Фаговая трансдукция: метод передачи резистентности к ампициллину от донора к реципиенту E. coli

1. Настройка

1. Прежде чем приступать к любым работам, связанным с микробами, простерилизуйте рабочее место с использованием 70% этанола. Всегда используйте необходимые СИЗ (лабораторный халат и перчатки).
2. Убедитесь, что агаровые планшеты LB с 1x ампициллином, коммерчески доступным раствором лизата фага P1, хлороформом, 1 М цитратом натрия, глицерином, а также коробкой предварительно стерилизованных пластиковых наконечников для пипеток и распространителей клеток находятся под рукой.
3. Приготовьте стерильный LB путем автоклавирования и с его помощью сделайте три аликвоты по 1 мл раствора соли LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μг), 5 мМ CaCl₂ (11,098 мг), 0,1-0,2% глюкозы (100-200 μг)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 мг), 5 мМ CaCl₂ (11,098 мг)
   3. мМ цитрат натрия (25,806 мг)
4. После завершения простерилизуйте все поверхности, а также перчатки с 70% этанолом и вымойте руки.

2. Протокол

1. Донорский препарат лизата фага
   1. Приготовьте 1 мл культуры донорского штамма W3110 E. coli в LB с 1x ампициллином, выращенным в течение ночи при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   2. Разведите эту ночную культуру в соотношении 1:100 в 1 мл свежего LB с добавлением 10-25 мМ MgCl₂, 5 мМ CaCl₂ и 0,1-0,2% глюкозы.
   3. Выращивайте этот бактериальный раствор при 37 °C в течение 2 часов с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   4. Как только эти клетки достигнут ранней логарифмической фазы роста (заметный рост и небольшое помутнение), добавьте 40 мкл коммерчески доступного фага P1 и оставьте при температуре 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
      1. Перед добавлением фагов измеренная оптическая плотность на длине волны 600 нм этих клеток должна составлять примерно 0,4 (6).
   5. Наблюдайте за клетками в течение 1-3 часов, пока культура не лизируется.
      1. Лизис приведет к увеличению клеточного мусора, а также к заметному снижению мутности (т.е. клетки будут считаться лизированными, как только кто-то сможет видеть сквозь культуру).
   6. Добавьте в лизат несколько капель (50-100 мкл) хлороформа и перемешайте вихрем.
      1. Хлороформ стерилизует лизат фага, убивая все оставшиеся донорские клетки, оставляя только фаг и увеличивая титр этого лизата.
   7. Центрифуга лизат при 14 000 об/мин в течение 2 минут, чтобы удалить мусор и перенести надосадочную жидкость в свежую пробирку.
   8. Добавьте несколько капель хлороформа и храните при температуре 4 °C не более суток.
2. Трансдукция
   1. Приготовьте 1 мл культуры реципиента J53 штамма E. coli, выращенной в течение ночи в LB при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   2. Перелейте 100 мкл лизата донорского фага (2,1) в микропробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте при открытой крышке при 37 °C в течение 30 минут.
      1. Такая инкубация позволяет любому оставшемуся хлороформу в растворе лизата P1 испариться перед добавлением в клетки-реципиенты.
   3. Осторожно гранулируйте клетки-реципиенты путем центрифугирования при 6 000 об/мин в течение 5 минут.
   4. Ресуспендируйте эти клетки в 300 мкл свежего LB, содержащего 100 мМ MgSO₄ и 5 мМ CaCl₂. (Фагу P1 требуется кальций, чтобы быть заразным).
   5. Организовать две реакции с использованием клеток бактерий-реципиентов и полученного лизата донорского фага: 1) реакцию трансдукции, объединяющую 100 мкл реципиента J53 штамма E. coli и 100 мкл донорского фагового лизата, и 2) отрицательный контроль, объединяющий 100 мкл реципиента штамма J53 E. coli и 100 мкл LB, содержащего 100 мМ MgSO₄ и 5 мМ CaCl₂.
   6. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут с встряхиванием при 220 об/мин.
   7. Добавьте 1 мл LB и 200 мкл 1М цитрата натрия (pH=5,5) и инкубируйте в течение 1 часа при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин.
      1. Цитрат используется для снижения инфекционности P1 путем хелатирования с кальцием, предотвращая лизис бактерий-реципиентов.
      2. Инкубация этого раствора позволяет получить экспрессию маркера устойчивости к ампициллину.
   8. Пеллетные ячейки методом центрифугирования при 6 000 об/мин в течение 5 минут.
   9. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 100 мкл LB со 100 мМ цитратом натрия (pH 5,5). Вихревой и пластинчатый весь раствор для обеих реакций на двух агаровых пластинах LB.
      1. Пластина LB должна иметь 1x Amp для трансдуцируемого образца и не иметь Amp для отрицательного контроля.
      2. Фаговое загрязнение P1 на этой пластине требует повторной обработки перед приготовлением запасов в морозильной камере.
      3. Если фаг не удалять, культуры, выращенные из этих колоний, не будут расти без присутствия хелатора кальция.
   10. Выберите около 3-4 колоний с обеих пластин и снова нанесите на две агаровые пластины LB, нанесенные 100 мкл 1 М цитрата натрия (pH=5,5).
       1. Пластина LB должна иметь 1x Amp для трансдуцируемого образца и не иметь Amp для отрицательного контроля.
   11. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы дать возможность расти колониям, свободным от фагов.
   12. Соберите колонии с обеих пластин и используйте их для выращивания культур в течение ночи в 5 мл LB при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   13. Выделите ДНК из этих культур с помощью мини-препарата ДНК, используя 4,5 мл от общего объема культуры.
       1. Элюируйте ДНК с помощью 35 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
       2. Измерьте полученную концентрацию с помощью Nanodrop. Чистая ДНК будет генерировать коэффициент поглощения (A_260/280) примерно 1,8.
   14. Используйте оставшиеся 0,5 мл каждой культуры для приготовления 1 мл запасов глицерина, сделав смесь 100% глицерина и бактериальной культуры в соотношении 1:1.
   15. Хранить запасы бактериального глицерина при температуре -80 °C.

