Анализ бляшек: метод определения титра вируса в виде единиц образования бляшек (БОЕ)

1. Настройка

1. Прежде чем приступать к любым работам, связанным с микробами, убедитесь, что рабочее место стерилизовано (например, протерто 70% этанолом). Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки, держите длинные волосы завязанными назад и убедитесь, что любые раны особенно хорошо защищены.
2. По завершении простерилизуйте все поверхности и тщательно вымойте/простерилизуйте руки и запястья.

2. Протокол

1. LB Подготовка среды
   заметка: В зависимости от бактериального штамма-хозяина и бактериофага, для первоначального культивирования бактериального штамма-хозяина более подходящей может быть другая жидкая среда, а для последующего роста может быть более подходящая другая твердая среда. В этом протоколе для бульона и агара используется бульон лизогенез (LB).
   1. Смешайте 4 г LB с 200 мл дистиллированной воды в трех количествах для бульона LB, агара с твердым дном и агара с мягким верхом. Все растворы должны быть приготовлены в контейнерах, способных вместить в два раза больше конечного объема, чтобы предотвратить переполнение при автоклавировании.
      заметка: При проведении анализа в трех экземплярах приготовьте двойное количество нижнего агара LB.
   2. Отрегулируйте pH всех трех растворов до 7,4 с использованием NaOH или HCl в зависимости от ситуации.
   3. Добавьте 3 г агара на дно бутылки с агаром, чтобы получить 1,5% раствор агара для твердого агара
   4. Добавьте 1,2 г агаровой мощности в верхнюю бутылку с агаром, чтобы получился 0,6% раствор агара для мягкого агара.
   5. Поместите флаконы с полузатянутыми крышками в автоклав, установленный на 121°C, на 20 минут для стерилизации растворов. Закройте крышки сразу после окончания прогона, чтобы предотвратить загрязнение.
   6. Когда среда LB достигнет температуры приблизительно 45-50°C, добавьте 450 мкл стерильного 1 М CaCl₂ ко всем трем растворам объемом 200 мл LB, чтобы получить конечную концентрацию 2,25 мМ.
   7. Налейте 15 мл аликвот твердой агаровой среды в стерильные чашки Петри (избегайте встряхивания во избежание пенообразования) и дайте агару застыть в течение нескольких часов или в течение ночи при комнатной температуре (Рисунок 4A). Тарелки можно хранить в перевернутом виде при температуре 4°C в течение нескольких дней.
2. Культивирование клеток хозяина
   1. За сутки до анализа добавьте 10 мкл культуры E. coli к 10 мл бульона LB.
   2. Инкубируйте бактерии при температуре 37°C в течение ночи при 160 об/мин в встряхивающем инкубаторе.
   3. Утром в день анализа добавьте 0,5 мл ночного посева к 10 мл свежего LB.
      заметка: Если вы проводите анализ в трех экземплярах, приготовьте двойное количество этой культуры.
   4. Инкубируйте при температуре 37°C при 160 об/мин в встряхивающем инкубаторе до тех пор, пока бактериальная культура не перейдет в логарифмическую фазу роста. Это можно определить спектрофотометрически с помощью OD600 0,5-0,7.
   5. Держите культуру при комнатной температуре до тех пор, пока бактерии не будут добавлены в верхний агар LB.
3. 10-кратное серийное разведение бактериофага
   1. Добавьте 180 мкл бульона LB в семь лунок в первом ряду на 96-луночный планшет
      заметка: Предлагается проводить разведение в трех экземплярах с целью повышения его статистической достоверности. Для этого готовят дополнительные разведения бактериофага во втором и третьем рядах пластины.
   Тщательно переведите
   2. исходный образец бактериофага в вихрь, чтобы обеспечить однородность, и переведите 20 мкл в первую лунку.
   3. Хорошо перемешайте образец с помощью пипетки и вниз.
   4. Перелейте 20 мкл полученной суспензии во вторую лунку.
   5. Продолжайте серийное разведение, переливая 20 мкл раствора из второй лунки в третью лунку, и так далее, до шестой лунки, оставляя седьмую лунку в качестве отрицательного контроля, к которому не будет добавляться фаговая суспензия. Это создаст диапазон разведения 10-1-10-6.
4. металлизация
   1. Пометьте основание чашек Петри (ранее подготовленных на шаге 2.1.7) названием, датой и кратким описанием образца (включая коэффициент разведения фагового образца). Предварительно разогрейте чашки Петри в инкубаторе с температурой 37°C за час до анализа.
   2. Растопите затвердевшую мягкую агаровую среду (обычно это делается с помощью микроволновой печи; затвердевший агар плавится при 85 ° C) и дайте ему нагреться до температуры около 45 ° C. Нагретую среду можно поместить в водяную баню при температуре 45°C на ~1 час для достижения соответствующей температуры. Он должен быть достаточно горячим, чтобы оставаться в жидкой форме, но достаточно холодным, чтобы не убить добавленные бактерии.
   3. Смешайте 4 мл бактериальной культуры (начиная с шага 2.2) с 35 мл мягкого агара (при 45°C). Поворачивайте, чтобы равномерно распределить ячейки, но избегайте встряхивания, чтобы предотвратить пенообразование (Рисунок 4A).
   4. Пометьте одну стерильную пробирку для каждой из стадий серийного разведения и одну для контрольного образца, всего 7 помеченных пробирок. Поместите 5 мл аликвот смеси бактериальной культуры и мягкого агара из шага 2.4.3 в 7 пробирок. Выполняйте шаг 2.4.6 быстро, так как такие небольшие объемы среды на основе агара быстро затвердевают при комнатной температуре.
   5. Добавьте 100 мкл контрольного образца (начиная с шага 2.3) в контрольную пробирку и осторожно перемешайте. Выбросьте использованный наконечник для пипетки и перенесите одинаковый объем из каждого из серийно разбавленных образцов бактериофага (шаг 2.3) в соответствующие пробирки, перемешивая их.
   6. Немедленно переложите смесь объемом 5 мл на маркированные, предварительно нагретые, твердые агаровые пластины (Рисунок 4A). Аккуратно перемешайте пластины, чтобы равномерно распределить смеси.
      заметка: Если вы проводите анализ в трех экземплярах, повторите шаги 2.4.3-6 еще два раза.
   7. Запечатайте каждую пластину лабораторной пленкой и дайте обоим слоям как следует застыть при комнатной температуре (примерно 15 минут), прежде чем поместить их вверх ногами в инкубатор с температурой 37°C, стимулируя рост как бактерий, так и фага, на 24 часа или до тех пор, пока не появятся бляшки. Обычно требуется около 1-5 дней для появления бляшек (Рисунок 4B), но сроки значительно варьируются в зависимости от условий инкубации, среды и вида бактерий.

