6.12: Фаговая трансдукция: метод передачи резистентности к ампициллину от донора к реципиенту E. coli

1. Настройка

1. Прежде чем приступать к любым работам, связанным с микробами, простерилизуйте рабочее место с использованием 70% этанола. Всегда используйте необходимые СИЗ (лабораторный халат и перчатки).
2. Убедитесь, что агаровые планшеты LB с 1x ампициллином, коммерчески доступным раствором лизата фага P1, хлороформом, 1 М цитратом натрия, глицерином, а также коробкой предварительно стерилизованных пластиковых наконечников для пипеток и распространителей клеток находятся под рукой.
3. Приготовьте стерильный LB путем автоклавирования и с его помощью сделайте три аликвоты по 1 мл раствора соли LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μг), 5 мМ CaCl₂ (11,098 мг), 0,1-0,2% глюкозы (100-200 μг)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 мг), 5 мМ CaCl₂ (11,098 мг)
   3. мМ цитрат натрия (25,806 мг)
4. После завершения простерилизуйте все поверхности, а также перчатки с 70% этанолом и вымойте руки.

2. Протокол

1. Донорский препарат лизата фага
   1. Приготовьте 1 мл культуры донорского штамма W3110 E. coli в LB с 1x ампициллином, выращенным в течение ночи при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   2. Разведите эту ночную культуру в соотношении 1:100 в 1 мл свежего LB с добавлением 10-25 мМ MgCl₂, 5 мМ CaCl₂ и 0,1-0,2% глюкозы.
   3. Выращивайте этот бактериальный раствор при 37 °C в течение 2 часов с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   4. Как только эти клетки достигнут ранней логарифмической фазы роста (заметный рост и небольшое помутнение), добавьте 40 мкл коммерчески доступного фага P1 и оставьте при температуре 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
      1. Перед добавлением фагов измеренная оптическая плотность на длине волны 600 нм этих клеток должна составлять примерно 0,4 (6).
   5. Наблюдайте за клетками в течение 1-3 часов, пока культура не лизируется.
      1. Лизис приведет к увеличению клеточного мусора, а также к заметному снижению мутности (т.е. клетки будут считаться лизированными, как только кто-то сможет видеть сквозь культуру).
   6. Добавьте в лизат несколько капель (50-100 мкл) хлороформа и перемешайте вихрем.
      1. Хлороформ стерилизует лизат фага, убивая все оставшиеся донорские клетки, оставляя только фаг и увеличивая титр этого лизата.
   7. Центрифуга лизат при 14 000 об/мин в течение 2 минут, чтобы удалить мусор и перенести надосадочную жидкость в свежую пробирку.
   8. Добавьте несколько капель хлороформа и храните при температуре 4 °C не более суток.
2. Трансдукция
   1. Приготовьте 1 мл культуры реципиента J53 штамма E. coli, выращенной в течение ночи в LB при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   2. Перелейте 100 мкл лизата донорского фага (2,1) в микропробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте при открытой крышке при 37 °C в течение 30 минут.
      1. Такая инкубация позволяет любому оставшемуся хлороформу в растворе лизата P1 испариться перед добавлением в клетки-реципиенты.
   3. Осторожно гранулируйте клетки-реципиенты путем центрифугирования при 6 000 об/мин в течение 5 минут.
   4. Ресуспендируйте эти клетки в 300 мкл свежего LB, содержащего 100 мМ MgSO₄ и 5 мМ CaCl₂. (Фагу P1 требуется кальций, чтобы быть заразным).
   5. Организовать две реакции с использованием клеток бактерий-реципиентов и полученного лизата донорского фага: 1) реакцию трансдукции, объединяющую 100 мкл реципиента J53 штамма E. coli и 100 мкл донорского фагового лизата, и 2) отрицательный контроль, объединяющий 100 мкл реципиента штамма J53 E. coli и 100 мкл LB, содержащего 100 мМ MgSO₄ и 5 мМ CaCl₂.
   6. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут с встряхиванием при 220 об/мин.
   7. Добавьте 1 мл LB и 200 мкл 1М цитрата натрия (pH=5,5) и инкубируйте в течение 1 часа при 37 °C с встряхиванием при 220 об/мин.
      1. Цитрат используется для снижения инфекционности P1 путем хелатирования с кальцием, предотвращая лизис бактерий-реципиентов.
      2. Инкубация этого раствора позволяет получить экспрессию маркера устойчивости к ампициллину.
   8. Пеллетные ячейки методом центрифугирования при 6 000 об/мин в течение 5 минут.
   9. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 100 мкл LB со 100 мМ цитратом натрия (pH 5,5). Вихревой и пластинчатый весь раствор для обеих реакций на двух агаровых пластинах LB.
      1. Пластина LB должна иметь 1x Amp для трансдуцируемого образца и не иметь Amp для отрицательного контроля.
      2. Фаговое загрязнение P1 на этой пластине требует повторной обработки перед приготовлением запасов в морозильной камере.
      3. Если фаг не удалять, культуры, выращенные из этих колоний, не будут расти без присутствия хелатора кальция.
   10. Выберите около 3-4 колоний с обеих пластин и снова нанесите на две агаровые пластины LB, нанесенные 100 мкл 1 М цитрата натрия (pH=5,5).
       1. Пластина LB должна иметь 1x Amp для трансдуцируемого образца и не иметь Amp для отрицательного контроля.
   11. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы дать возможность расти колониям, свободным от фагов.
   12. Соберите колонии с обеих пластин и используйте их для выращивания культур в течение ночи в 5 мл LB при 37 °C с аэрацией и встряхиванием при 220 об/мин.
   13. Выделите ДНК из этих культур с помощью мини-препарата ДНК, используя 4,5 мл от общего объема культуры.
       1. Элюируйте ДНК с помощью 35 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
       2. Измерьте полученную концентрацию с помощью Nanodrop. Чистая ДНК будет генерировать коэффициент поглощения (A_260/280) примерно 1,8.
   14. Используйте оставшиеся 0,5 мл каждой культуры для приготовления 1 мл запасов глицерина, сделав смесь 100% глицерина и бактериальной культуры в соотношении 1:1.
   15. Хранить запасы бактериального глицерина при температуре -80 °C.

