6.9: Анализ бляшек: метод определения титра вируса в виде единиц образования бляшек (БОЕ)

1. Настройка

1. Прежде чем приступать к любым работам, связанным с микробами, убедитесь, что рабочее место стерилизовано (например, протерто 70% этанолом). Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки, держите длинные волосы завязанными назад и убедитесь, что любые раны особенно хорошо защищены.
2. По завершении простерилизуйте все поверхности и тщательно вымойте/простерилизуйте руки и запястья.

2. Протокол

1. LB Подготовка среды
   заметка: В зависимости от бактериального штамма-хозяина и бактериофага, для первоначального культивирования бактериального штамма-хозяина более подходящей может быть другая жидкая среда, а для последующего роста может быть более подходящая другая твердая среда. В этом протоколе для бульона и агара используется бульон лизогенез (LB).
   1. Смешайте 4 г LB с 200 мл дистиллированной воды в трех количествах для бульона LB, агара с твердым дном и агара с мягким верхом. Все растворы должны быть приготовлены в контейнерах, способных вместить в два раза больше конечного объема, чтобы предотвратить переполнение при автоклавировании.
      заметка: При проведении анализа в трех экземплярах приготовьте двойное количество нижнего агара LB.
   2. Отрегулируйте pH всех трех растворов до 7,4 с использованием NaOH или HCl в зависимости от ситуации.
   3. Добавьте 3 г агара на дно бутылки с агаром, чтобы получить 1,5% раствор агара для твердого агара
   4. Добавьте 1,2 г агаровой мощности в верхнюю бутылку с агаром, чтобы получился 0,6% раствор агара для мягкого агара.
   5. Поместите флаконы с полузатянутыми крышками в автоклав, установленный на 121°C, на 20 минут для стерилизации растворов. Закройте крышки сразу после окончания прогона, чтобы предотвратить загрязнение.
   6. Когда среда LB достигнет температуры приблизительно 45-50°C, добавьте 450 мкл стерильного 1 М CaCl₂ ко всем трем растворам объемом 200 мл LB, чтобы получить конечную концентрацию 2,25 мМ.
   7. Налейте 15 мл аликвот твердой агаровой среды в стерильные чашки Петри (избегайте встряхивания во избежание пенообразования) и дайте агару застыть в течение нескольких часов или в течение ночи при комнатной температуре (Рисунок 4A). Тарелки можно хранить в перевернутом виде при температуре 4°C в течение нескольких дней.
2. Культивирование клеток хозяина
   1. За сутки до анализа добавьте 10 мкл культуры E. coli к 10 мл бульона LB.
   2. Инкубируйте бактерии при температуре 37°C в течение ночи при 160 об/мин в встряхивающем инкубаторе.
   3. Утром в день анализа добавьте 0,5 мл ночного посева к 10 мл свежего LB.
      заметка: Если вы проводите анализ в трех экземплярах, приготовьте двойное количество этой культуры.
   4. Инкубируйте при температуре 37°C при 160 об/мин в встряхивающем инкубаторе до тех пор, пока бактериальная культура не перейдет в логарифмическую фазу роста. Это можно определить спектрофотометрически с помощью OD600 0,5-0,7.
   5. Держите культуру при комнатной температуре до тех пор, пока бактерии не будут добавлены в верхний агар LB.
3. 10-кратное серийное разведение бактериофага
   1. Добавьте 180 мкл бульона LB в семь лунок в первом ряду на 96-луночный планшет
      заметка: Предлагается проводить разведение в трех экземплярах с целью повышения его статистической достоверности. Для этого готовят дополнительные разведения бактериофага во втором и третьем рядах пластины.
   Тщательно переведите
   2. исходный образец бактериофага в вихрь, чтобы обеспечить однородность, и переведите 20 мкл в первую лунку.
   3. Хорошо перемешайте образец с помощью пипетки и вниз.
   4. Перелейте 20 мкл полученной суспензии во вторую лунку.
   5. Продолжайте серийное разведение, переливая 20 мкл раствора из второй лунки в третью лунку, и так далее, до шестой лунки, оставляя седьмую лунку в качестве отрицательного контроля, к которому не будет добавляться фаговая суспензия. Это создаст диапазон разведения 10-1-10-6.
4. металлизация
   1. Пометьте основание чашек Петри (ранее подготовленных на шаге 2.1.7) названием, датой и кратким описанием образца (включая коэффициент разведения фагового образца). Предварительно разогрейте чашки Петри в инкубаторе с температурой 37°C за час до анализа.
   2. Растопите затвердевшую мягкую агаровую среду (обычно это делается с помощью микроволновой печи; затвердевший агар плавится при 85 ° C) и дайте ему нагреться до температуры около 45 ° C. Нагретую среду можно поместить в водяную баню при температуре 45°C на ~1 час для достижения соответствующей температуры. Он должен быть достаточно горячим, чтобы оставаться в жидкой форме, но достаточно холодным, чтобы не убить добавленные бактерии.
   3. Смешайте 4 мл бактериальной культуры (начиная с шага 2.2) с 35 мл мягкого агара (при 45°C). Поворачивайте, чтобы равномерно распределить ячейки, но избегайте встряхивания, чтобы предотвратить пенообразование (Рисунок 4A).
   4. Пометьте одну стерильную пробирку для каждой из стадий серийного разведения и одну для контрольного образца, всего 7 помеченных пробирок. Поместите 5 мл аликвот смеси бактериальной культуры и мягкого агара из шага 2.4.3 в 7 пробирок. Выполняйте шаг 2.4.6 быстро, так как такие небольшие объемы среды на основе агара быстро затвердевают при комнатной температуре.
   5. Добавьте 100 мкл контрольного образца (начиная с шага 2.3) в контрольную пробирку и осторожно перемешайте. Выбросьте использованный наконечник для пипетки и перенесите одинаковый объем из каждого из серийно разбавленных образцов бактериофага (шаг 2.3) в соответствующие пробирки, перемешивая их.
   6. Немедленно переложите смесь объемом 5 мл на маркированные, предварительно нагретые, твердые агаровые пластины (Рисунок 4A). Аккуратно перемешайте пластины, чтобы равномерно распределить смеси.
      заметка: Если вы проводите анализ в трех экземплярах, повторите шаги 2.4.3-6 еще два раза.
   7. Запечатайте каждую пластину лабораторной пленкой и дайте обоим слоям как следует застыть при комнатной температуре (примерно 15 минут), прежде чем поместить их вверх ногами в инкубатор с температурой 37°C, стимулируя рост как бактерий, так и фага, на 24 часа или до тех пор, пока не появятся бляшки. Обычно требуется около 1-5 дней для появления бляшек (Рисунок 4B), но сроки значительно варьируются в зависимости от условий инкубации, среды и вида бактерий.

