Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Для перерезания аксонов с помощью двухфотонной визуализации in vivo поместите анестезированные эмбрионы данио-рерио в каплю агарозы по мере ее затвердевания в специальной камере, состоящей из тефлонового кольца и покровного стекла. Сверху на камеру помещается предметное стекло, после чего перед проведением аксотомии камеру переворачивают вверх дном. Сделайте изображение аксона, который вы хотите перерезать, при 40-кратном увеличении, а затем перейдите к 70-кратному увеличению в области, где будет проведена аксотомия.

При выключенном лазере увеличьте его мощность. Кратковременно включите лазер. На послеобразе аксона при успешном проведении эксотомии будут видны разрозненные фрагменты аксональной ткани.

Здравствуйте, я Джорджия О'Брайен. Здравствуйте, я Сандра Риго. А я Шона Мартин.

Мы представляем лабораторию Alvarez TI на кафедре молекулярной, клеточной и биологии развития Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру двухфотонной эксотомии и конфокальной визуализации с интервалом во времени (time-lapse) живых эмбрионов zebrafish. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения дегенерации и регенерации периферических соматосенсорных аксонов.

Итак, приступим. Для начала мы подготовим 1% раствор низкоплавкого агарозы для заливки. Растворим агарозу в дважды дистиллированной воде путем нагревания в микроволновой печи, после чего разлейем раствор по маленьким пробиркам и поместим их в нагревательный блок при температуре 42 °C.

Сначала эмбрионы помещают в раствор Рингера с 5% PTU через 22–24 часа после оплодотворения, чтобы подавить образование пигмента, который обладает сильной автофлуоресценцией и будет скрывать аксоны при двухфотонной микроскопии. Затем выбирают эмбрионы для визуализации и удаляют хорион, осторожно отделяя его пинцетом. После выбора эмбрионов их анестезируют, добавляя в раствор Рингера с PTU примерно 0,02% tricaine.

Перед началом работы убедитесь, что животные не реагируют на прикосновение. Подготовьте камеру для длительного имиджинга, нанеся вакуумную смазку на одну сторону стеклянного или тефлонового кольца и закрепив его на стеклянном покровном стекле. Будьте осторожны, чтобы не перенести большое количество раствора Рингера с PTU.

Перенесите один эмбрион в раствор agro при температуре 42 °C с помощью стеклянной пипетки. Затем перенесите эмбрион вместе с одной каплей agros на подготовленное покровное стекло. После переноса расположите эмбрион нужным образом, пока agros затвердевает.

Помните, что по завершении процедуры камера для визуализации будет перевернута так, чтобы медная пластинка оказалась сверху. Если вы используете моторизованный столик и можете визуализировать несколько участков одновременно, повторите эти шаги для каждого эмбриона. Дождитесь полного затвердевания агарозного геля.

Затем заполните кольцо раствором Рингера с 0,02% PTU для собак. Наконец, нанесите вакуумную смазку на другую сторону колец. Затем накройте их стеклом.

Переверните камеры с герметиком. Теперь мы готовы к проведению 4D-визуализации экзотомии. Чтобы подготовиться к визуализации, поместите смонтированные эмбрионы на держатель предметных стекол под микроскопом.

Сфокусируйтесь на одном эмбрионе, используя водный объектив 40 x 0,8 с числовой апертурой. Затем включите лазер. Установите длину волны лазера 910 nanometers и мощность 30 milliwatts.

Откройте программное обеспечение для визуализации. Мы используем программу для сканирования изображений, разработанную в лаборатории Бора (Boar's Laboratory) для исследования кораллов. При таком увеличении можно просканировать поле зрения в поисках подходящего аксона, который будет пересечен.

После обнаружения сделайте снимок целевого аксона. Отметьте первые и последние положения по оси Z, получите изображение и выполните максимальную проекцию Z-стеков. Затем увеличьте масштаб до 70х на том участке ветви аксона, который необходимо детально изучить.

Увеличьте мощность до 180 milliwatts и установите количество Z-срезов равным одному. Запустите одиночное сканирование лазером, нажав кнопку grab. Этого должно быть достаточно для перерезания аксона, однако данную процедуру необходимо оптимизировать с учетом вашего микроскопа и целей эксперимента.

В завершение уменьшите увеличение. Снизьте мощность до 30 milliwatts и сделайте снимок нашего только что перерезанного аксона. Если в вашей лаборатории нет специально сконструированного двухфотонного микроскопа, для перерезания аксонов также можно использовать конфокальный двухфотонный микроскоп Zes five 10.

Сначала поместите закрепленный эмбрион на предметный столик и сфокусируйте изображение, используя водный объектив 25 x. Затем включите двухфотонный лазер и лазер Argonne в многоканальном режиме, чтобы иметь возможность переключаться между ними. Хотя оба лазера используются для детекции GFP, двухфотонная эмиссия визуализируется красным цветом, а эмиссия лазера Argonne — зеленым.

Чтобы разграничить эти структуры, используйте лазер Argonne для идентификации аксона при заданных настройках Z. Отметьте первый и последний оптические срезы. Сделайте конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию по оси Z.

Выключите аргоновый лазер и включите двухфотонное лазерное сканирование при интенсивности около 9% пропускания. Чтобы убедиться, что аксон по-прежнему находится в фокусе, нажмите кнопку остановки, чтобы стал доступен инструмент обрезки. Используйте обрезку для увеличения интересующей области.

Обычно используется увеличение примерно 70 x. Выберите участок аксона, который необходимо повредить, и настройте фокус на этой области. Значение увеличения можно проверить на вкладке «mode».