3. Анализ данных и результаты

1. Подтверждение трансдукции методом количественной ПЦР
   1. Приготовьте две мастер-смеси для qPCR для шести реакций qPCR, три с использованием праймеров qPCR для гена устойчивости к ампициллину, а остальные три с использованием праймеров qPCR для домашнего гена (14,5 μL на реакцию): 12,5 μL буферной смеси для qPCR + 1 μL прямого праймера + 1 μL обратного праймера.
      1. В этом эксперименте мы использовали мастер-микс SYBR Green.
      2. Праймеры генов Housekeeping были разработаны для амплификации сегмента ДНК в бактериальном гене, кодирующем ДНК-гиразу B (7).
   2. Для каждой реакции количественной ПЦР смешайте 100 г ДНК из каждой реакции (10,5 мкл) с 14,5 мкл мастер-смеси для количественной ПЦР.
   3. С помощью аппарата количественной ПЦР и протокола термоциклирования, приведенного в таблице 1, измеряли амплификацию устойчивости к ампициллину и генов хозяйствования для всех шести реакций.
   4. Значения Cq, полученные с помощью количественной ПЦР, были использованы для расчета нормализованной эффективности трансдукции гена устойчивости к ампициллину (рис. 3), подтвердив успешную трансдукцию гена устойчивости к ампициллину.
      1. Значение Cq, или значение количественной оценки цикла, образца — это самый ранний номер цикла ПЦР, при котором сигнал превысил фоновый порог. Низкие значения Cq соответствуют большему количеству целевой последовательности, и наоборот.
      2. Нормализованная эффективность трансдукции гена в образце может быть рассчитана с использованием этих значений Cq путем вычитания значения гена, отвечающего за ведение хозяйства, из значения целевого гена, что дает значение ΔCq, которое может быть использовано для расчета нормализованной эффективности трансдукции по формуле 2^(-ΔCq).