3. Анализ данных и результаты

1. Подсчет бляшек
   1. Убедитесь, что на табличках с пометкой «контроль» не видно бляшек, так как это может указывать на вирусное заражение.
   2. Начните с табличек с маркировкой ^10-6, содержащих наиболее разбавленный образец бактериофага. Пересчитайте бляшки, не снимая крышку, отмечая их ручкой по ходу дела, чтобы указать, какие бляшки уже были подсчитаны.
   3. Пересчитайте оставшиеся тарелки. На некоторых табличках может быть слишком мало или слишком много табличек для сосчета. Используйте пластины с 10-150 бляшками для дальнейшего анализа.
2. Расчет PFU
   1. Разделите количество бляшек на коэффициент разбавления (например, ^10-6 для наиболее разбавленного образца), чтобы получить количество единиц образования бляшек (PFU) в 100 мкл смеси фагов.
      заметка: Если вы проводите анализ в трех экземплярах, используйте среднее количество бляшек из трех пластин
   .
   2. Чтобы определить концентрацию (в БОЕ/мл) исходного образца, умножьте на дополнительный коэффициент разбавления, равный 10, так как только 100 мкл образца был покрыт гальваническим покрытием. (т.е. )
   3. Рассчитайте среднее значение PHE/мл для всех разведений, которые имели от 10 до 150 бляшек, чтобы получить более надежный результат.

Бактериофаги, также называемые фагами, представляют собой вирусы, которые специфически заражают бактерии, и мы можем подтвердить их присутствие и количественно оценить их с помощью инструмента, называемого анализом бляшек. Бактериофаги заражают своих восприимчивых хозяев, сначала прикрепляясь к клеточной стенке бактерии и вводя их генетический материал. Затем они захватывают биосинтетический механизм клетки, чтобы реплицировать свою ДНК и производить многочисленные фаговые частицы потомства, которые они затем высвобождают путем лизисирования и убивают клетку-хозяина.

Эта литическая активность лежит в основе широко используемого метода подсчета фагов, известного как анализ бляшек или анализ двойного слоя агара. Здесь сначала готовится смесь бактериофагов в расплавленном бульоне, содержащем агар низкой концентрации. Все бактерии, используемые в смеси, должны быть живыми и активно делиться в бревенчатой фазе своего роста, что обеспечит жизнеспособность большого процента бактерий и способность образовывать плотный газон вокруг бляшек. Затем эта расплавленная бактериально-фаговая агаровая смесь распределяется по более твердой, концентрированной питательной среде агара, которая уже затвердела на чашке Петри. При инкубации при комнатной температуре бульон из агар-фаго-бактерий низкой концентрации также затвердевает, образуя мягкую агаровую накладку.

