Name: Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Изучите иммуногистохимическое окрашивание нейромышечных синапсов личинок Drosophila. Этот метод позволяет визуализировать белки и исследовать генетическую регуляцию формирования синапсов.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Перед тем как начать <ol><li> Подготовьте следующие решения: PBT (0,1% Triton X100 в 1X PBS), PBTB (0,2% BSA в PBT) и PBTN (2% в PBTB NGS). </li><li> Рассеките дрозофилы личинок. Пожалуйста, смотрите дрозофилы личинок NMJ Dissection. </li></ol> Иммуногистохимия <ol><li> Перемещение личинок 1,5 мл пробирку PBT. Вымойте личинки дважды за 15 минут в PBT. Примечание: для стирки, места 1,5 мл трубки на nutator смесителя. Удалите жидкость с pippetor и заменить его свежей жидкостью. </li><li> Удалить PBT. Стирать в PBTB два раза в течение 30 минут. </li><li> Удалить PBTB. Стирать в PBTN два раза в течение 15 минут. </li><li> Инкубируйте в первичных антител разводят в PBTN при комнатной температуре в течение 1 часа или при температуре 4 º С в течение ночи. </li><li> Промыть два раза PBTB. Примечание: для полоскания добавить раствор и удалите быстро. </li><li> Мыть два раза в течение 15 минут в PBTB. </li><li> Стирать в PBTN течение 30 минут. </li><li> Инкубируйте в вторичными антителами (и сопряженных первичных антител, если вы используете один) разводят в PBTN. </li><li> Крышка из фольги и инкубировать в течение 1,5 часа при комнатной температуре. </li><li> Промыть два раза PBTB. </li><li> Мыть два раза в течение 15 минут с PBTB. </li><li> Приступить к установке. </li></ol> Монтаж Примечание: Гора в глицерине, если образцы будут отображаемого сразу. Горы в Продли Золотой если образцы будут храниться до томографии (более недели), или если образцы должны быть отображены несколько раз. Для использования, место бутылку продлить на 65 ° С водяной бане в течение 2-3 минут. Возьмите аликвоту Продли золото и держать в на тепло-блок на 45-50 º C. <ol><li> Налейте окрашенный подготавливает в PBT в к часовым стеклом. </li><li> Поместите немного глицерина на чистое предметное стекло для обработки. </li><li> Перемещение животных на обработку слайдов, выбирая их из часовым стеклом на углу использованием щипцов. Убедитесь, что они являются кутикулы стороной вниз. </li><li> Удалите головы и хвоста с новым лезвием на слайде обработки стекла. Exacto-нож с лезвием № 16 работает хорошо для этого. </li><li> С другой слайд (монтаж слайд), положить небольшую каплю глицерина / продлить и распространить ее чистой щипцами. </li><li> Перемещение расчлененный животных монтаж слайд их края, заботясь, чтобы не инвертировать их. Попробуйте подключить их в ряды в той же ориентации. Горы 6-8 животных на слайде. </li><li> Оставьте покровным стеклом, поставив на край в глицерин / Продли и медленно отпуская ее. </li><li> Печать слайдов с лаком для ногтей. Примечание [Не изображение, пока лак высохнет. Это обычно занимает десять минут. Для образцов установлены в продлении золото, слайды высохнуть в течение по крайней мере за три часа до запечатывания или изображений.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Иммуногистохимии (IHC) имеет жизненно важное значение для изучения NMJ биологии, поскольку она позволяет визуализировать NMJ. Это достигается с помощью антител, которые распознают нейронной мембраны (например, HRP), presynapse (например, CSP, SYT), и / или postsynapse (например, DLG). Сигнальных молекул, структурных белков, или новых белков интерес может также быть окрашены. Затем, гены могут быть мутировал или missexpressed и IHC может обнаружить возмущение синаптической структуре и / или нейронных сигналов. <p cla...

<table><tbody><tr><td>Стереомикроскоп &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Источник света KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Пинцет Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Пинцет Dumont №5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Нутаторный миксер Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Прецизионный нож №1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Лезвия №16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Реагент ProLong Gold Antifade</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

Дрозофилы личинок nmj immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

<em&gt; Drosophila</em&gt; Нервно-мышечном соединении (NMJ) является создана модель системы, используемой для исследования синаптических развития и пластичности. Широкое использование<em&gt; Drosophila</em&gt; Двигательного аппарата связано с его высокой доступности. Это могут быть проанализированы с одноклеточных разрешения. Есть 30 мышцы в hemisegment которого механизмом в рамках периферийной стенке тела известны. В общей сложности 31 моторных нейронов придают эти мышцы в шаблон, который имеет высокую точность. Использование молекулярной биологии и генетики, можно создать трансгенных животных или мутанты. Затем, можно изучать последствия развития на морфологию и функцию NMJ. Immunohistochemistry может использоваться для четко изображение компонентов NMJ. В этой статье мы покажем, как использовать антитела окрашивания для визуализации<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночной NMJ.

