Конъюгация: метод передачи резистентности к ампициллину от донора к реципиенту E. coli

Бактериальные клетки, такие как кишечная палочка, способны передавать генетическую информацию от клетки к клетке. Конъюгация отличается от других механизмов переноса ДНК, таких как трансдукция или трансформация, тем, что она требует физического контакта между клетками.

Для проведения конъюгации требуется донорская клетка, которая экспрессирует фертильность, или F-фактор, и клетка-реципиент без него, F-минусовая клетка. Процесс состоит из двух этапов. Первый – это установление прямого контакта между клетками. Для этого донорская клетка генерирует внеклеточную нитевидную структуру, называемую половым пилусом. Она названа так, потому что конъюгация является формой спаривания для бесполых бактерий, но следует отметить, что это не настоящее половое размножение, поскольку не происходит обмена гаметами и не образуется потомство.

Вторым этапом является доставка ДНК в клетку-реципиент. После того, как половой пилус устанавливает контакт между двумя клетками, строится канал, называемый системой секреции типа IV, позволяющий осуществлять перенос ДНК. Затем донорская клетка начинает реплицировать внехромосомную ДНК, которая будет передана на основе наличия генетического элемента, известного как OriT или источник переноса. Один конец вновь реплицированной ДНК вводится в канал через связывание с белками ДНК. По мере того, как ДНК далее реплицируется, она прокачивается по каналу, чему способствует комплекс белков, кодируемых генами, расположенными близко к OriT. Как только ДНК будет полностью перенесена, она либо сформирует дополнительную хромосомную плазмиду, либо может интегрироваться в хромосому клетки-реципиента. Какой бы ни была конечная точка перенесенной ДНК, гены, которые она кодирует, будут затем экспрессироваться. Эта экспрессия гена может быть использована для подтверждения успешной конъюгации.

Например, рассмотрим сценарий, в котором донорский штамм проявляет устойчивость к ампициллину и передает ее в конъюгированной ДНК бактерии-реципиенту, но реципиентный штамм также имеет ген устойчивости к тетрациклину, отсутствующий у донора. В этом случае, когда клетки помещаются на LB-среды, содержащие как тетрациклин, так и ампициллин, колонии должны расти только из успешно конъюгированных бактерий, которые будут экспрессировать оба фенотипа резистентности. Для дальнейшего подтверждения успешной конъюгации может быть собрана плазмидная ДНК из этих колоний, а затем участок ДНК, специфичный для перенесенной плазмиды, может быть амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакции или ПЦР. Когда продукт ПЦР запускают на геле для электрофореза рядом с лестницей стандартных размеров, на геле должен быть виден фрагмент ПЦР известного размера, что еще раз подтверждает успешную конъюгацию. В этом эксперименте плазмида будет использоваться для переноса гена устойчивости к ампициллину путем конъюгации от донорского штамма к тетрациклин-резистентному штамму-реципиенту. После этого, чтобы подтвердить конъюгацию, конъюгационная смесь будет инкубирована на планшете, содержащем оба антибиотика, оставляя только трансформированные бактерии. Наконец, успешная конъюгация будет дополнительно подтверждена с помощью ПЦР.

Перед началом процедуры наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе лабораторный халат и перчатки. Затем простерилизуйте рабочее пространство, протерев поверхность 70% этанолом.

В этой процедуре ген устойчивости к ампициллину будет перенесен от штамма WM3064 E. coli к штамму J53 E. coli путем конъюгации. Донорский штамм WM3064 устойчив к тетрациклину и ампициллину, и для его роста требуется диаминопимеловая кислота, или DAP. Штамм-реципиент J53 устойчив только к тетрациклину и не требует DAP для роста. Это означает, что успешно конъюгированные клетки должны быть устойчивы к тетрациклину и ампициллину и могут расти без DAP.

Приготовьте культуру донорского штамма путем инокуляции пяти миллилитров LB, содержащего 0,3 миллимоль DAP, с обрезком замороженного донорского штамма глицерина. Затем приготовьте штамм-реципиент, введя пять миллилитров бульона LB без DAP в обрезок замороженного глицеринового бульона штамма-реципиента. Выращивайте эти культуры в течение ночи при 37 градусах Цельсия с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин в встряхивающем инкубаторе. Как только культуры вырастут до наружного диаметра 600 из двух, удалите по одному миллилитру культуры из каждой и поместите ее в две новые отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Затем центрифугируйте эти аликвоты при 3000 об/мин в течение пяти минут, чтобы гранулировать бактериальные клетки. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте каждую гранулу 250 микролитрами 1X PBS. Снова центрифугируйте образцы и, отбросив надосадочную жидкость, повторно суспендируйте каждую гранулу в 500 микролитрах PBS.

Чтобы начать процедуру конъюгации, сначала соедините 50 микролитров клеток реципиента с 50 микролитрами донорских клеток в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра и перемешайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Затем пипеткой нанесите 100 микролитров клеточной культуры реципиента на другую 1Х тетрациклиновую пластину, содержащую DAP. Затем подготовьте отрицательный контроль, пипетируя 100 микролитров культуры клеток реципиента на неселективный агаровый планшет, содержащий DAP. Затем инкубируйте конъюгационные и отрицательные контрольные планшеты в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день возьмите стерильный скребок для клеток и соберите клетки из конъюгационной пластины, собирая колонии. Затем переложите колонии в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр 1X PBS. Повторите этот процесс, чтобы собрать клетки-реципиенты с другой пластины.

