Дрозофилы личинок NMJ Dissection
4 февраля 2009 г.
Этот протокол свидетельствует о том, как рассекают Drosophila Личинок в подготовке к иммуногистохимии и / или изображений нервно-мышечном соединении.
Данная процедура начинается с размещения личинки третьей стадии на препаровальной пластине. В задний и передний концы личинки устанавливают булавки. С помощью ножниц личинку вскрывают, а затем с помощью пинцета извлекают внутренние органы.
Наконец, в каждый угол стенки тела личинки втыкают еще четыре булавки, чтобы зафиксировать её в натянутом состоянии во время фиксации. Здравствуйте, я Джонатан Брент из лаборатории Брайана МакКейба с кафедры физиологии и соло-биофизики Колледжа врачей и хирургов Колумбийского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру диссекции личинки Drosophila и MJ.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения развития синапсов нервно-мышечных соединений. Итак, приступим. У личинок drosophila в каждом полусегменте имеется 30 мышц, расположение которых в периферической стенке тела известно.
Всего 35 мотонейронов иннервируют эти мышцы по строго стереотипному паттерну. Для получения доступа к нервно-мышечному соединению (НМС) необходимо осторожно препарировать каждую личинку с использованием надлежащей техники диссекции. НМС может быть использовано для имиджинга, иммуногистохимического анализа или электрофизиологических исследований.
Начните процедуру, поместив каплю буфера HL 3.1 на препарировочную пластину. Буфер готовится заранее и охлаждается на льду. Осторожно перенесите одну из перемещающихся личинок на третьей стадии развития (star larvae) с края флакона, используя крупные стальные пинцеты.
Такое движение указывает на то, что личинка еще не вступила в стадию окукливания. Поместите личинку спинной стороной вверх в каплю буфера на препарировальной пластинке. Холодный буфер подействует на личинку как анестетик и обездвижит ее. С помощью пинцета установите одну энтомологическую булавку между задними сферитами, затем установите вторую булавку рядом с темными ротовыми крючьями так, чтобы личинка была вытянута и готова к распластыванию.
С помощью пружинных ножниц сделайте небольшой горизонтальный надрез в направлении заднего конца личинки. Введите одно лезвие ножниц в надрез и сделайте продольный разрез в направлении переднего конца личинки. Затем сделайте горизонтальные надрезы на переднем конце личинки слева и справа от булавки.
Чтобы удалить такие органы, как кишечник, добавьте несколько капель буфера HL 3.1 к животному; кишечник и другие органы всплывут в растворе, после чего их можно будет извлечь из тела с помощью пинцета. Также вместе с остальными органами удалите трахеальную систему. Теперь обнажите внутренние мышцы тела, закрепив булавками лоскуты, образовавшиеся в результате разрезов.
Обязательно растяните стенки тела по горизонтали и вертикали при закреплении лоскутов булавками. Удалите все оставшиеся фрагменты органов и промойте один раз.
После добавления свежего буфера HL 3.1 личинка готова к фиксации свежеприготовленным формальдегидом, разведенным до 3.5% в XPBS; полностью погрузите личинки в фиксатор и выждите 25 минут. По истечении периода фиксации дважды промойте личинки буфером HL 3.1 в течение трех минут. Осторожно удалите булавки и, при необходимости, перенесите личинки в пробирки объемом 1.5 мл, содержащие XPBS.
Личинок можно хранить до двух суток при температуре 4 °C. Для достижения оптимальных результатов используйте препарированных личинок сразу. Правильно препарированная личинка дрозофилы должна иметь несколько основных компонентов.
Во-первых, будьте осторожны, чтобы не повредить мышцы, особенно шестую, седьмую и четвертую. Во-вторых, животное должно быть правильно растянуто. В противном случае нервно-мышечное соединение может оказаться недоступным или трудноразличимым.
Здесь представлена правильно препарированная личинка. НМС четко виден, и система готова к проведению экспериментов. Мы только что продемонстрировали вам способ препарирования личинки в области пищевода для изучения нервно-мышечного соединения.
При выполнении данной процедуры важно оставить мышцы неповрежденными. Если мышцы будут повреждены, изучать нервно-мышечные синапсы будет невозможно. На этом всё.
Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе демонстрируется способ препарирования личинок Drosophila для последующего проведения иммуногистохимического анализа и/или визуализации нервно-мышечных соединений. Процедура включает аккуратное закрепление личинок булавками, а также использование ножниц и пинцета для подготовки образцов к дальнейшему анализу.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология развития
- Иммуногистохимия
Теоретические основы
- Личинки Drosophila широко используются в нейробиологических исследованиях.
