Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Для разрезания аксонов с помощью визуализации in vivo с помощью двухфотонной визуализации обезболивают эмбрионы данио-рерио в пределах капли ароса по мере их затвердевания в специализированной камере, состоящей из TEFL для стирки и покровного стекла. Стеклянный светильник помещается на верхнюю часть камеры, который затем переворачивается вверх дном перед экс-ототомией. Сделайте предварительное изображение аксона, который вы хотите разрезать, с 40-кратным увеличением до 70-кратного на области, которую вы хотите экзомизировать.

И когда лазер выключен, увеличьте мощность лазера. Кратковременно включите лазер. На последующем изображении аксона вы увидите разбросанные обломки аксонов, если экс-ототомия прошла успешно.

Привет, меня зовут Джорджия О'Брайен. Привет, меня зовут Сандра Риго. А меня зовут Шона Мартин.

Мы из лаборатории Альвареса TI на кафедре молекулярной клеточной биологии и биологии развития в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Сегодня мы покажем вам процедуру двухфотонной экссодомии и покадровой конфокальной визуализации на живых эмбрионах рыбок данио. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения дегенерации и регенерации периферических соматосенсорных аксонов.

Итак, приступим. Для начала мы приготовим 1%-ный раствор для рисования с низким содержанием таяния для встраивания. Мы растворяем агрос в воде с двойным дистальным отделением, нагревая в микроволновой печи перед тем, как Алек поливает в небольшие трубочки и храним в нагревательном блоке при температуре 42 градуса Цельсия.

Первые эмбрионы могут быть помещены в 5%-ный раствор ПТУ через 22-24 часа после оплодотворения, чтобы подавить образование пигмента, который является ярким, автофлуоресцентным и будет затемнять аксоны на двухфотонном микроскопе. Далее мы отбираем эмбрионы для визуализации и удаляем их чун, аккуратно раздвигая их щипцами. После того, как эмбрионы выбраны, они обезболиваются, добавляя около 0,02% трики в кольцевые устройства ПТУ.

Прежде чем продолжить, убедитесь, что животные не реагируют на прикосновения. Подготовьте камеру долговременной визуализации, нанеся вакуумную смазку на одну сторону стеклянного или тефлонового кольца и закрепив ее на стеклянной крышке. Заботясь о том, чтобы не переносить много звонарей ПТУ.

Перенесите один эмбрион в 42-градусный агрораствор с помощью стеклянной пипетки. Затем перенесите зародыш с одной каплей агроса на подготовленный покровный лист. После переноса расположите эмбрион по желанию, пока агрос затвердевает.

Имейте в виду, что камера визуализации будет перевернута, когда вы закончите, так что медный шликер будет верхней поверхностью. Если у вас моторизованная сцена и вы можете визуализировать несколько мест одновременно, повторите эти шаги для каждого эмбриона. Дайте агророзам полностью застыть.

Затем заполните кольцо 0,02%tri dogine PTU ringers. Наконец, нанесите вакуумную смазку на другую сторону колец. Затем накройте их стеклянной подсветкой.

Переверните камеры уплотнения. Теперь мы готовы к двум четырехтонным экзотомическим снимкам. Чтобы подготовиться к визуализации, поместите смонтированные эмбрионы на держатель предметного стекла под микроскопом.

Сфокусируйтесь на одном эмбрионе с помощью водного объектива с числовой апертурой 40 x 0,8. Затем включите лазер. Установите лазер на длину волны 910 нанометров и мощность 30 милливатт.

Откройте программное обеспечение для обработки изображений. Мы используем программное обеспечение для сканирования изображений, разработанное на кораллах для Лаборатории Кабана. При этой мощности можно сканировать поле в поисках потенциального аксона, который будет разорван.

Найдя его, сделайте снимок целевого аксона. Отметьте первую и последнюю Z-позиции, получите изображение и сделайте максимальную проекцию Z-стеков. Затем увеличьте в 70 раз ветвь аксона, которую вы хотите выделить.

Увеличьте мощность до 180 милливатт и установите количество Z-ломтиков равным одному. Запустите одиночное сканирование с помощью лазера, нажав на захват. Этого должно быть достаточно, чтобы разорвать аксон, однако необходимо оптимизировать эту процедуру для вашего микроскопа и экспериментальной цели.

Наконец, уменьшите масштаб. Уменьшите мощность до 30 милливатт и сделайте снимок нашего только что разорванного аксона. Если в вашей лаборатории нет специально изготовленного двухфотонного эндоскопа, конфокальный двухфотонный микроскоп Zes 5 10 также можно использовать для разрыва аксонов.

Мы начинаем с того, что помещаем установленный эмбрион на сцену и фокусируем его с помощью 25-кратного водяного объектива. Далее включите два фотона в Аргоннских лазерах в многодорожечном режиме, чтобы можно было переключаться с одного на другой. Хотя оба лазера используются для обнаружения GFP, двухфотонное излучение визуализируется красным цветом, а излучение аргоннового лазера — зеленым.

Чтобы различить их, используйте Аргоннский лазер для определения аксона, который будет устойчив при настройках Z. Отметьте первый и последний оптические участки. Сделайте конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию Зака.

Выключите аргоновый лазер и включите двухфотонное лазерное сканирование с интенсивностью пропускания около 9%. Чтобы убедиться, что аксон все еще находится в фокусе, нажмите кнопку стоп, чтобы инструмент обрезки был доступен. Используйте обрезку для увеличения области интереса.

