Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Источник: Наталья Мартин1, Эндрю Дж. Ван Альст1, Рианнон М. ЛеВек1, и Виктор Дж. ДиРита1
1 Факультет микробиологии и молекулярной генетики, Университет штата Мичиган
Бактерии обладают способностью обмениваться генетическим материалом (дезоксирибонуклеиновой кислотой, ДНК) в процессе, известном как горизонтальный перенос генов. Включение экзогенной ДНК обеспечивает механизм, с помощью которого бактерии могут приобретать новые генетические признаки, позволяющие им адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, таким как наличие антибиотиков или антител (1) или молекул, найденных в естественной среде обитания (2). Существует три механизма горизонтального переноса генов: трансформация, трансдукция и конъюгация (3). Здесь мы сосредоточимся на трансформации, способности бактерий поглощать свободную ДНК из окружающей среды. В лаборатории процесс трансформации состоит из четырех основных этапов: 1) Подготовка компетентных клеток, 2) Инкубация компетентных клеток с ДНК, 3) Восстановление клеток и 4) Покрытие клеток для роста трансформантов (Рисунок 1).
Рисунок 1: Общие этапы процесса трансформации. Процесс трансформации состоит из четырех основных этапов: 1) Подготовка компетентных клеток, 2) Инкубация с ДНК, 3) Восстановление клеток и 4) Подготовка клеток к росту трансформантов.
Чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна находиться в состоянии, известном как компетентность. Некоторые бактерии обладают способностью становиться естественно компетентными в ответ на определенные условия окружающей среды. Однако многие другие бактерии не становятся компетентными естественным путем, или условия для этого процесса пока неизвестны. Возможность введения ДНК в бактерии имеет ряд исследовательских применений: для создания нескольких копий интересующей молекулы ДНК, для экспрессии большого количества белков, в качестве компонента в процедурах клонирования и другие. Из-за важности трансформации для молекулярной биологии, существует несколько протоколов, направленных на создание искусственно компетентных клеток, когда условия для естественной компетентности неизвестны. Для получения искусственно компетентных клеток используются два основных метода: 1) путем химической обработки клеток и 2) воздействие на клетки электрических импульсов (электропорация). Первый использует различные химические вещества в зависимости от процедуры для создания притяжения между ДНК и поверхностью клетки, в то время как второй использует электрические поля для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые молекулы ДНК могут проникать. Наиболее эффективным подходом для химической компетентности является инкубация с двухвалентными катионами, в первую очередь с кальцием (Ca2+) (4,5) Кальций-индуцированная компетентность - это процедура, которая будет описана здесь (6). Этот метод в основном используется для трансформации грамотрицательных бактерий, и это будет основным направлением данного протокола.
Процедура химической трансформации включает в себя ряд этапов, в ходе которых клетки подвергаются воздействию катионов для индуцирования химической компетентности. За этими шагами следует изменение температуры - тепловой шок - который способствует поглощению чужеродной ДНК компетентной клеткой (7). Оболочки бактериальных клеток заряжены отрицательно. У грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, внешняя мембрана отрицательно заряжена из-за присутствия липополисахарида (ЛПС) (8). Это приводит к отталкиванию аналогично отрицательно заряженных молекул ДНК. При индукции химической компетентности положительно заряженные ионы кальция нейтрализуют это отталкивание, обеспечивая поглощение ДНК на поверхности клетки (9). Обработка кальцием и инкубация с ДНК производятся на льду. Затем проводится инкубация при более высоких температурах (42°C), тепловой шок. Этот температурный дисбаланс еще больше способствует поглощению ДНК. Бактериальные клетки должны находиться в среднеэкспоненциальной фазе роста, чтобы выдержать лечение тепловым шоком; На других стадиях роста бактериальные клетки слишком чувствительны к теплу, что приводит к потере жизнеспособности, что значительно снижает эффективность трансформации.