Затем на вкладке «Каналы» (channels) измените интенсивность двухфотонного излучения с примерно 9% пропускания (transmission) до 15–30% пропускания. Чтобы активировать новые настройки, нажмите кнопку быстрого перемещения по XY (fast XY), а затем сразу нажмите «Стоп» (stop). Во избежание чрезмерного повреждения следует убедиться, что при правильном выполнении процедуры аксон выглядит как разрозненные обломки.

Наконец, чтобы убедиться, что аксон действительно был поврежден, переключитесь обратно на аргоновый лазер 488 нанометров. Сделайте еще одно конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию Z-стека. Теперь, когда мы продемонстрировали два способа перерезания аксонов с помощью двухфотонной лазерной микроскопии, мы перейдем к конфокальной таймлапс-визуализации регенерации с использованием Zeiss LSM 510.

Для подготовки к таймлапс-визуализации обязательно включите подогреваемую платформу как минимум за 30 минут до начала записи видео. Поместите закрепленные эмбрионы в держателе для предметных стекол под микроскопом. Сфокусируйтесь на одном эмбрионе, используя подходящий по кратности объектив.

Мы используем объектив с увеличением 20x и числовой апертурой 0.5, открываем программное обеспечение для визуализации Zeiss LSM 510, затем включаем соответствующие лазеры и задаем необходимую конфигурацию. Открываем окно управления сканирующим столиком и окна многократной съемки (multi-time windows). При наличии программного обеспечения для многократной съемки определите положение и конфигурацию первого эмбриона в окне multi-time.

Активируйте функцию быстрого сканирования в окне сканирования, затем переместите предметный столик в нужное положение по осям XY. Отметьте начальное и конечное положения по оси Z в окне сканирования. Нажмите кнопку остановки, а затем кнопку «mid» (середина) в окне сканирования и дождитесь завершения сканирования среднего Z-среза.

Затем нажмите «mark position» в окне столика. Если вы снимаете изображение только одного эмбриона, перейдите на вкладку «single location» в окне многократной съемки («multi-time window»). Нажмите «replace X, y, Z», а затем нажмите «save configuration».

Подтвердите согласие при запросе о перезаписи предыдущей конфигурации. Теперь в окне multi lo можно настроить параметры сбора изображений. Если вы используете механизированный предметный столик, можно задать несколько точек для съемки нескольких эмбрионов.

В данном случае перед определением координат X, Y, Z и конфигурации для первой позиции следует выбрать вкладку «multiple locations». Также убедитесь, что в выпадающем меню сразу под вкладкой «multiple locations» выбрана позиция «location one», а в выпадающем меню в разделе конфигурации указано «multi lo one». Перед нажатием кнопки «save configuration» определите положение и конфигурацию остальных эмбрионов в окне «multi-time».

Найдите область для следующего быстрого сканирования эмбриона, затем переместите столик в нужное положение по осям XY и отметьте начальное и конечное положения по оси Z в окне сканирования. Нажмите stop. Затем в окне сканирования выберите mid и дождитесь завершения сканирования среднего Z-среза.

Затем нажмите mark position. В окне stage выберите replace X, Y, Z. Убедитесь, что в выпадающем меню непосредственно под вкладкой multiple locations выбрано location two, а в выпадающем меню раздела configuration указано multi lobe two. Затем нажмите save configuration. Подтвердите выбор. При появлении запроса на перезапись предыдущей конфигурации повторите этот процесс для остальных эмбрионов.

Настройте параметры получения изображений в окне multi lo. Выберите опцию GR GL в списке block section. Затем введите желаемое количество групповых повторений.

Это количество раз, которое конфокальный микроскоп будет делать снимок в каждой точке. Введите желаемый интервал ожидания в разделе параметров. Это время от начала одного цикла визуализации до начала следующего.

Выберите Zack XY в разделе конфигурации. Введите базовое имя файла в нижней секции. Нажмите «select image db» и выберите свою базу данных.

Нажмите кнопку параметров, затем выберите папку MDB для сохранения временных файлов. Установите флажок «keep final image open». Сохраните итоговое изображение, выберите середину Zack и укажите интервал веса.

Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно параметров, затем нажмите на время начала. Оставьте окно с параметрами времени открытым на протяжении всего процесса визуализации. Теперь можно приступить к анализу данных.

По завершении таймлапс-съемки программное обеспечение Multi-time объединит все временные файлы в итоговый файл для каждой локации. Если вы хотите остановить запись до ее завершения, обязательно нажмите кнопку «finish» (завершить), а не «stop» (стоп), чтобы был создан итоговый файл.

Временные и сводные файлы должны автоматически сохраняться в назначенную папку MDB. Ниже представлен репрезентативный пример видеозаписи таймлапс-конфокальной микроскопии после выполнения эксотомии на 54-м часу после оплодотворения. На первом кадре показан дорсальный вид аксона до эксотомии, где желтая стрелка указывает на место последующей эксотомии.

Таймлапс-видео начинается в течение одного часа после экзотомии и длится 12 часов. Один конфокальный стек регистрировался каждые 20 минут. Данное конфокальное таймлапс-видео записано с использованием тех же параметров через 78 часов после оплодотворения.

На первом кадре показан аксон в профиль перед эксцизией, желтая стрелка указывает на место эксцизии. Мы только что продемонстрировали способ нанесения точечных повреждений тканей и визуализации живых эмбрионов zebrafish с помощью двухфотонной эксцизии и конфокальной таймлапс-визуализации. При выполнении данной процедуры важно оптимизировать мощность двухфотонного лазера при эксцизии, чтобы избежать чрезмерного повреждения тканей.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.