инкубировать в течение 18-20 часов, 37°C.
   3. Ознакомьтесь с результатами. MIC измеряется как зона ингибирования, которая пересекает классифицированную тест-полоску для антибиотиков (Рисунок 1, C,D).

Рисунок 1: Одиночный E-тест. Размещение полоски Е-теста A) пенициллина G и B) гентамицина на агаровой пластине Мюллера-Хинтона, покрытой колониями бактерий стрептококков группы G до (A и B) и после (C и D) в течение ночной инкубации при 37°C 5% CO₂. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

5. Кросс-подход к тестированию синергии. Streptococcus группа G, устойчивость к пенициллину G и гентамицину.
   1. Поместите две полоски Е-теста с различными антибиотиками (например, пенициллином G и гентамицином) на инокулированную пластину MHA крест-накрест.
      1. Для получения наиболее точных результатов стремитесь расположить крест под углом примерно 90° на пересечении чешуек со значениями MIC, предварительно определенными с помощью одного теста на устойчивость к антибиотикам (Рисунок 2 A).
      2. Обратите внимание, что после того, как полоски помещены на агаровую пластину, их не следует перемещать, так как некоторые антибиотики могли уже впитаться пластиной. Поэтому более целесообразно держать полосы под немного неправильным углом (например, 85°) и на расстоянии до 1-2 мм от фактического значения MIC. Рекомендуется проводить эксперимент в трех экземплярах, чтобы уменьшить эту проблему.
   2. Инкубировать в течение 18-20 часов, 37°C.
   3. Ознакомьтесь с результатами. MIC измеряется как зона ингибирования, которая пересекает классифицированную тест-полоску для антибиотиков на каждой соответствующей полоске Е-теста (Рисунок 2 B).
   4. Используйте формулу для определения фракционной ингибиторной концентрации (FIC) (Уравнение 1) для определения синергии.

Рисунок 2: Обнаружение синергизма - перекрестный тест. Результаты антимикробного синергетического тестирования МПК пенициллина G и гентамицина на Streptococcus группы G до (A) и после (B) инкубации в течение ночи при 37°C 5% CO₂. Между двумя отдельными значениями МПК образуется угол 90° (пенициллин G: 0,094 мкг/мл, гентамицин: 8 мкг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Тестирование синергии без перекрестного подхода. Streptococcus группа G, устойчивость к пенициллину G и гентамицину.
   1. Поместите полоску Е-теста в центр пластины MHA (Рисунок 3 A,D).
   2. Отметьте, где на каждой полоске находилось ранее определенное значение MIC.
   3. Выдерживать в течение 1 часа при комнатной температуре.
   4. Выбросьте полоску для Е-теста для каждой пластины MHA (Рисунок 3 B,E).
   5. Поместите вторую полоску Е-теста (содержащую другой антибиотик) на область ранее удаленной полоски соответственно так, чтобы их значения MIC соответствовали отметке и были выровнены.
   6. Инкубировать в течение 18-20 часов, 37°C.
   7. Ознакомьтесь с результатами. MIC измеряется как зона ингибирования, которая пересекает классифицированную тест-полоску для антибиотиков на каждой соответствующей полоске Е-теста (Рисунок 3 C,F).
   8. Для определения синергии используется формула для фракционной ингибирующей концентрации (FIC) (Уравнение 1).

Рисунок 3: Обнаружение синергизма - неперекрестный тест. Результаты антимикробного синергетического тестирования МПК пенициллина G и гентамицина на Streptococcus группы G. A) Полоска гентамицина (8 мкг/мл в центре) поверх Streptococcus группы G, B) Удаление полоски гентамицина, C) Комбинированная полоска гентамицина/пенициллина G (0,094 мкг/мл в центре) поверх Streptococcus группа G-бактерий, D) Пенициллин-полоска G (0,094 мкг/мл в центре), E) Удаление пенициллина G-полоска, F) Комбинированная полоска пенициллина G / гентамицина (8 мкг/мл в центре) поверх Streptococcus бактерии группы G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Тестирование бульона

