Name: Дрозофилы личинок NMJ Dissection (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Узнайте метод диссекции личинок Drosophila для исследования нейромышечных синапсов. Этот протокол позволяет визуализировать NMJ с помощью иммуногистохимии и микроскопии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Перед тем как начать <ol><li> Все культуры следует выращивать при температуре 25 ° C. </li><li> HL3.1 рассечение буфер может быть подготовлен заранее. Возьмите 50 мл аликвоту HL3.1 и держать его на льду. </li><li> Подготовка 15 мл свежего 3,5% формальдегида в HL3.1. Держите его на лед. </li></ol> Личинки Dissection <ol><li> Поместите каплю холодной HL3.1 на вскрытии пластины. Это будет держать животных от высыхания и оглушить животное делает его легче работать. </li><li> Использование длинный пинцет, выберите блуждающих третьей взрослой личинки и поместить его в каплю HL3.1. </li><li> Во-первых, использовать короткие щипцы понять контактный minutien. Место контактный между задних дыхальца. Животных, как правило, пытается отползти от контактный растяжения себя, и делает его более легким для вас место контактный прямо в голову личинки в районе устья крючков. Стретч животное из продольно. Это поможет вам максимизировать количество выставленных стенки тела можно достичь в процессе резки. Примечание: Если вы решили контактный головой вперед, животное может обернуть его вокруг тела булавкой или кнут своего тела вперед и назад, что делает его трудно точно определить. Обычно вы можете противостоять этому, удалив HL3.1 и положить свежие холодная капля потрясающих животных снова. Симметричная ученый также можете просто схватить животное и удерживать его на месте. </li><li> Использование ножниц весной сделать горизонтальный надрез только впереди задний штифт на спинной стороне личинки. Разместите один лезвие ножниц в разрез и сделать вертикальный разрез по средней линии спины к ростральной конце личинки. На трибуну животных делают горизонтальные разрезы, чтобы слева и справа от булавки. Примечание: конечный результат должен выглядеть так я на спинной стороне личинки вместе rostrocaudal оси. </li><li> Удалить органов. Начните, положив несколько дополнительных капель HL3.1 на личинку. Это позволит органам всплывают из организма позволяет удалить их гораздо легче. Во-первых, удалите трахеи системы. Во-вторых, использование щипцов, чтобы захватить остальные органы и удалить их. </li><li> В шаге 3 вы сделали левый и правый клапан клапан в стенке тела. Pin закрылки по часовой стрелке и обязательно растягивать стенки тела по горизонтали и по вертикали. </li></ol> Фиксация Fix каждого животного в 3,5% формальдегида в HL3.1 течение 25 минут. Мыть животное дважды в HL3.1 течение 5 минут. Хранение Удалите булавки и передачи личинок 1,5 мл пробирку 1X PBS. Если вы планируете изображение NMJ использовании плавленого флуоресцентные метки, Вы должны изображение животных в течение двух дней. Вы можете хранить расчлененный личинок на срок до одной недели при температуре 4 ° C. Представитель результаты Есть несколько ключевых компонентов правильно расчлененные личинки дрозофилы. Во-первых, нужно проявлять особую осторожность, чтобы не повредить мышцы, особенно мышцы 4, 6 и 7. Это самый популярный мышцы учиться и, если они повреждены отказаться филе приготовительные и анализировать другим животным. Во-вторых, надо убедиться, что животное максимально растягивается так, что каждая мышца и NMJ можно выделить.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Рассечение технику продемонстрировал в этом видео можно использовать для подготовки дрозофилы личинок для различных экспериментальных методик. Если флуоресцентные метки белка присутствуют, личинки могут быть смонтированы и отображаемого сразу. В противном случае, иммунной могут быть выполнены для того, чтобы помечать определенные синаптические отсеков. Кроме того, электрофизиологии могут быть легко выполнены на расчлененный личинки оценить функционирование нервных импульсов. NMJ <em...

HL3 Dissection буфера: (в мм) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 трегалозу, 115 сахарозы и 5 HEPES, рН 7,3.<br /<br /&gt; Sylgard Пройдя плиты: Тщательно перемешать (чтобы избежать пузырей) 10:1 в стакан. Вылейте смесь в чашку Петри (любого размера). Разрешить SylGard вылечить ночь в 37C инкубатора.