Для трансформации можно использовать различные источники ДНК. Как правило, плазмиды, небольшие круглые двухцепочечные молекулы ДНК, используются для трансформации в большинстве лабораторных процедур у E. coli. Чтобы плазмиды сохранялись в бактериальной клетке после трансформации, они должны содержать источник репликации. Это позволяет им реплицироваться в бактериальной клетке независимо от бактериальной хромосомы. Не все бактериальные клетки преображаются во время процедуры трансформации. Таким образом, трансформация дает смесь трансформированных и нетрансформированных клеток. Чтобы различить эти две популяции, используется метод отбора для идентификации клеток, которые приобрели плазмиду. Плазмиды обычно содержат селективные маркеры, которые представляют собой гены, кодирующие признак, дающий преимущество для роста (например, устойчивость к антибиотикам или химическим веществам или спасение от ауксотрофии роста). После трансформации бактериальные клетки помещаются на селективную среду, которая позволяет только расти трансформированным клеткам. В случае клеток, трансформированных с помощью плазмиды, придающей устойчивость к данному антибиотику, селективной средой будет питательная среда, содержащая этот антибиотик. Несколько различных методов могут быть использованы для подтверждения того, что колонии, выращенные в селективной среде, являются трансформантами (т.е. инкорпорировали плазмиду). Например, плазмиды могут быть извлечены из этих клеток с помощью методов препарирования плазмид (10) и расщеплены для подтверждения размера плазмиды. В качестве альтернативы для подтверждения наличия интересующей плазмиды можно использовать ПЦР с колониями (11).
Целью данного эксперимента является получение E. coli DH5α химически компетентных клеток, используя адаптацию метода с хлоридом кальция (12), и их трансформация с помощью плазмиды pUC19 для определения эффективности трансформации. Штамм E. coli DH5α является широко используемым штаммом в молекулярной биологии. Благодаря своему генотипу, в частности recA1 и endA1, этот штамм обеспечивает повышенную стабильность вставки и улучшает качество плазмидной ДНК в последующих препаратах. Поскольку эффективность трансформации снижается с увеличением размера ДНК, в этом протоколе была использована плазмида pUC19 из-за ее малого размера (2686 п.н.) (векторную карту см. в https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html). pUC19 придает устойчивость к ампициллину, и, таким образом, именно этот антибиотик использовался для селекции.
В этом протоколе описывается получение и трансформация компетентного E. coli DH5α с использованием адаптации метода хлорида кальция (12).
1. Настройка
ВАЖНО: Все шаги в этом протоколе должны выполняться с использованием асептических методов и при температуре льда или 4°C, если это не указано.
2. Протокол
| Компонент | Сумма |
| 10X буфер дайджеста ограничений | 2.5 μl |
| Плазмида pUC19 | 1 μg |
| HindIII | 1 μl |
| H2O | 20,5 мкл (до 25 мкл) |
Рисунок 2: Расщепление восстановленной плазмидной ДНК из трансформированных клеток DH5α. Плазмидную ДНК извлекали из трансформированных клеток DH5α, расщепляли с помощью HindIII, запускали в 1% агарозном геле и визуализировали с помощью УФ-источника (шаги 2.19 - 2.22).
3. Анализ данных и результаты
Для расчета эффективности трансформации, показателя того, насколько хорошо клетки усваивают внеклеточную ДНК, необходимо подсчитать колонии, полученные в результате трансформации:
| Разбавление | Cfu |
| 1/100 | 34 |
| 1/10 | 246 |
Таблица 1: Колониеобразующие единицы (КОЕ), подсчитанные по результатам эксперимента по трансформации.
Эффективность трансформации (TE) — это мера количества КОЕ, полученного в результате преобразования 1 г плазмиды в заданный объем компетентных клеток. На эффективность трансформации влияют многие параметры: размер плазмиды, генотип клетки, стадия роста при подготовке компетенций, методы трансформации и т.д.). При расчете TE важно учитывать, какое разведение (если таковое было) было выполнено перед нанесением покрытия, и включить его в расчет общего количества КОЕ. Эффективность преобразования (TE) рассчитывается с помощью следующего уравнения:
Сначала разделите КОЕ на μг ДНК, в данном примере 0,0001μg. Затем разделите полученный результат на коэффициент разбавления. В этом примере использовали разведение 1/10 и наносили 100 мкл раствора объемом 1 мл (разведение: 1/10 × 100 мкл /1000 мкл = 0,01).
