Трансформация клеток E. coli с использованием адаптированной процедуры с хлоридом кальция

В этом протоколе описывается получение и трансформация компетентного E. coli DH5α с использованием адаптации метода хлорида кальция (12).

1. Настройка

1. Оборудование
   • Спектрофотометр
   • Центрифуга Сорвал (или аналогичная)
   • Настольная центрифуга
   • Тепловой блок или водяная баня
   • Орбитальный встряхиватель
   • Стационарный инкубатор
   • Лоток для литья геля
   • Колодцы гребни
   • Источник напряжения
   • Гелевая коробка
   • Источник ультрафиолетового излучения
   • Микроволновая печь
2. Растворы и реагенты
   • Бульон Лурии-Бертани (LB) (10 г казеинового ферментного гидролизата, 5 г дрожжевого экстракта и 5 г хлорида натрия в 1000 мл H₂O)
   • Супер оптимальный бульон с подавлением катаболитов (SOC): (2% (w/v) триптон, 0,5% (w/v) экстракт дрожжей, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MgSO₄, и 20 мМ глюкозы)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 мМ MgCl₂, 20 мМ CaCl₂) раствор.
   • M CaCl₂ раствор (если клетки будут трансформироваться немедленно) или 0,1M раствор CaCl₂, содержащий 10% (v/v) глицерина (если клетки будут заморожены для дальнейшего использования).
   • Пластины для агара LB
   • Селективные пластины из агара LB (для этого эксперимента, поскольку используемая плазмида обеспечивает устойчивость к ампициллину, использовали агаровые пластины LB, содержащие ампициллин 100 г/мл)
   • E. coli штамм DH5α
   • ДНК плазмиды pUC19 (100 пг/мкл)
   • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
   • Фермент рестрикции HindIII
   • 1 кб плюс лестница ДНК
   • Низкая температура плавления Agarose
   • 1X буфер TAE (40 мМ трис основания, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА)
   • Бромид этидия (10 мг/мл)
3. Общие указания по технике безопасности
   E. coli DH5α классифицируется как уровень биобезопасности 1 (BSL1). Микробы этой категории практически не представляют угрозы инфицирования у здоровых взрослых. Однако требуются осторожные манипуляции с микроорганизмом.

ВАЖНО: Все шаги в этом протоколе должны выполняться с использованием асептических методов и при температуре льда или 4°C, если это не указано.