3. Анализ данных и результаты

1. Подсчет бляшек
   1. Убедитесь, что на табличках с пометкой «контроль» не видно бляшек, так как это может указывать на вирусное заражение.
   2. Начните с табличек с маркировкой ^10-6, содержащих наиболее разбавленный образец бактериофага. Пересчитайте бляшки, не снимая крышку, отмечая их ручкой по ходу дела, чтобы указать, какие бляшки уже были подсчитаны.
   3. Пересчитайте оставшиеся тарелки. На некоторых табличках может быть слишком мало или слишком много табличек для сосчета. Используйте пластины с 10-150 бляшками для дальнейшего анализа.
2. Расчет PFU
   1. Разделите количество бляшек на коэффициент разбавления (например, ^10-6 для наиболее разбавленного образца), чтобы получить количество единиц образования бляшек (PFU) в 100 мкл смеси фагов.
      заметка: Если вы проводите анализ в трех экземплярах, используйте среднее количество бляшек из трех пластин
   .
   2. Чтобы определить концентрацию (в БОЕ/мл) исходного образца, умножьте на дополнительный коэффициент разбавления, равный 10, так как только 100 мкл образца был покрыт гальваническим покрытием. (т.е. )
   3. Рассчитайте среднее значение PHE/мл для всех разведений, которые имели от 10 до 150 бляшек, чтобы получить более надежный результат.