Таблица 1: Протокол термоциклирования количественной ПЦР

Бактерии могут быстро адаптироваться к быстро меняющейся окружающей среде, обмениваясь генетическим материалом, и одним из способов, которым они могут это сделать, является трансдукция, обмен генетическим материалом, опосредованный бактериальными вирусами. Бактериофаг, часто сокращенно фаг, представляет собой тип вируса, который заражает бактерии, сначала прикрепляясь к поверхности хозяина, а затем вводя свою ДНК в бактериальную клетку. Затем он разрушает собственную ДНК клетки-хозяина и реплицирует ее вирусный геном, захватывая при этом механизм клетки для синтеза множества копий ее белков. Эти фаговые белки затем самоорганизуются и упаковывают фаговые геномы, образуя множественное потомство. Однако из-за низкой точности механизма упаковки ДНК иногда фаг упаковывает фрагменты бактериальной ДНК в фаговый капсид. После индуцирования лизиса хозяина фаговое потомство высвобождается, и, как только такой фаг заражает другую клетку-хозяина, он переносит фрагмент ДНК своего предыдущего хозяина. Затем он может рекомбинироваться и навсегда встраиваться в хромосому нового хозяина, тем самым опосредуя перенос генов между двумя бактериями.

Для проведения фаговой трансдукции в лабораторных условиях требуется донорский штамм, содержащий интересующий ген, штамм-реципиент, у которого его нет, фаг, способный инфицировать оба штамма, и метод отбора трансдуцированных бактерий. В большинстве случаев это будет селективная твердая питательная среда, которая поддерживает рост трансдуцированных бактерий, но подавляет рост нетрансдуцированных бактерий. Для начала донорский штамм, содержащий интересующий ген, культивируется в жидкой питательной среде. Когда все бактерии активно делятся в логарифмической фазе своего роста, культуру инокулируют целевым фагом. После трех-четырех часов инкубации, когда почти все бактерии лизируются и высвобождают фаговые частицы, донорский лизат фага инокулируется в свежевыращенную культуру штамма бактерий-реципиентов. После короткой инкубации продолжительностью в один час культура должна содержать смесь трансдуцированных и нетрансдуцированных бактериальных клеток, и ее проверяют на наличие трансдуцированных клеток путем нанесения фракции суспензии на соответствующую селективную твердую питательную среду. После дальнейшей инкубации трансдуцированные клетки должны расти и размножаться, образуя видимые колонии. Затем эти колонии могут быть отобраны для дальнейшего анализа с использованием различных методов для дальнейшего подтверждения успешной трансдукции, таких как ПЦР колоний, секвенирование ДНК или количественная ПЦР.

Перед началом процедуры наденьте любые соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки. Затем простерилизуйте рабочее место 70% этанолом и протрите поверхность.

После этого приготовьте три одномиллилитровые аликвоты раствора соли LB. Теперь приготовьте культуру донорского штамма, добавив 100 микролитров кишечной палочки в конический флакон объемом 15 миллилитров, содержащий пять миллилитров питательной среды LB с 500 микрограммами ампициллина. Затем выращивайте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с аэрацией и встряхиванием при 220 оборотах в минуту. На следующий день протрите столешницу 70% этанолом, прежде чем извлечь культуру из встряхивающего инкубатора. Далее разведите ночную культуру один к 100, добавив 10 микролитров донорского штамма к 990 микролитрам свежего ЛБ, дополненного солевым раствором.

Дайте бактериальному разведению расти при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов с аэрацией и встряхиванием при 220 оборотах в минуту. Как только клетки достигнут ранней фазы логарифма, извлеките культуру из инкубатора, добавьте в культуру 40 микролитров фага P1 и снова инкубируйте. Продолжайте наблюдение за клетками в течение одного-трех часов, пока бактериологическое исследование не станет лизисом. Далее добавьте в лизат от 50 до 100 микролитров хлороформа и перемешайте путем вортексирования. Затем центрифугируйте лизат, чтобы удалить мусор, и перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку. Добавьте в надосадочную жидкость несколько капель хлороформа и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия не более суток.

Чтобы начать процедуру трансдукции, необходимо получить одномиллилитровую культуру реципиентного штамма. Затем перелейте 100 микролитров лизата донорского фага в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия с открытой крышкой в течение 30 минут, чтобы оставшийся хлороформ испарился. Пока лизат донорского фага инкубируется, гранулируйте клетки штамма-реципиента с помощью щадящего центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 300 микролитрах свежего LB, содержащем 100 миллимоляр сульфата магния и пять миллимолярных хлоридов кальция.