Дрозофилы личинок nmj dissection

Drosophila Larval NMJ Dissection

<em&gt; Drosophila</em&gt; Нервно-мышечном соединении (NMJ) является создана модель системы, используемой для исследования синаптических развития и пластичности. Широкое использование<em&gt; Drosophila</em&gt; Двигательного аппарата связано с его высокой доступности. Это могут быть проанализированы с одноклеточных разрешения. Есть 30 мышцы в hemisegment которого механизмом в рамках периферийной стенке тела известны. В общей сложности 35 моторных нейронов придают эти мышцы в шаблон, который имеет высокую точность. Использование молекулярной биологии и генетики, можно создать трансгенных животных или мутанты. Затем, можно изучать последствия развития на морфологию и функцию NMJ. Чтобы получить доступ к NMJ для изучения, необходимо тщательно анализировать каждую личинку. В этой статье мы покажем, как правильно препарировать<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок для изучения NMJ, удалив все внутренние органы, оставляя стенки тела нетронутой. Этот метод подходит для подготовки личинок для работы с изображениями, иммуногистохимии, или электрофизиологии.

Этот протокол свидетельствует о том, как рассекают<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок в подготовке к иммуногистохимии и / или изображений нервно-мышечном соединении.

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

Нервно-мышечное соединение (НМС) *Drosophila* является общепризнанной модельной системой, используемой для изучения развития и пластичности синапсов. Широкое применение...

Данная процедура начинается с размещения личинки третьей стадии на секционном планшете. В задний и передний концы личинки устанавливают булавки. С помощью ножниц личинку вскрывают, после чего пинцетом извлекают внутренние органы.Наконец, в каждом углу стенки тела личинки устанавливают еще четыре булавки, чтобы зафиксировать ее в натянутом состоянии во время фиксации. Здравствуйте, я Джонатан Брент из лаборатории Брайана МакКейба с кафедры физиологии и соло-биофизики Колледжа врачей и хирургов Колумбийского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру диссекции личинки drosophila и MJ.В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения синаптического развития нервно-мышечных соединений. Итак, приступим. У личинок drosophila в каждом полусегменте имеется 30 мышц, расположение которых в периферической стенке тела известно.Всего 35 мотонейронов иннервируют эти мышцы по строго стереотипному паттерну. Чтобы получить доступ к нервно-мышечному соединению (НМС), необходимо осторожно препарировать каждую личинку с помощью надлежащей техники диссекции. НМС может быть использовано для визуализации, иммуногистохимического анализа или электрофизиологии.Начните процедуру, поместив каплю буфера HL 3.1 на диссекционную пластину. Буфер должен быть приготовлен заранее и охлажден на льду. Осторожно захватите перемещающуюся личинку на третьей стадии развития (star larvae) с края флакона, используя большие стальные (SS) пинцеты.Это движение указывает на то, что личинка еще не вступила в стадию окукливания. Поместите личинку дорсальной стороной вверх в каплю буфера на препаратной пластине. Холодный буфер анестезирует личинку и обездвижит её. С помощью пинцета установите одну булавку между задними сферитами, затем установите вторую булавку рядом с темными ротовыми крючками так, чтобы личинка была вытянута и готова к рассечению.С помощью пружинных ножниц сделайте небольшой горизонтальный разрез в сторону заднего конца личинки. Введите одно лезвие ножниц в разрез и сделайте продольный разрез в направлении переднего конца личинки. Затем сделайте горизонтальные разрезы у переднего конца личинки слева и справа от булавки.Для удаления таких органов, как кишечник, добавьте несколько капель буфера HL 3.1 к животному; кишечник и другие органы всплывут в растворе, после чего их можно будет извлечь из тела с помощью пинцета. Также вместе с остальными органами удалите трахеальную систему. Теперь обнажите внутренние мышцы тела, отогнув и закрепив булавками лоскуты, образовавшиеся в результате разрезов.Обязательно растяните стенки тела в горизонтальном и вертикальном направлениях. При закреплении лоскутов булавками удалите все оставшиеся фрагменты органов и промойте один раз.После добавления свежего буфера HL 3.1 личинка готова к фиксации свежеприготовленным 3,5% раствором формальдегида в 1x PBS. Полностью погрузите личинок в фиксатор и выдержите 25 минут. По истечении времени фиксации дважды промойте личинок буфером HL 3.1 по три минуты. Осторожно удалите булавки и, при необходимости, перенесите личинок в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с 1x PBS.Личинок можно хранить до двух дней при температуре 4 °C. Для получения оптимальных результатов используйте препарированные личинки немедленно. При правильном препарировании личинки drosophila выделяют несколько ключевых компонентов.Во-первых, будьте осторожны, чтобы не повредить мышцы, особенно шестую, седьмую и четвертую. Во-вторых, животное должно быть правильно растянуто. В противном случае нервно-мышечное соединение может быть недоступно или неразличимо.Здесь представлена правильно препарированная личинка. НМС отчетливо видна, и система готова к проведению экспериментов. Мы продемонстрировали способ препарирования личинки в области пищевода для изучения нервно-мышечного соединения.При выполнении этой процедуры важно сохранить мышцы в целостности. Если мышцы будут повреждены, изучать станет нечего, так как нервно-мышечные соединения будут разрушены. На этом всё.Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этой статье мы показали, как рассекают центральной нервной системы с третьего возраста личинок дрозофилы.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