1. Настройка
   1. Наденьте перчатки и халат
   2. Подготовьте рабочее пространство, стерилизовав его с использованием 70% этанола
   3. Наберите 15 мл MH бульона с 50% лизированной лошадиной кровью и 20 мг/мл β-NAD (MH-F)
2. (Дополнительный) Выполните E-тест [Протокол 1] для определения MIC на твердой среде
   1. Хотя такие знания являются необязательными, они позволят улучшить план эксперимента (например, концентрации добавляемых антибиотиков могут быть спроектированы таким образом, чтобы окружать значение MIC, определенное из планшета), повышая шансы на успех эксперимента.
3. Приготовление бактериального посевного материала. Как указано выше, концентрацию бактерий можно оценить с помощью измерений OD nm или норм мутности Макфарланда
   1. Метод OD600 нм
      1. Получить бактериальную суспензию с установленной бактериальной концентрацией
      2. Разведите культуру в бульоне MH-F до достижения OD600 0,003
   2. Метод мутности Макфарланда
      1. Положите 15 мл бульона MH-F в стерильную пробирку.
      2. Заквашите бульон MH-F бактериями (из тарелки) до уровня Макфарланда. Энергично вгоняйте раствор. Перелейте раствор в стерильную чашку Петри.
4. Приготовление антибиотиков
   1. Определите желаемую концентрацию антибиотиков
      1. Определите значение MIC по E-тесту (например, 0,125 мкг/мл для пенициллина G и 8 мкг/мл для гентамицина)
      2. Умножьте значение MIC агаровой пластины на 2⁴-2⁷, что соответствует четырем-семи 2-кратным последовательным разведениям. Это и будет начальная концентрация антибиотиков. (например, для пенициллина G — семь 2-кратных серийных разведений: 0,125 мкг/мл x 2⁷ = 16 мкг/мл; для гентамицина — четыре 2-кратных серийных разведения 8 мкг/мл x 2⁴ = 128 мкг/мл
      )
      3. Умножьте желаемое начальное значение в 100 раз, чтобы определить исходную концентрацию антибиотиков (например, запасы 1,6 мг/мл пенициллина G и 12,8 мг/мл гентамицина)
   2. Приготовьте 100-кратную концентрацию антибиотика в запасе соответственно
      1. Растворите антибиотики в 10 мл автоклавированной воды и сформируйте исходный раствор (например, 16 мг пенициллина G и 128 мг гентамицина для создания вышеуказанных запасов)
5. Добавление бактерий в микропланшетные лунки
   1. Аликвота 200 мкл MH-F бульона, содержащего бактерии, заменяется в лунки в первых 3 рядах 96-луночного микротитровального планшета для эксперимента в трех экземплярах.
6. Добавляйте антибиотики в микропланшетные лунки
   1. Добавьте 200 μL дополнительного бульона MH-F с бактериями в первую колонну лунок (A1, B1, C1), чтобы довести общий объем до 400 μL.
   2. Добавьте 4 мкл запасной концентрации антибиотиков в первую колонну лунок. Поскольку образец содержит 400 μл, это приведет к 100-кратному разведению антибиотиков.
   3. Сгенерируйте 2-кратное серийное разведение, перенеся 200 мкл бактерий/антибиотиков из А1 в А2 вплоть до А11. Энергично пипетируйте между разведениями. Повторите этот шаг для дополнительных строк.
   4. Удалите 200 μL из столбца 11 так, чтобы конечный объем во всех лунках составил 200 μL.
   5. Последнюю колонку (А12, В12, С12) оставьте без антибиотиков, в качестве контроля.
7. Определение значений MIC
   1. Инкубируйте 96-луночный микротитровальный планшет в течение 24 часов при 37°C без встряхивания.
   2. Значение MIC определяется как последняя лунка в ряду разведения, в которой не наблюдается видимого роста бактерий (Рисунок 4). Однако этому значению можно доверять только в том случае, если исходный размер инокулята был правильным.

Рисунок 4: Определение MIC путем разбавления бульона. MIC здесь определяется как последняя лунка, которая проявляет прозрачность (отсутствие роста бактерий) перед изменением мутности. Строки являются дубликатами значения MIC пенициллина G, а строки являются дубликатами значения MIC гентамицина, оба против изолята Streptococcus группы G. A) фактический экспериментальный результат, B) схематическая интерпретация значений из A (серый = отсутствие роста; белый = рост). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Схематическая методика серий разведения для подсчета исходной концентрации бактерий. Разведения проводили, как описано (20 μL разведили в 180 μL для 10-кратной серии разведения), а затем 10 μL из рядов A-H наносили на два отдельных кровяных агаровых планшета, как показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

8. Определение исходного размера инокулята
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы микробульона очень чувствительны к исходному размеру используемого инокулята. Чрезмерный размер инокулята даст ложноположительный результат, так как добавленные антибиотики больше не смогут подавлять рост при таком соотношении. Поэтому очень важно проверить, сколько бактерий было добавлено в микролунки. Хотя данные не будут доступны в момент проведения эксперимента (из-за необходимости 24-часовой инкубации), они будут служить в качестве контрольных. Если количество добавленных бактерий находится в пределах указанного диапазона концентраций, значениям MIC можно доверять. Если инокулюм был слишком высоким или слишком низким, эксперимент нужно повторить.
   1. Серийное разбавление бактерий
      1. Подготовьте 96-луночный планшет для микротитрования для разбавления исходной бактериальной концентрации, чтобы определить размер посевного материала. Оптимальным считается объем 200 мкл с 10^5-6 бактериями. Для проведения разведений сначала аликвоту 180 мкл стерильной PBS в каждую лунку в B-H (в трех экземплярах 1-3).
      2. Далее добавьте в А 100 μл бактериального раствора (в трех экземплярах 1-3).
      3. Сгенерируйте 10-кратное серийное разведение (в трех экземплярах) путем переноса 20 мкл бактерий из А в В, энергично пипетируйте. Повторите действия для C-H.
   2. Планшет с бактериальными разведениями для определения размера инокулята
      1. Отметьте пластины с кровяным агаром в соответствии с Рисунок 5.
      2. Перенесите 10 мкл из серийного разведения на планшет в соответствии с рисунком Рисунок 5.
      3. Выдерживайте пластину при температуре 37°C в течение 20-24 часов.
   3. Определение размера бактериального инокулята
      1. Подсчитайте количество бактерий в пятнах в пределах 5-50 колоний (Рисунок 6).
      2. Рассчитайте начальный размер инокулята, рассчитав среднее значение тройных образцов, умножьте на коэффициент разбавления (например, 10x для образцов B, 100x для образцов C, 1000x для образцов D и т. д.), а затем на 100, чтобы компенсировать объем пятнистости в 10 μл, в результате чего размер инокулята в КОЕ/мл. Если инокулюм находится в пределах 10^5-6 кое/мл, данным MIC можно доверять.

Рисунок 6: Определение размера посевного материала. Бактерии, инокулированные в соответствии с рисунком 5, инкубировали в течение 20-24 часов при 37°С, а затем подсчитывали. В ряду D есть большое количество колоний для подсчета (например, 5-50). Образцы в А разбавляются в неразбавленном виде, в В разбавляют в 10 раз, С разбавляют в 100 раз, а D разбавляют в 1000 раз, и в каждом пятне покрывается только 10 мкл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.