Бактерии удивительно легко приспосабливаются, и одним из механизмов, который способствует этой адаптации, является их способность поглощать внешние молекулы ДНК. Один из типов ДНК, который могут поглощать бактерии, называется плазмидой, кольцевым участком ДНК, который часто содержит полезную информацию, такую как гены устойчивости к антибиотикам. Процесс модификации бактерий с помощью новой генетической информации, полученной из внешнего источника, называется трансформацией. Трансформация может быть легко выполнена в лаборатории с использованием кишечной палочки или E. coli.
Для того, чтобы трансформироваться, клетки E. coli должны быть сначала сделаны компетентными, то есть способными поглощать молекулы ДНК из окружающей среды. Протокол для этого удивительно прост — короткая инкубация клеток в растворе хлорида кальция. Эта инкубация приводит к тому, что клетки становятся проницаемыми для молекул ДНК. После того, как клетки гранулируются центрифугированием, надосадочная жидкость удаляется. Теперь плазмидная ДНК добавляется к компетентным клеткам. После инкубации клеток с ДНК смесь кратковременно нагревают до 42 градусов Цельсия с последующим быстрым охлаждением на льду. Этот тепловой шок приводит к тому, что ДНК переносится через клеточную стенку и мембраны. Затем клетки инкубируются в свежих средах. Затем бактерии помещают под температурой 37 градусов, чтобы они могли повторно запечатать свои мембраны и экспрессировать устойчивые белки.
Те клетки, которые впитали плазмиды, будут точно копировать ДНК и передавать ее своему потомству, а также экспрессировать любые белки, которые могут быть закодированы ею, включая медиаторы устойчивости к антибиотикам. Эти гены резистентности могут быть использованы в качестве селективных маркеров для идентификации бактерий, которые были успешно преобразованы, потому что клетки, не поглотившие плазмиду, не будут экспрессировать продукт гена резистентности. Это означает, что когда клетки помещаются в твердую среду, содержащую соответствующий антибиотик, будут расти только клетки, которые впитали плазмиду. Трансформация клеток в растущей колонии может быть дополнительно подтверждена путем культивирования этих клеток в жидких средах в течение ночи для увеличения выхода перед извлечением ДНК из образца. После того, как ДНК выделена, можно провести диагностическое расщепление фермента рестрикции. Поскольку ферменты рестрикции разрезают ДНК в предсказуемых местах, запуск этих расщеплений на геле должен показать предсказуемую картину, если желаемая плазмида была успешно преобразована. Например, если pUC19 получают и разрезают с помощью фермента рестрикции HindIII, на геле должна быть видна одна полоса из 2686 нуклеотидов.
В этой лаборатории вы преобразуете E. coli штамм DH-5 Alpha с pUC19, а затем подтвердите успешную трансформацию с помощью электрофореза в ДНК-геле.
Перед началом процедуры наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе лабораторный халат и перчатки. Далее простерилизуйте рабочее место с помощью 70% этанола.
Теперь подготовьте химически компетентные клетки, поместив петлю с бактериями на стерильную пластину из агара LB и заполнив бактерии новой петлей. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день снова простерилизуйте столешницу 70% этанолом и достаньте тарелку из инкубатора.
Инокулируйте одну, хорошо изолированную колонию в 3 миллилитра бульона LB в пробирке со стерильной петлей. Затем выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 210 оборотах в минуту. На следующий день измерьте оптическую плотность ночной культуры с помощью спектрофотометра. Затем добавьте 100 миллилитров бульона LB в литровую колбу и заквашите его ночной культурой при оптической плотности 0. 01. Теперь инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием и проверяйте OD600 каждые 15-20 минут, пока культура не достигнет среднеэкспоненциальной фазы роста.
Примерно через три часа перелейте 50 миллилитров культуры в две ледяные полипропиленовые бутылки. Затем поставьте бутылки обратно на лед на 20 минут, чтобы они остыли. Затем восстановите клетки с помощью центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и поставьте флаконы вверх дном на бумажное полотенце. Затем повторно суспендируйте бактериальную гранулу в пяти миллилитрах ледяного раствора хлорида кальция и магния и осторожно взбейте до полного растворения гранулы. Затем добавьте еще 25 миллилитров раствора в растворенную бактериальную гранулу. Повторно суспендируйте другую бактериальную гранулу, как показано ранее. После этого повторите центрифугирование, и удалите надосадочную жидкость.