Этот протокол свидетельствует о том, как выполнить иммуногистохимии на расчлененный личинки дрозофилы.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Нервно-мышечный синапс (НМС) *Drosophila* является общепризнанной модельной системой, используемой для изучения развития и пластичности синапсов. Широкое применение...

В данном протоколе описывается метод проведения иммуногистохимического окрашивания препарированных личинок gsof для визуализации белков, участвующих в развитии синапсов. На протяжении всей процедуры, включая инкубацию с первичными и вторичными антителами, а также этапы промывки, используется пробирка объемом 1,7 мл. Затем личинок переносят на предметное стекло для обработки, где их подрезают скальпелем Exacto; для последующего изучения образцы перемещают в каплю реагента против выцветания.На предметном стекле покровное стекло окончательно закрепляют с помощью лака для ногтей. Здравствуйте, я Джонатан Брент из лаборатории Брайана МакКейда кафедры физиологии и клеточной биофизики медицинского колледжа Колумбийского университета. Мы используем эту процедуру для изучения генетической регуляции формирования синапсов в нервно-мышечных соединениях и развивающихся узлах Ранвье.Итак, приступим. Перед проведением иммуногистохимического анализа личинок gsof n MJ необходимо правильно препарировать личинок. Чтобы изучить эту процедуру, посмотрите сопроводительную видеостатью под названием «Препарирование личинок Drosophila n MJ».Для начала процедуры приготовьте три свежих раствора. Во-первых, приготовьте раствор PBT, добавив детергент в свежеприготовленный PBS. Во-вторых, возьмите аликвоту бычьего сывороточного альбумина и добавьте ее в раствор PBT.Для приготовления третьего раствора PB TB возьмите нормальную сыворотку козы в аквадистиллированной воде и добавьте ее в раствор PB TB для получения раствора PBTN. После приготовления этих растворов перенесите личинок в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл PBT. Это первая промывка.Каждая промывка включает замену раствора, в котором погружены личинки, с последующим инкубированием личинок на медленно вращающемся миксере-мутаторе. Не переносите личинок из пробирки в пробирку, так как это может их повредить. Первая промывка проводится в течение 15 минут при комнатной температуре.После 15 минут перемешивания замените PBT на свежий PBT с помощью пипетки и промывайте личинок еще в течение 15 минут. При замене промывочных растворов соблюдайте осторожность, чтобы не повредить личинок. По завершении промывок в PBT промойте личинки в PBTB в течение 30 минут.Повторите эту промывку со свежим раствором еще в течение 30 минут. На этом промывка в PBTB завершена. Дважды промойте в PBTN по 15 минут за каждую промывку.Во время второго этапа промывки первичные антитела можно развести в PBTN до требуемой рабочей концентрации. После промывки инкубируйте личинок в этой смеси антител в течение одного часа при осторожном перемешивании при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. По завершении инкубации удалите раствор первичных антител с помощью сифона и быстро промойте личинок PBTB несколько раз, чтобы удалить остатки антител.Чтобы подготовить личинок к следующей инкубации с антителами, промойте их один раз в PBTB в течение 15 минут и дважды в PBTN в течение 30 минут. Разведите вторичные антитела в PBTN до требуемой рабочей концентрации и инкубируйте личинок в этой смеси в течение полутора часов. При комнатной температуре обязательно накройте личинок, чтобы предотвратить воздействие света и минимизировать выцветание floor four.Через полтора часа удалите раствор вторичных антител и промойте личинок в PBTB еще несколько раз. Затем дважды промойте личинок в PBTV по 15 минут. Все последующие этапы промывки и хранения личинок следует проводить при минимальном воздействии света, поэтому обязательно держите их в закрытом состоянии.Перенесите личинки из пробирки объемом 1,5 мл в PBT на стеклянный предметный предмет для обработки. Теперь личинки готовы к монтированию; для фиксации окрашенных личинок поместите их в раствор золота с пролонгированным нагревом на водяной бане при 65 °C в течение двух-трех минут. Затем возьмите Eloqua и поместите его на термоблок, установленный на 50 °C.Нанесите небольшое количество PB TB на предметное стекло для обработки. Перенесите личинок в PB tb. Поверните личинок так, чтобы они лежали кутикулой вниз, используя скальпель Exacto с лезвием номер 16, и обрежьте головные и хвостовые концы личинок.Для этого этапа также можно использовать лезвие. Теперь подготовьте предметное стекло для монтажа, нанеся на чистое стекло 40 microliters золотого раствора Prolong из нагретой аликвоты, и распределите его чистым пинцетом. Используя пинцет.Осторожно перенесите от шести до восьми подготовленных личинок с предметного стекла для обработки на предметное стекло для монтажа. Постарайтесь сохранить их исходную ориентацию и располагайте их кутикулярной стороной вниз для последующего закрепления. Накройте препарат покровным стеклом поверх раствора.Установите его на одном краю по периферии вытянутой капли и осторожно опустите покровное стекло, чтобы оно накрыло образцы. Загерметизируйте края покровного стекла на предметном стекле любым густым недорогим лаком для ногтей. Оставьте предметное стекло сохнуть минимум на три часа.Если предметные стекла будут подвергнуты визуализации только один раз и сразу после подготовки, то длительную выдержку в растворе золота можно заменить глицерином. В этом случае время высыхания лака для ногтей и глицерина составит всего около 10 минут, в отличие от трех часов при любом протоколе окрашивания. Целью является получение высокого специфического сигнала при низком уровне фона.Этого достигают за счет использования высококачественных антител, а также тщательного проведения этапов блокировки и промывки. На этих изображениях представлены синапсы дикого типа, а также синапсы линии мух, экспрессирующих мутировавший BMP-рецептор 2-го типа, известный как мутант wishful thinking или witch. Нейрональная мембрана окрашена в синий цвет с помощью антител к пероксидазе хрена.Синаптические пузырьки, показанные красным цветом, окрашены антисинаптическими антителами. Постсинапс, показанный зеленым цветом, окрашен антителами к белку discs large. Эти результаты показали, что мутация рецептора BMP 2-го типа приводит к фенотипу недоразвития синапсов.Данный мутант сыграл ключевую роль в установлении того, что BMP выступают в качестве ретроградных сигналов, регулирующих количество синаптических терминальных бутонов. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить иммуногистохимический анализ нервно-мышечного соединения пищевода личинки. При выполнении данной процедуры.Важно строго соблюдать временные интервалы при выполнении процедуры, чтобы обеспечить максимальную воспроизводимость и низкий уровень фонового сигнала. На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Этот протокол свидетельствует о том, как...