- Нервно-мышечный синапс является критически важной областью для изучения синаптической передачи.
- Правильные методы диссекции необходимы для успешной визуализации и анализа.
- Данный протокол представляет собой стандартизированный метод диссекции личинок.
Цель исследования
- Подготовить личинок Drosophila для иммуногистохимического анализа.
- Обеспечить возможность визуализации нервно-мышечного соедини {ния}.
- Стандартизировать методы диссекции для обеспечения воспроизводимости результатов исследований.
Используемые методы
- Размещение булавок для стабилизации личинок во время диссекции.
- Использование ножниц для вскрытия личинок.
- Удаление внутренних органов с помощью пинцета.
- Фиксация стенки тела для целей визуализации.
Основные результаты
- Успешное препарирование позволяет четко визуализировать нервно-мышечный синапс.
- Стандартизированные методы повышают воспроизводимость результатов в различных экспериментах.
- Облегчает дальнейшие исследования синаптической функции и развития.
- Создает основу для будущих исследований в области нейробиологии Drosophila.
Выводы
- Диссекция личинок Drosophila является критически важным этапом нейробиологических исследований.
- Правильные методики повышают качество иммуногистохимического анализа.
- Данный протокол служит ценным ресурсом для исследователей в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Нервно-мышечный синапс (NMJ) личинок Drosophila служит генетически доступной моделью для изучения развития и пластичности синапсов, обеспечивая высокую степень доступности и разрешение на уровне отдельных клеток. Данный протокол диссекции позволяет воспроизводимо подготавливать NMJ для последующего применения, такого как визуализация, иммуногистохимия и электрофизиология, что способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах поиска. Предоставляя стандартизированный метод выделения и визуализации синаптических структур, данная методика повышает прогностическую достоверность при оценке нейробиологических мишеней и уточнении сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с синаптической функцией и путями нейроразвития.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет высокоточного визуализирования паттернов иннервации мышц мотонейронами.
- Прогностическая ценность: облегчает оценку влияния генетических или фармакологических вмешательств на морфологию и функцию НМС.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка стандартизированных биологических систем для скрининга соединений с обеспечением стабильного доступа к НМС.
- Количественные показатели: Обеспечение возможности измерения количества, размера синаптических бутионов и локализации белков в качестве фенотипических показателей.
- Масштабируемость: Поддержка параллельной обработки личинок для кампаний по скринингу со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: Моделирование консервативных синаптических механизмов, применимых для валидации мишеней при нейродегенеративных и нервно-мышечных расстройствах.
- Трансляционная преемственность: Связь генетических открытий на Drosophila с синаптической биологией млекопитающих через консервативные пути.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет на ранних этапах оценить взаимодействие с мишенью и модуляцию путей в живой, интактной системе.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Рабочий процесс диссекции интегрируется в этап ранних исследований, позволяя проверять гипотезы, затем переходит к идентификации соединений-лидеров с помощью количественной оценки синаптических фенотипов и обеспечивает доклиническую валидацию посредством фенотипического скрининга, релевантного для конкретного заболевания.
- Открывающая биология: способствует уточнению синаптических путей и функциональной валидации мишеней посредством прямой визуализации НМС.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу препаратов с воспроизводимыми структурными и флуоресцентными показателями для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет получать количественные морфологические и иммуногистохимические данные для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает синаптические механизмы Drosophila с доклиническими моделями через консервативные молекулярные пути.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для оценки нейронных мишеней в рамках нескольких кампаний по поиску новых лекарственных средств.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в исследованиях синапсов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость подготовки НМС в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности раннего обнаружения синаптической токсичности или связывания с мишенью.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию нейромишеней с учетом рисков на основе функциональных результатов синаптического анализа.
Рекомендации по реализации
- Требуются навыки работы с Drosophila, проведения микрохирургических операций и использования флуоресцентной микроскопии.
- Необходимы предметные стекла для диссекции, энтомологические булавки, пружинные ножницы, пинцеты и буфер HL 3.1.
- Требуется стандартизация натяжения при закреплении булавками и условий буфера для всех пользователей.
- При адаптации метода следует учитывать различные стадии развития личинок и генетический фон, влияющие на целостность мышц.
- Практические ограничения включают требования к мануальной ловкости и риск повреждения мышц при неточных действиях при диссекции.