Если компетентные клетки будут трансформироваться напрямую, ресуспендируйте каждую бактериальную гранулу в двух миллилитрах ледяного 0,1 молярного раствора хлорида кальция, осторожно вращая трубки. Чтобы начать процедуру трансформации, перенесите 50 микролитров компетентных клеток в две меченые полипропиленовые трубки объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте один микролитр плазмидной ДНК pUC19 в одну из пробирок. Аккуратно перемешайте, не допуская образования пузырьков, и инкубируйте обе пробирки в течение 30 минут на льду. После инкубации перенесите трубки в тепловой блок и инкубируйте при температуре 42 градуса Цельсия в течение 45 секунд. Сразу же переложите трубки в лед, и выдерживайте в течение двух минут. Теперь добавьте 950 микролитров среды SOC в каждую пробирку и инкубируйте их в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить бактериям восстановиться и экспрессировать устойчивый к антибиотикам маркер, закодированный в плазмиде.
Чтобы сделать разведение 1 к 100, добавьте в пробирку объемом 1,5 миллилитра 990 микролитров среды SOC и 10 микролитров клеточной суспензии. Затем сделайте разведение 1 к 10, добавив 900 микролитров среды SOC и 100 микролитров клеточной суспензии в 1,5 миллилитровую пробирку. Затем нанесите 100 микролитров разбавленных клеточных суспензий и 100 микролитров отрицательного контроля на отдельные селективные планшеты, содержащие ампициллин, с помощью разбрасывателя и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов. После инкубации подсчитайте колониеобразующие единицы, или КОЕ, на каждой пластине, полученной в результате преобразования, и запишите эти данные. Чтобы убедиться в том, что трансформанты содержат плазмиду pUC19, выберите одну, хорошо изолированную колонию из планшета со стерильной петлей и введите ее в пробирку, содержащую 3 миллилитра бульона LB. Затем инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение ночи. На следующий день используйте мини-набор для подготовки ДНК, чтобы выделить ДНК из 3 миллилитров культуры, согласно инструкциям производителя. После завершения подготовки ДНК расщепите 1 микрограмм очищенного pUC19 с помощью фермента рестрикции при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа. Теперь загрузите 20 микролитров молекулярной лестницы, 1 микрограмм переваренной плазмидной ДНК и 1 микрограмм непереваренной плазмидной ДНК в последовательные лунки 1%-ного агарозного геля, содержащего 1 микрограмм на миллилитр бромида этидия. Затем запустите гель в течение 1 часа при напряжении 95 вольт. Наконец, визуализируйте гель с помощью ультрафиолетового осветителя.
В этом эксперименте химически компетентные клетки E. coli DH5 Alpha были получены с использованием адаптации метода хлорида кальция, а затем трансформированы с помощью плазмиды pUC19 для определения эффективности трансформации. Чтобы рассчитать эффективность преобразования, используйте записанные значения КОЕ для разведений 1 из 100 и 1 из 10, а также любые другие разведения с числом КОЕ от 30 до 300. Во-первых, зарегистрированное количество КОЕ, 246 в этом примере, делится на количество ДНК, 0,0001 микрограмма, которая была нанесена. Затем это число делится на коэффициент разбавления, используемый для получения эффективности преобразования в КОЕ на микрограмм. В данном примере использовали разведение от 1 до 10 и наносили 100 микролитров раствора объемом 1 миллилитр, что давало итоговый коэффициент разбавления 0,01. В непереваренной плазмидной полосе кольцевая ДНК может проявляться в виде двух или трех различных полос различной яркости. Это связано с тем, что круглая, неразрезанная ДНК может существовать в нескольких различных конформационных состояниях, таких как суперспиральная, разомкнутая круга или более линейная, и каждое из них движется через гель с разной скоростью. Анализ расщепления ДНК восстановленной плазмиды показал, что используемая плазмида имеет ожидаемый размер ДНК pUC19, 2686 пар оснований.
Бактерии удивительно легко приспосабливаются, и одним из механизмов, который способствует этой адаптации, является их способность поглощать внешние молекулы ДНК. Один из типов ДНК, который могут поглощать бактерии, называется плазмидой, кольцевым участком ДНК, который часто содержит полезную информацию, такую как гены устойчивости к антибиотикам. Процесс модификации бактерий с помощью новой генетической информации, полученной из внешнего источника, называется трансформацией. Трансформацию можно легко провести в лабораторных условиях с использованием кишечной палочки, или кишечной палочки.