Далее настройте реакцию трансдукции, соединив в микроцентрифужной пробирке 100 микролитров штамма-реципиента и 100 микролитров лизата донорского фага. Затем установите отрицательный контроль, соединив 100 микролитров штамма-реципиента и 100 микролитров LB с сульфатом магния и хлоридом кальция. После инкубации добавьте 200 микролитров одного молярного цитрата натрия и одного миллилитра LB в обе пробирки и перемешайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Затем, после того как пробирки будут инкубированы в течение часа, аккуратно гранулируйте клетки с помощью центрифугирования.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в 100 микролитрах LB со 100 миллимолярным цитратом натрия. Нанесите растворы вихрем и нанесите весь трансдуцированный образец на агаровую пластину LB с 1X ампициллином. Наконец, пипетируйте весь объем отрицательной контрольной клеточной смеси на агаровую пластину LB без ампициллина. После инкубации планшетов в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия используйте стерильный наконечник для пипетки, чтобы выбрать три-четыре колонии из трансдукционной пластины и насадить их на новую агаровую пластину LB, содержащую 1X ампициллин и 100 микролитров одного моляра цитрата натрия. Повторите этот метод нанесения покрытия для отрицательного контроля на другой агаровой пластине LB, содержащей всего 100 микролитров одного молярного цитрата натрия. Затем инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы дать возможность расти колониям, свободным от фагов.

На следующий день протрите столешницу 70% этанолом, прежде чем вынимать тарелки из инкубатора. С помощью стерильного наконечника для пипетки выберите три колонии из трансдукционной пластины и добавьте каждую из них в отдельную пробирку, содержащую пять миллилитров LB-среды. Затем выберите три колонии с отрицательной контрольной пластины и добавьте их в другую пробирку, содержащую пять миллилитров LB-среды. Выращивайте культуры в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с аэрацией и встряхиванием при 220 оборотах в минуту. После стерилизации столешницы, как было продемонстрировано ранее, используйте набор для мини-подготовки ДНК, чтобы выделить ДНК из 4,5 миллилитров каждой культуры в соответствии с инструкциями производителя. Затем элюируйте ДНК 35 микролитрами воды, не содержащей нуклеаз, и измерьте полученную концентрацию с помощью лабораторного спектрофотометра. Наконец, приготовьте запасы глицерина, добавив оставшиеся 0,5 миллилитра обоих бактериальных растворов к 0,5 миллилитрам 100% глицерина.

Чтобы подтвердить трансдукцию, сначала приготовьте две мастер-смеси для количественной ПЦР для реакций 24 количественной ПЦР. Для первой мастер-смеси добавьте 150 микролитров буферной смеси для количественной ПЦР в микроцентрифужную пробирку и по 12 микролитров прямого и обратного праймера, предназначенного для амплификации гена устойчивости к ампициллину. Затем приготовьте вторую мастер-смесь для количественной ПЦР, добавив 150 микролитров мастер-смеси для количественной ПЦР в микроцентрифужную пробирку, а затем добавив по 12 микролитров прямого и обратного праймера, предназначенного для амплификации гена.

Для каждой реакции количественной ПЦР смешайте 100 микрограммов экспериментальной ДНК из каждой реакции с 14,5 микролитрами мастер-смеси для количественной ПЦР. Теперь подготовьте оставшиеся реакции, как показано ранее. Перенесите реакции в термоамплификатор, нагретый до 94 градусов Цельсия, а затем запустите программу. Наконец, используйте значения количественного определения цикла, или Cq, полученные с помощью количественной ПЦР, для расчета нормализованной эффективности трансдукции гена устойчивости к ампициллину.

Значения количественного определения цикла, или Cq, для интересующих генов были сведены в таблицу для каждого из негативных контрольных и трансдуцированных образцов. Низкие значения Cq, обычно ниже 29 циклов, как у трансдуцированных образцов в этом примере, указывают на большое количество последовательности-мишени.

Ген хозяйственного состояния, также приведенный в таблице, используется в качестве контроля нагрузки для нормализации количества ДНК в каждой реакции и в качестве положительного контроля для обеспечения работы количественной ПЦР. При условии загрузки одинакового количества гена домашнего хозяйства, он обнаруживается с относительно одинаковой скоростью в каждом образце.

Затем, чтобы вычислить значение дельты Cq для каждого образца, вычтите значение Cq гена, отвечающего за ведение хозяйства, для каждого образца, из значения Cq соответствующего целевого гена. Например, дельта Cq первого отрицательного контроля равна 13,54. Затем используйте это значение для расчета нормализованной эффективности трансдукции каждого образца по приведенной здесь формуле. Наконец, можно рассчитать среднюю нормированную эффективность трансдукции для каждой группы образцов.