2. Протокол

1. Из замороженного бульона E. coli DH5α (замороженного в 20% глицерине из культуры, выращенной на ночь в LB) выделите бактерии для выделения на агаровой пластине LB. Инкубировать при температуре 37°C в течение ночи (16-20 часов).
2. Внесите одну колонию в 3 мл бульона LB в пробирке. Растите встряхивание при 210 об/мин при 37°C в течение ночи (16-20 часов).
3. Измерьте OD600 для ночной культуры. Используйте ночную культуру для инокуляции 100 мл LB бульона в 1-литровую колбу до OD600 = 0,01. Инкубируйте культуру, энергично встряхивая (210 об/мин) при 37°C, контролируя OD600 в спектрофотометре каждые 15-20 минут, до тех пор, пока культура не достигнет OD600=0,35 (примерно 3 часа).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы трансформация была эффективной, бактериальные клетки должны находиться в фазе среднего экспоненциального роста. Максимальное количество клеток должно составлять 10⁸ клеток/мл, что для большинства штаммов E. coli соответствует OD600=0,4. Использование спектрофотометра позволяет измерить OD600, что позволяет определить, что клетки находятся на соответствующей стадии роста. Если этот протокол будет использоваться для других штаммов бактерий, для определения этого соотношения потребуется калибровка для определения количества колоний, образующих единицы при определенных значениях OD600.
4. Перелейте по 50 мл культуры в каждую из 2 ледяных полипропиленовых бутылок центрифуги. Поставьте бутылки на лед на 20 минут, чтобы они остыли.
5. Восстановите клетки центрифугированием при 2700g (4100 об/мин в роторе Sorval GSA) в течение 10 мин при 4°C.
6. Удалите надосадочную жидкость. Слейте последние следы среды, поставив бутылку вверх дном на подушечку или бумажное полотенце.
7. Ресуспендируйте каждую бактериальную гранулу в 30 мл CaCl₂-MgCl₂ (80 мМ MgCl₂, 20 мМ CaCl₂) ледяного раствора. Сначала добавьте 5 мл раствора, осторожно перемешайте до полного растворения гранулы, а затем добавьте оставшиеся 25 мл раствора.
8. Повторите шаг 2.4.
9. Повторите шаг 2.5.
10. Если компетентные клетки собираются трансформироваться напрямую, повторно суспендируйте каждую бактериальную гранулу в 2 мл ледяного раствора CaCl₂ (0,1 М), осторожно вращая пробирки. Если при этом методе гранула не подвергается ресуспендированию, повторно суспендируйте, осторожно пипетируя вверх и вниз (избегая образования пузырьков).
    В качестве альтернативы компетентные клетки могут быть заморожены и сохранены для последующего использования. Чтобы получить замороженные запасы компетентных клеток, повторно суспендируйте гранулу в 2 мл 0,1М раствора CaCl₂, содержащего 10% (v/v) глицерина. Это решение должно быть ледяным. Суспензия аликвотных клеток в ледяные полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл (160 мкл на пробирку). Немедленно заморозьте компетентные клетки в ванне с сухим льдом и этанолом. Переложите пробирки в морозильную камеру при температуре -70°C.
11. Чтобы трансформировать клетки, обработанные CaCl₂, перенесите 50 мл компетентных клеток в каждую из 2 полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мкл (100 пг) плазмидной ДНК pUC19 в одну из пробирок и оставьте вторую пробирку без ДНК (отрицательный контроль). Аккуратно перемешайте (не допускайте образования пузырьков). Выдерживать 30 минут на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При преобразовании следует использовать не более 50 нг ДНК в объеме 10 мкл или менее.
12. Перенесите трубки в нагревательный блок и инкубируйте при температуре 42°C ровно 45 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой шок является критическим этапом. Не превышайте температуру или время инкубации.
13. Легко перекладывайте трубки на лед. Инкубировать в течение 2 мин.
14. Добавьте 950 мкл среды SOC и инкубируйте пробирки в течение 1 часа при 37°C, чтобы позволить бактериям восстановиться и экспрессировать устойчивый к антибиотикам маркер, закодированный в плазмиде.
15. Разведите 10 мкл клеточной суспензии в 1000 мкл в SOC (разведение 1/100) и 100 мкл клеточной суспензии в 1000 мкл в SOC (разведение 1/10). Нанесите 100 мкл разведений, а также контроль, на селективные планшеты и распределите с помощью шпателя. Как правило, осаждение на 100 мкл разведения 1/100 и 1/10 дает достаточное количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на пластину. В идеале это число должно находиться в пределах 30-300 КОЕ, чтобы было достаточно колоний, но отделенных друг от друга. Однако количество КОЕ будет зависеть от эффективности преобразования (см. раздел «Анализ данных и результаты»).
16. Инкубируйте планшеты при 37°С. Трансформированные колонии должны появиться через 12-16 часов (этот диапазон будет зависеть от штамма клетки и метода отбора). Никакие колонии не должны расти в отрицательном контроле.
17. Подсчитайте cfu/plate, полученные для преобразования (Таблица 1).
18. Чтобы убедиться, что трансформанты содержат плазмиду pUC19, будет выполнен плазмидный препарат и последующее разложение. Для этого закаляйте одну колонию в 3 мл бульона LB в пробирке. Растите встряхивание при 210 об/мин при 37°C в течение ночи (16-20 часов).
19. Приготовьте плазмидный препарат с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit, согласно инструкции от производителя.
20. Расщепите 1 г очищенного pUC19 с ферментом рестрикции HindIII при 37°C в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага можно использовать любой фермент, который разрезает сайт множественного клонирования pUC19.

Компонент	Сумма
10X буфер дайджеста ограничений	2.5 μl
Плазмида pUC19	1 μg
HindIII	1 μl
H2O	20,5 мкл (до 25 мкл)

21. Проведите молекулярно-массовую лестницу, расщепленную ДНК pUC19 и такое же количество непереваренной ДНК pUC19 в 1% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромида этидия, в течение 1 часа при 95 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: время и напряжение будут варьироваться в зависимости от используемого оборудования.
22. Визуализируйте гель под воздействием ультрафиолета. Сравните размер переваренной и непереваренной ДНК pUC19 (Рисунок 2) (см. раздел «Анализ данных и результаты»).
    Выполните необходимые шаги, необходимые для проверки преобразования в соответствии с целью каждого конкретного эксперимента по преобразованию.

Рисунок 2: Расщепление восстановленной плазмидной ДНК из трансформированных клеток DH5α. Плазмидную ДНК извлекали из трансформированных клеток DH5α, расщепляли с помощью HindIII, запускали в 1% агарозном геле и визуализировали с помощью УФ-источника (шаги 2.19 - 2.22).

3. Анализ данных и результаты

Для расчета эффективности трансформации, показателя того, насколько хорошо клетки усваивают внеклеточную ДНК, необходимо подсчитать колонии, полученные в результате трансформации:

Разбавление	Cfu
1/100	34
1/10	246

Таблица 1: Колониеобразующие единицы (КОЕ), подсчитанные по результатам эксперимента по трансформации.

Эффективность трансформации (TE) — это мера количества КОЕ, полученного в результате преобразования 1 г плазмиды в заданный объем компетентных клеток. На эффективность трансформации влияют многие параметры: размер плазмиды, генотип клетки, стадия роста при подготовке компетенций, методы трансформации и т.д.). При расчете TE важно учитывать, какое разведение (если таковое было) было выполнено перед нанесением покрытия, и включить его в расчет общего количества КОЕ. Эффективность преобразования (TE) рассчитывается с помощью следующего уравнения:

Сначала разделите КОЕ на μг ДНК, в данном примере 0,0001μg. Затем разделите полученный результат на коэффициент разбавления. В этом примере использовали разведение 1/10 и наносили 100 мкл раствора объемом 1 мл (разведение: 1/10 × 100 мкл /1000 мкл = 0,01).