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

Этот протокол описывает надежный метод обезболивания и обработки изображений...

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Нервно-мышечном соединении (NMJ)...

Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

Дендритные разветвление сенсорных...

Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики

Дрозофилы куколки Живот Immunohistochemistry

Чтобы понять, как сложные формы клеток, например, нейронных дендритов, достигаются в процессе развития, важно, чтобы быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для изучения организации микротрубочек дендритных разветвление дендритов нейронов сенсорных, трахея, мышцы и...

Immunohistological Маркировка микротрубочек в Сенсорные дендритов нейронов, трахеи, и мышцы в Drosophila Личинка стенки тела

Нервно-мышечное соединение дрозофилы (NMJ) используется в качестве модели для изучения морфологии и функции синапсов. В этом видео описываются важные характеристики, которые исследователи количественно оценивают для характеристики NMJ. В примере протокола показано программное обеспечение, способное выполнять количественную оценку в автоматическом режиме.

дрозофила Количественная оценка нервно-мышечных соединений (NMJ): метод оценки морфологии и функции синапсов

Этот протокол показывает, как Пробирной Расстояние Лигирование может быть использован для обнаружения в точке белок-белковых взаимодействий на Drosophila личиночной нервно-мышечном соединении. С помощью этого метода, Диски большой и Ху-ли тай Шао показаны с образованием комплекса в постсинаптической области, ассоциация ранее выявленных в рамках совместного иммунопреципитацией.

Обнаружение На месте белок-белковых комплексов в Drosophila Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование

Морфология, размер и расположение внутриклеточных органелл эволюционно консервативны и, по-видимому, напрямую влияют на их функцию. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, стало важной целью современной биологии. Здесь мы показываем, как эти исследования могут быть облегчены применением количественных методов.

Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная нейромышечных синапсах

В этом отчете представлена новая процедура подготовки образцов для визуализации нервно-мышечных соединений у личинок дрозофилы . Этот метод более эффективен в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом и особенно полезен для ультраструктурного анализа нервно-мышечного соединения дрозофилы .

Оптимизация процесса пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Использование нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек

Изучите иммуногистохимическое окрашивание нейромышечных синапсов личинок Drosophila. Этот метод позволяет визуализировать белки и исследовать генетическую регуляцию формирования синапсов.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Больше видео