Для того, чтобы трансформироваться, клетки E. coli должны быть сначала сделаны компетентными, то есть способными поглощать молекулы ДНК из окружающей среды. Протокол для этого удивительно прост — короткая инкубация клеток в растворе хлорида кальция. Эта инкубация приводит к тому, что клетки становятся проницаемыми для молекул ДНК. После того, как клетки гранулируются центрифугированием, надосадочная жидкость удаляется. Теперь плазмидная ДНК добавляется к компетентным клеткам. После инкубации клеток с ДНК смесь кратковременно нагревают до 42 градусов Цельсия с последующим быстрым охлаждением на льду. Этот тепловой шок приводит к тому, что ДНК переносится через клеточную стенку и мембраны. Затем клетки инкубируются в свежих средах. Затем бактерии помещают под температурой 37 градусов, чтобы они могли повторно запечатать свои мембраны и экспрессировать устойчивые белки.
Те клетки, которые впитали плазмиды, будут точно копировать ДНК и передавать ее своему потомству, а также экспрессировать любые белки, которые могут быть закодированы ею, включая медиаторы устойчивости к антибиотикам. Эти гены резистентности могут быть использованы в качестве селективных маркеров для идентификации бактерий, которые были успешно преобразованы, потому что клетки, не поглотившие плазмиду, не будут экспрессировать продукт гена резистентности. Это означает, что когда клетки помещаются в твердую среду, содержащую соответствующий антибиотик, будут расти только клетки, которые впитали плазмиду. Трансформация клеток в растущей колонии может быть дополнительно подтверждена путем культивирования этих клеток в жидких средах в течение ночи для увеличения выхода перед извлечением ДНК из образца. После того, как ДНК выделена, можно провести диагностическое расщепление фермента рестрикции. Поскольку ферменты рестрикции разрезают ДНК в предсказуемых местах, запуск этих расщеплений на геле должен показать предсказуемую картину, если желаемая плазмида была успешно преобразована. Например, если pUC19 получают и разрезают с помощью фермента рестрикции HindIII, на геле должна быть видна одна полоса из 2686 нуклеотидов.
В этой лаборатории вы трансформируете штамм E. coli DH-5 Alpha с pUC19, а затем подтвердите успешную трансформацию с помощью гель-электрофореза ДНК.
Перед началом процедуры наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе лабораторный халат и перчатки. Далее простерилизуйте рабочее место с помощью 70% этанола.
Теперь подготовьте химически компетентные клетки, поместив петлю с бактериями на стерильную пластину из агара LB и заполнив бактерии новой петлей. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день снова простерилизуйте столешницу 70% этанолом и достаньте тарелку из инкубатора.
Инокулируйте одну, хорошо изолированную колонию в 3 миллилитра бульона LB в пробирке со стерильной петлей. Затем выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 210 оборотах в минуту. На следующий день измерьте оптическую плотность ночной культуры с помощью спектрофотометра. Затем добавьте 100 миллилитров бульона LB в литровую колбу и заквашите его ночной культурой при оптической плотности 0. 01. Теперь инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием и проверяйте OD600 каждые 15-20 минут, пока культура не достигнет среднеэкспоненциальной фазы роста.
Примерно через три часа перелейте 50 миллилитров культуры в две ледяные полипропиленовые бутылки. Затем поставьте бутылки обратно на лед на 20 минут, чтобы они остыли. Затем восстановите клетки с помощью центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и поставьте флаконы вверх дном на бумажное полотенце. Затем повторно суспендируйте бактериальную гранулу в пяти миллилитрах ледяного раствора хлорида кальция и магния и осторожно взбейте до полного растворения гранулы. Затем добавьте еще 25 миллилитров раствора в растворенную бактериальную гранулу. Повторно суспендируйте другую бактериальную гранулу, как показано ранее. После этого повторите центрифугирование, и удалите надосадочную жидкость.