Здесь бактериальные клетки могут получать дополнительные питательные вещества из нижнего слоя и должны быстро размножаться, чтобы создать сливающуюся лужайку из бактерий. Однако, поскольку фаговые частицы также присутствуют в мягком слое, они будут заражать и реплицировать свой генетический материал внутри бактерий, что приведет к лизису клеток, который высвобождает множественное потомство. Эти фаговые потомки затем инфицируют соседние клетки, так как полутвердое состояние бактериального фагового слоя ограничивает их перемещение более удаленными клетками-хозяевами. Этот цикл заражения и лизиса продолжается в течение нескольких раундов, убивая большое количество бактерий в локализованной области. В результате разрушения соседних клеток образуется одна круглая прозрачная зона, называемая бляшкой, которую можно увидеть невооруженным глазом, эффективно усиливая литическую активность бактерий фага и позволяя их перечислять.

Количество бляшек на чашке Петри называется бляшкообразующими единицами, или БОЕ, и, при условии, что исходная концентрация бактериофага была достаточно разбавлена, должно непосредственно соответствовать количеству инфекционных фаговых частиц в исходном образце. Этот метод также может быть использован для характеристики морфологии бляшек, для помощи в идентификации типов фагов или для выделения фаговых мутантов. В этом лабораторном занятии вы узнаете, как проводить анализ бляшек для перечисления фагов на примере фага Т7 E. coli.

Во-первых, определите подходящую среду для культивирования бактериальных клеток хозяина и бактериофага. Здесь лизогенный бульон, или среда LB, использовался для культивирования E. coli и фага Т7. Далее возьмите три чистые стеклянные бутылки и пометьте их носителями, названием, а затем первую как LB-Broth, вторую как LB-Bottom Agar, а третью как LB-Top Agar. Теперь взвесьте четыре грамма предварительно приготовленного порошка LB в три комплекта, а затем переложите по одному комплекту взвешенной сухой среды в каждую бутылку. В первую бутылку добавьте 200 миллилитров воды. Перемешайте содержимое с помощью магнитной мешалки.

Затем с помощью рН-метра и постоянного помешивания доведите итоговый рН до 7,4 за счет добавления гидроксида натрия или соляной кислоты. Повторите добавление воды и регулировку pH для двух других оставшихся бутылок. Теперь взвесьте три грамма порошка агара и добавьте его во вторую бутылку, чтобы получился 1,5% нижний агар. Наконец, взвесьте 1. 2 грамма агара и добавьте его в третью бутылку, чтобы получился верхний агар с содержанием 0,6 % LB. Кондиция бульона в бутылке не нуждается в добавлении агара. Закройте бутылку полуплотной крышкой, а затем стерилизуйте среду путем автоклавирования при 121 градусе Цельсия в течение 20 минут. По завершении извлеките бутылки со средой из автоклава и немедленно закрутите крышки бутылок, чтобы полностью закрыть их, чтобы предотвратить загрязнение. Оставьте фильтрующий материал LB-Broth и агаровый фильтр LB-Top на столе для последующего использования. Поместите агар LB-Bottom для охлаждения на водяную баню, предварительно настроенную на температуру примерно 45 градусов Цельсия.

Когда агар LB-Bottom достигнет примерно 45 градусов по Цельсию, перенесите его на рабочий стол. Далее простерилизуйте рабочее место с помощью 70 % этенола. Далее добавьте 450 микролитров стерильного одного моляра хлорида кальция в расплавленный нижний агар, чтобы получить конечную концентрацию 2,25 миллимоля. Аккуратно перемешайте бутылку, чтобы перемешать. Затем выставьте семь чистых чашек Петри. Наклейте на каждое блюдо на дно этикетку с названием носителя и датой приготовления. Затем налейте по 15 миллилитров нижнего агара в каждую из семи чашек Петри. Дайте тарелкам застыть на несколько часов или на ночь при комнатной температуре. После установки культуральные планшеты можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких дней, если это необходимо, вверх ногами, чтобы свести к минимуму конденсацию. Перенесите чашки Петри из холодильника с температурой четыре градуса Цельсия в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия за час до анализа.

За день до проведения анализа следует культивировать кишечную палочку. Здесь 10 микролитров культуры кишечной палочки инокулировали в 10 миллилитров LB-бульона. Поместите бактерии для роста на ночь в встряхивающий инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия при 160 оборотах в минуту. Затем, в день проведения анализа, извлеките бактериальную культуру из инкубатора. Засейте свежими 10 миллилитрами свежего бульона LB с 0,5 миллилитрами ночной культуры. Поместите эти клетки для выращивания в встряхивающий инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия при 160 оборотах в минуту. Затем с помощью спектрофотометра проверьте, когда эта культура достигает роста в логарифмической фазе, о чем свидетельствует оптическая плотность от 0,5 до 0,7. Как только наружный диаметр достигнет этого уровня, остановите инкубацию, перенеся клеточную культуру на стол. Теперь они готовы к использованию для анализа фагового наложения.