После этого сделайте образцы вихревыми, чтобы перемешать. После смешивания перенесите пробирки в центрифугу, чтобы аккуратно гранулировать клетки. Выбросьте надосадочную жидкость, затем промойте клеточные гранулы в одном миллилитре PBS и сделайте вихревые трубки для ресуспендирования клеток. Снова гранулируйте ячейки центрифугированием. Снова выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте обе клеточные таблетки в одном миллилитре PBS. Теперь, используя стерильный наконечник для пипетки, поместите 100 микролитров смеси клеток реакции конъюгации на агаровую пластину LB без DAP, содержащую 1X тетрациклин и 1X ампициллин. Повторите метод осаждения с использованием 100 микролитров десятикратного разведения той же клеточной смеси в PBS на другой агаровой пластине LB без DAP, содержащей 1Х тетрациклин и 1Х ампициллин.

Наконец, пипетируйте 100 микролитров отрицательной контрольной клеточной смеси на одну агаровую пластину LB только с 1Х тетрациклином. После ночной инкубации при 37 градусах Цельсия колонии должны быть видны. Используя стерильный наконечник для пипетки, выберите одну колонию из реакционной пластины конъюгации и добавьте ее в пробирку, содержащую пять миллилитров селективной LB-среды, содержащей оба антибиотика. Затем повторите изоляцию колонии, выбрав одну колонию из клеточной пластины-реципиента. Выращивайте эти культуры в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с аэрацией при 220 оборотах в минуту.

На следующий день протрите столешницу 70% этанолом и достаньте пластины из инкубатора. Используйте мини-набор для подготовки ДНК, чтобы выделить ДНК из 4. По 5 миллилитров каждой культуры согласно инструкции производителя. После завершения мини-подготовки ДНК элюируйте ДНК, используя 35 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Наконец, используйте оставшийся 0. По 5 миллилитров каждой культуры приготовить один миллилитр запасов глицерина, добавив 0,5 миллилитра 100% глицерина для разведения один к одному. Поместите эти аликвоты при температуре минус 80 градусов Цельсия для хранения до тех пор, пока они не понадобятся.

Чтобы подтвердить успешную конъюгацию методом ПЦР, сначала приготовьте мастер-смесь для ПЦР, добавив 75 микролитров мастер-смеси 2X PCR в микроцентрифужную пробирку. Затем добавьте по 7,5 микролитров каждого из 10 микромолярного прямого праймера и 10 микромолярного обратного праймера, предназначенного для амплификации гена устойчивости к ампициллину из плазмиды. Затем приготовьте вторую мастер-смесь для ПЦР, добавив 75 микролитров мастер-смеси 2X PCR в микроцентрифужную пробирку, а затем добавив по 7,5 микролитров каждого из 10 микромолярного прямого праймера и 10 микромолярного обратного праймера, предназначенного для амплификации домашнего гена, в данном случае ДНК-гиразы B.

Теперь добавьте 15 микролитров первой мастер-смеси в ПЦР-пробирку, а затем добавьте 10 нанограммов, примерно два микролитра матричной экспериментальной ДНК в ту же пробирку. Доведите реакцию до конечного объема 25 микролитров с помощью воды, не содержащей нуклеаз. Повторите эти шаги, чтобы получить оставшиеся пять реакций, чтобы пробирки содержали компоненты, показанные здесь. Теперь перенесите эти реакции в амплификатор с блоком, предварительно нагретым до 98 градусов Цельсия, а затем запустите программу. После завершения ПЦР извлеките пробирки из аппарата. Затем загрузите по два микролитра каждой реакции, смешанного с двумя микролитрами загружаемого красителя и четырьмя микролитрами маркера молекулярной массы в последовательные лунки 1% агарозного геля. Установите режим работы геля при напряжении 150 вольт в течение 20 минут. Наконец, визуализируйте гель с помощью ультрафиолетового осветителя.

В этом эксперименте успешный перенос гена устойчивости к ампициллину путем конъюгации был подтвержден с помощью ПЦР. В этом случае полоса размером примерно 500 пар оснований должна наблюдаться в лунке, содержащей конъюгированные праймеры ДНК и ампициллина, в данном примере их две. Хозяйственный ген, ДНК-гираза В, был загружен в третью и пятую лунки с конъюгированной ДНК и ДНК клетки-реципиента соответственно. Полосы, наблюдаемые в этих лунках, действуют как положительный контроль, чтобы убедиться в наличии матрицы ДНК и успешности ПЦР. Полосы не следует наблюдать в лунке, содержащей реакцию на ДНК клетки-реципиента и пару ампициллиновых праймеров, в данном примере четыре лунки, поскольку клетки-реципиенты не являются ампициллин-резистентными. Кроме того, не должно наблюдаться никаких полос в реакциях, в которых отсутствует матричная ДНК, здесь 6-я и 7-я лунки. Если эти условия соблюдены, это подтвердит успешный перенос гена устойчивости к ампициллину, придающий устойчивость к ампициллину от штамма WM3064 E. coli к штамму J53 E. coli.