Этот протокол свидетельствует о том, как выполнить иммуногистохимии на расчлененный личинки дрозофилы.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Личинки дрозофилы обеспечивают идеальную модель системы для исследования механизмов аксонального транспорта в личиночной сегментарных нервов. Используя эту процедуру, 3-й возраста личинок проведения различных мутаций можно сравнить с диким личинки типа.

Визуализация личинок Сегментные Нервы у 3 Й Инстар Drosophila Подготовка личинок

Этот протокол описывает надежный метод обезболивания и обработки изображений...

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Нервно-мышечном соединении (NMJ)...

Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

На месте патч зажим записи используются для электрофизиологических характеристик нейронов у интактных схемы. В Drosophila генетической модели патч зажимной трудно, потому что ЦНС является небольшой и окружен надежными оболочки. В данной статье описывается процедура удаления оболочки и чистой нейронов для последующей записи зажим патч.

Подготовка<em&gt; Drosophila</em&gt; Центральный нейронов<em&gt; На месте</em&gt; Patch Зажимная

В этом видео нервные волокна личинок дрозофилы погружены в FM-краситель, который связывается с липидами клеточной мембраны. Всасывающий микроэлектрод и электрические импульсы стимулируют процесс эндоцитоза, встраивая краситель FM во вновь образованные эндоцитарные везикулы. Этот метод, который визуализирует пресинаптические стадии нейротрансмиссии, полезен для изучения синаптической функции и высвобождения нейротрансмиттеров.

Загрузка и разгрузка микроэлектродного FM-красителя в нервных клетках личинок дрозофилы

Морфология, размер и расположение внутриклеточных органелл эволюционно консервативны и, по-видимому, напрямую влияют на их функцию. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, стало важной целью современной биологии. Здесь мы показываем, как эти исследования могут быть облегчены применением количественных методов.

Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная нейромышечных синапсах

Здесь мы описываем простой и широко доступный метод травмирования сегментных нервов у личинок дрозофилы для визуализации и количественной оценки нейродегенерации моторных нейронов в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинок третьего возраста.

Методология простой нейронной механической травмы для изучения<em&gt; Drosophila</em&gt; Дегенерация моторных нейронов

Описана методика рассечения, которая сохраняет архитектуру нервно-мышечного соединения и позволяет детально провести иммуноцитохимическое исследование двигательных нейронов у взрослой ноги дрозофилы .

Рассечение и иммуногистохимия ноги дрозофилы для обнаружения изменений в нервно-мышечном соединении для идентифицированного двигательного нейрона

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Использование нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек

Узнайте метод диссекции личинок Drosophila для исследования нейромышечных синапсов. Этот протокол позволяет визуализировать NMJ с помощью иммуногистохимии и микроскопии.

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

Больше видео