Если компетентные клетки будут трансформироваться напрямую, ресуспендируйте каждую бактериальную гранулу в двух миллилитрах ледяного 0,1 молярного раствора хлорида кальция, осторожно вращая трубки. Чтобы начать процедуру трансформации, перенесите 50 микролитров компетентных клеток в две меченые полипропиленовые трубки объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте один микролитр плазмидной ДНК pUC19 в одну из пробирок. Аккуратно перемешайте, не допуская образования пузырьков, и инкубируйте обе пробирки в течение 30 минут на льду. После инкубации перенесите трубки в тепловой блок и инкубируйте при температуре 42 градуса Цельсия в течение 45 секунд. Сразу же переложите трубки в лед, и выдерживайте в течение двух минут. Теперь добавьте 950 микролитров среды SOC в каждую пробирку и инкубируйте их в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить бактериям восстановиться и экспрессировать устойчивый к антибиотикам маркер, закодированный в плазмиде.
Чтобы сделать разведение 1 к 100, добавьте в пробирку объемом 1,5 миллилитра 990 микролитров среды SOC и 10 микролитров клеточной суспензии. Затем сделайте разведение 1 к 10, добавив 900 микролитров среды SOC и 100 микролитров клеточной суспензии в 1,5 миллилитровую пробирку. Затем нанесите 100 микролитров разбавленных клеточных суспензий и 100 микролитров отрицательного контроля на отдельные селективные планшеты, содержащие ампициллин, с помощью разбрасывателя и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов. После инкубации подсчитайте колониеобразующие единицы, или КОЕ, на каждой пластине, полученной в результате преобразования, и запишите эти данные. Чтобы убедиться в том, что трансформанты содержат плазмиду pUC19, выберите одну, хорошо изолированную колонию из планшета со стерильной петлей и введите ее в пробирку, содержащую 3 миллилитра бульона LB. Затем инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение ночи. На следующий день используйте мини-набор для подготовки ДНК, чтобы выделить ДНК из 3 миллилитров культуры, согласно инструкциям производителя. После завершения подготовки ДНК расщепите 1 микрограмм очищенного pUC19 с помощью фермента рестрикции при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа. Теперь загрузите 20 микролитров молекулярной лестницы, 1 микрограмм переваренной плазмидной ДНК и 1 микрограмм непереваренной плазмидной ДНК в последовательные лунки 1%-ного агарозного геля, содержащего 1 микрограмм на миллилитр бромида этидия. Затем запустите гель в течение 1 часа при напряжении 95 вольт. Наконец, визуализируйте гель с помощью ультрафиолетового осветителя.
В этом эксперименте химически компетентные клетки E. coli DH5 Alpha были получены с использованием адаптации метода хлорида кальция, а затем трансформированы плазмидой pUC19 для определения эффективности трансформации. Чтобы рассчитать эффективность преобразования, используйте записанные значения КОЕ для разведений 1 из 100 и 1 из 10, а также любые другие разведения с числом КОЕ от 30 до 300. Во-первых, зарегистрированное количество КОЕ, 246 в этом примере, делится на количество ДНК, 0,0001 микрограмма, которая была нанесена. Затем это число делится на коэффициент разбавления, используемый для получения эффективности преобразования в КОЕ на микрограмм. В данном примере использовали разведение от 1 до 10 и наносили 100 микролитров раствора объемом 1 миллилитр, что давало итоговый коэффициент разбавления 0,01. В непереваренной плазмидной полосе кольцевая ДНК может проявляться в виде двух или трех различных полос различной яркости. Это связано с тем, что круглая, неразрезанная ДНК может существовать в нескольких различных конформационных состояниях, таких как суперспиральная, разомкнутая круга или более линейная, и каждое из них движется через гель с разной скоростью. Анализ расщепления ДНК восстановленной плазмиды показал, что используемая плазмида имеет ожидаемый размер ДНК pUC19, 2686 пар оснований.
Microbiology
136.8K Просмотры
Microbiology
335.2K Просмотры
Microbiology
140.3K Просмотры
Microbiology
180.3K Просмотры
Microbiology
205.9K Просмотры
Microbiology
329.1K Просмотры
Microbiology
98.4K Просмотры
Microbiology
385.8K Просмотры
Microbiology
197.1K Просмотры
Microbiology
42.4K Просмотры
Microbiology
32.8K Просмотры