3. Анализ данных и результаты

1. Подтверждение трансдукции методом количественной ПЦР
   1. Приготовьте две мастер-смеси для qPCR для шести реакций qPCR, три с использованием праймеров qPCR для гена устойчивости к ампициллину, а остальные три с использованием праймеров qPCR для домашнего гена (14,5 μL на реакцию): 12,5 μL буферной смеси для qPCR + 1 μL прямого праймера + 1 μL обратного праймера.
      1. В этом эксперименте мы использовали мастер-микс SYBR Green.
      2. Праймеры генов Housekeeping были разработаны для амплификации сегмента ДНК в бактериальном гене, кодирующем ДНК-гиразу B (7).
   2. Для каждой реакции количественной ПЦР смешайте 100 г ДНК из каждой реакции (10,5 мкл) с 14,5 мкл мастер-смеси для количественной ПЦР.
   3. С помощью аппарата количественной ПЦР и протокола термоциклирования, приведенного в таблице 1, измеряли амплификацию устойчивости к ампициллину и генов хозяйствования для всех шести реакций.
   4. Значения Cq, полученные с помощью количественной ПЦР, были использованы для расчета нормализованной эффективности трансдукции гена устойчивости к ампициллину (рис. 3), подтвердив успешную трансдукцию гена устойчивости к ампициллину.
      1. Значение Cq, или значение количественной оценки цикла, образца — это самый ранний номер цикла ПЦР, при котором сигнал превысил фоновый порог. Низкие значения Cq соответствуют большему количеству целевой последовательности, и наоборот.
      2. Нормализованная эффективность трансдукции гена в образце может быть рассчитана с использованием этих значений Cq путем вычитания значения гена, отвечающего за ведение хозяйства, из значения целевого гена, что дает значение ΔCq, которое может быть использовано для расчета нормализованной эффективности трансдукции по формуле 2^(-ΔCq).

	Температура	Время
Денатурация	94 °C	2 мин
40 циклов:
Денатурация	94 °C	15 сек
Отжиг, растяжение и флуоресцентное чтение	60 °C или 5 °C ниже самого низкого уровня грунтовки Tm	1 мин

Таблица 1: Протокол термоциклирования количественной ПЦР