Конъюгация: метод передачи резистентности к ампициллину от донора к реципиенту E. coli

1. Настройка

1. Автоклав примерно 1 л среды Лурия-Бертани (LB). Этот стерильный LB будет использоваться для производства примерно 5 мл LB, содержащего 0,3 мМ диаминопимеловой кислоты (DAP).
2. Соберите следующие пластины: агаровые пластины LB с 1X Tet и 0,3 мМ DAP, агаровые пластины LB только с 1X Tet и агаровые пластины LB только с 1X Amp/Tet.
3. Убедитесь, что немного глицерина и коробка с предварительно стерилизованными пластиковыми наконечниками для пипеток находятся под рукой.
4. Прежде чем приступать к любым работам, связанным с микробами, простерилизуйте рабочее место с помощью этанола на 70%. Всегда надевайте необходимые средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки.
5. После завершения простерилизуйте все поверхности и перчатки с 70% этанолом и вымойте руки.

2. Подготовка штаммов донора и реципиента

1. Подготовьте 5 мл бактериальных культур донорского и реципиентного штаммов и выращивайте их в течение ночи при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин. Донорский штамм следует выращивать в ЛБ с 0,3 мМ DAP.
2. Уменьшите по 1 мл обеих культур (~3000 об/мин в течение 5 минут) и промойте клетки PBS.
3. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).

3. Спряжение

1. Соедините 50 мкл клеток реципиента с 50 мкл донорских клеток в микроцентрифужной пробирке и перемешайте с помощью пипетирования.
2. Инкубируйте клеточную смесь в течение 1 часа при 37 °C. Это повысит эффективность конъюгации до и во время следующего этапа нанесения покрытия.
3. Нанесите 100 мкл клеточной смеси на агаровый планшет с 1X Tet и 0,3 мМ DAP. Не выкладывайте на тарелку.
4. Пипетируйте 100 мкл клеточной культуры реципиента на агаровый планшет с 1X Tet и 0,3 мМ DAP. Не выкладывайте на тарелку.
5. Инкубируйте обе пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
6. Соскребите смесь конъюгационных клеток и культуру клеток-реципиентов с помощью стерильного скребка для клеток. Перенесите клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку и повторно суспендируйте клетки в 1 мл PBS.
7. Сделайте ячейки вихревыми и аккуратно раскрутите их вниз (~3000 об/мин в течение 5 минут).
8. Ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS.
9. Нанесите смесь ячеек реакции сопряжения на агаровую пластину LB только с 1X Amp/Tet. Ожидается, что на этой пластине будут расти только те бактерии-реципиенты, которые успешно получили ген устойчивости к амфраму путем конъюгации.
10. Поместите клетки-реципиенты на агаровую пластину LB только с помощью 1X Tet. Ожидается, что на этой пластине будут расти только неконъюгированные бактерии-реципиенты, которые не имеют гена резистентности к Amp
.
11. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C.
12. Выберите одиночные колонии с обеих пластин и используйте их для выращивания культур в течение ночи в среде объемом 5 мл (37 °C с аэрацией при 220 об/мин).

4. Выделение ДНК

1. Выделите ДНК из ранее приготовленных культур, используя 4,5 мл от общего объема культуры методом DNA miniprep.
2. Для этого нужно элюировать ДНК, используя 35 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
3. Чистая ДНК будет генерировать коэффициент поглощения (A_260/280) примерно 1,8.
4. Используйте оставшиеся 0,5 мл каждой культуры для приготовления запасов глицерина, сделав смесь бактериальной культуры и 100% глицерина в соотношении 1:1.
5. Храните запасы в морозильной камере при температуре -80 °C.

5. Подтверждение конъюгации переноса плазмид методом ПЦР

1. Приготовьте две мастер-смеси для ПЦР, каждая из которых содержит свой набор прямых и обратных праймеров, одна из которых нацелена на сегмент 500 пар оснований в гене устойчивости к ампициллину, а другая — на сегмент в гене хозяйственного состояния.
   1. Праймеры генов хозяйствования были разработаны для амплификации сегмента ДНК в бактериальном гене, кодирующем ДНК-гиразу B (14).
   2. Для приготовления 90 мкл каждой мастер-смеси использовали следующие объемы реагентов:
      7,5 мкл 10 мкМ прямого праймера<бр /> 7,5 мкл 10 мкМ обратной грунтовки<бр /> 75 мкл 2X PCR Master Mix
2. Приготовьте следующие шесть ПЦР-реакций с использованием 15 мкл мастер-смеси, 10 нг матричной ДНК и безнуклеазной воды до конечного объема 25 мкл<бр/> Реакция конъюгации ДНК и праймеров ампициллина
   Реакция конъюгации ДНК и праймеры по хозяйству
   Отрицательный контроль ДНК и ампициллиновых праймеров
   Отрицательный контроль ДНК и праймеры по хозяйству
   Без праймеров ДНК и ампициллина
   Без ДНК и праймеров для уборки
3. Перенесите эти реакции в ПЦР-аппарат с предварительно нагретым до 98 °C блоком и начните термоциклирование при следующих условиях:
   98 °C в течение 30 секунд
   25-35 циклов при температуре 98 °C в течение 5-10 секунд, при 45-72 °C в течение 10-30 секунд и при 72 °C в течение 15-30 секунд на kb
   72 °C в течение 5-10 минут
   Держать при температуре 4 °C
4. Загрузите все шесть ПЦР-реакций на 1% агарозный гель и работайте при температуре ~150 В в течение примерно 20 минут.
5. Визуализируйте изделие ПК с помощью УФ-осветителя.