Титры фагов могут экспоненциально изменяться в зависимости от типа фагов и образцов. Таким образом, чтобы эффективно подсчитывать их, их следует разбавлять для получения широкого диапазона концентраций фагов. В день проведения анализа сгенерируйте серию разведений фагов в концентрации от одной десятой до одной миллионной, используя метод 10-кратного разведения. Для получения статистически значимых и точных данных проводят серийное разведение в трех экземплярах.

Далее расплавьте застывший агар LB-top с помощью микроволновой печи. Затем поместите его на водяную баню с заданной температурой 45 градусов Цельсия на один час. Через час соберите из инкубатора чашки Петри, содержащие нижний слой агара. Пометьте планшеты концентрацией фагов и датой анализа. Затем выложите семь чистых пробирок. Пометьте каждую пробирку серийным номером разведения фагов и обозначьте одну из них как контрольную.

Когда агар LB-top достигнет 45 градусов по Цельсию, перенесите его на рабочий стол. Теперь добавьте 450 микролитров одного молярного хлорида кальция в 200 миллилитров агара, чтобы получить конечную концентрацию 2,25 миллимолара. Аккуратно перемешайте бутылку, чтобы перемешать. Далее добавьте в стерильную коническую пробирку 35 миллилитров агара LB-top и четыре миллилитра бактериальной суспензии. Аккуратно поворачивайте, чтобы равномерно распределить ячейки, но избегайте встряхивания во избежание пенообразования.

Теперь распределите по пять миллилитров этой бактерии и смешайте верхний агар в каждую из семи пробирок. Затем перенесите 100 микролитров серийно разбавленных образцов бактериофагов и контрольных сред, которые должны быть просто средами без бактериофагов, в пробирки с соответствующей маркировкой. Аккуратно перемешайте смесь, чтобы обеспечить правильное перемешивание. Аккуратно перенесите пять миллилитров смеси бактериофагов на соответствующую пластину Петри. Равномерно распределите смесь по всей поверхности, аккуратно поворачивая пластину Петри.

После того, как все пластины Петри будут покрыты смесью, дайте верхнему слою застыть, инкубируя при комнатной температуре в течение 15 минут. После завершения этих шагов повторите процесс для второго, а затем третьего наборов чашек Петри, используя оставшиеся два набора фаговых разведений. Запечатайте каждую посуду парапленкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Поместите культуральную пластину вверх дном при подходящей температуре на 24 часа или до тех пор, пока не появятся бляшки. Здесь планшеты были помещены в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на один день, что является стимулирующим условием роста для E. coli и фага T7.

Бляшки появляются через один-пять дней инкубации, в зависимости от вида бактерий, условий инкубации и выбора среды. Здесь бляшки были видны после одного дня инкубации при 37 градусах Цельсия. Начните с проверки табличек с пометкой «контроль» и убедитесь, что на этих пластинах не образовались бляшки, так как это может свидетельствовать о вирусном заражении. Чтобы определить титр фагов в исходном образце, начните с планшетов, содержащих наиболее разбавленный фаговый образец, и подсчитайте бляшки, не снимая крышек, помечая их, чтобы указать, какие из них уже были подсчитаны. Повторите подсчет для каждой тарелки в каждом сете. На некоторых табличках может быть слишком много или слишком мало табличек, чтобы их можно было сосчитать. Рассматривайте от 10 до 150 как идеальное количество бляшек.

Затем сформируйте таблицу со списком значений количества бляшек для различных разведений и реплик. Затем рассчитайте среднее количество бляшек для пластин разведения, которые содержали идеальное количество бляшек. В данном примере это было среднее количество бляшек, образовавшихся в пластинах разведения от 10 до минус трех и от 10 до минус четырех. Теперь скорректируйте фактор разведения фагов путем деления полученных средних значений бляшек на соответствующие коэффициенты разведения фагов. Здесь среднее количество бляшек, образованных с точностью до 10 к минус трем и от 10 до минус четырех разбавляющих пластин, было разделено на соответствующие коэффициенты разведения, чтобы получить количество образующих бляшек единиц, или БОЕ, в 100 микролитрах фаговой смеси. Чтобы перевести значение в PFU на миллилитр, умножьте полученные значения на 10, так как на этапе подготовки наложения бактериофагов было использовано всего 100 микролитров смеси для разведения фагов, что дало дополнительный коэффициент разбавления 10. Наконец, рассчитайте среднее арифметическое значений, полученных с различных разрежающих пластин. Это даст среднее количество БОЕ на миллилитр. Количество БОЕ соответствует количеству инфекционных фаговых частиц в исходном образце.