Обычно мы увеличиваем масштаб примерно до 70 раз. Выберите область аксона, которую нужно травмировать, и сфокусируйте эту область. Зум можно проверить на вкладке режимов.

Затем на вкладке каналов измените интенсивность двух фотонов с примерно 9% пропускания до 15-30%. Чтобы активировать новые настройки, нажмите кнопку быстрого XY, а затем нажмите «Стоп». Чтобы избежать чрезмерного повреждения, аксон следует рассматривать как разбросанный мусор, если процедура сработала.

Наконец, чтобы убедиться, что аксон действительно был поврежден, переключитесь обратно на аргоннский лазер 4 88 нанометров. Возьмите еще одно конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию Заков. Теперь, когда мы показали вам два способа разрыва аксонов с помощью двухфотонной лазерной микроскопии, мы рассмотрим конфокальную TimeLapse-визуализацию регенерации с помощью zes LSM five 10.

Чтобы подготовить цейтраферную съемку, обязательно включите нагретую сцену как минимум за 30 минут до настройки цейтраферного фильма. Поместите смонтированные эмбрионы на предметное стекло под микроскопом. Сосредоточьтесь на одном эмбрионе с желаемой целью подачи воздуха.

Мы используем объектив с числовой апертурой 20 x 0,5, открываем программное обеспечение для визуализации Zeiss LSM five 10, а затем включаем соответствующие лазеры и настраиваем желаемую конфигурацию. Откройте этап сканирования и многовременные окна. Если у вас есть программное обеспечение для мультитайма, определите положение и конфигурацию вашего первого эмбриона в мультивременном окне.

Активируйте быстрое сканирование в окне сканирования, затем переместите предметный столик в нужное положение XY. Отметьте первую и последнюю Z-позиции в окне сканирования. Нажмите стоп, а затем в середине также в окне сканирования дождитесь завершения сканирования среднего Z-среза.

Затем нажмите отметить положение в окне этапа. Если вы визуализируете только один эмбрион, нажмите на вкладку «Одно местоположение» в многовременном окне. Нажмите на замену X, y, Z. Затем нажмите на сохранение конфигурации.

Соглашайтесь, когда вас попросят переопределить предыдущую конфигурацию. Теперь вы можете настроить параметры для получения изображения в окне multi lo. Если у вас механизированная стадия, вы можете настроить несколько мест для визуализации нескольких эмбрионов.

В этом случае вы должны выбрать вкладку «Несколько местоположений» перед определением X, Y, Z и конфигурации для вашего первого местоположения. Кроме того, убедитесь, что выпадающее меню сразу под вкладкой «Несколько местоположений» находится на первом месте, а в раскрывающемся меню в разделе конфигурации написано «Несколько ло-одно». Прежде чем нажать кнопку «Сохранить конфигурацию», определите положение и конфигурацию оставшихся эмбрионов в многовременном окне.

Найдите следующий эмбрион с помощью кнопки быстрого сканирования, затем переместите предметный столик в нужное положение XY и отметьте первую и последнюю Z-позиции в окне сканирования. Нажмите стоп. Затем в середине также в окне сканирования дождитесь завершения сканирования среднего Z-среза.

Затем нажмите отметить положение в окне этапа, нажмите на замену X, Y, Z. Убедитесь, что выпадающее меню прямо под вкладкой нескольких мест находится на втором месте, а в выпадающем меню в разделе конфигурации написано несколько лепестков два. Затем нажмите «Сохранить конфигурацию». Соглашаться. Когда вас попросят перезаписать предыдущую конфигурацию, повторите этот процесс для оставшихся эмбрионов.

Настройте параметры для получения изображения в окне multi lo. Выберите опцию GR GL в разделе списка блоков. Затем введите желаемое количество групповых повторений.

Это количество раз, когда конфокальный конфокальный аппарат будет получать изображение в каждом месте. Введите нужный интервал веса в разделе параметров. Это промежуток времени с начала одного повторения изображения до начала следующего.

Выберите Zack XY в разделе конфигурации. Введите имя базового файла в нижней части. Нажмите на Select image db и выберите свою базу данных.

Нажмите на кнопку настроек, затем выберите папку MDB, чтобы сохранить временные файлы. Установите флажок, чтобы окончательное изображение оставалось открытым. Сохраните итоговое изображение, середину Зака и выберите интервал веса.

Нажмите OK, чтобы закрыть окно настроек, затем нажмите на время начала. Оставьте многовременное окно открытым на время создания образа. Теперь пришло время проанализировать свои данные.

Когда интервальная съемка будет завершена. Многоразовое программное обеспечение соберет все ваши временные файлы в сводный файл для каждого местоположения. Если вы хотите остановить фильм до его завершения, обязательно нажмите кнопку «Готово» вместо «Стоп», чтобы был создан файл сводки.

Временные файлы и сводные файлы должны быть автоматически сохранены в указанной папке MDB. Вот типичный пример покадрового конфокального фильма после экс-отомии через 54 часа после оплодотворения. На первом кадре показан дорсальный вид аксона перед экс-отомией с желтой стрелкой, указывающей на место экс-отомии в следующий раз.

Задержка фильма начинается в течение одного часа после экс-отомии и длится 12 часов. Каждые 20 минут собирали одну конфокальную стопку. Этот запаздывающий конфокальный фильм записывается с использованием тех же параметров через 78 часов после оплодотворения.

На первом кадре показан вид сбоку аксона до бывшей содомии с желтой стрелкой, указывающей на место бывшей содомии. Мы только что показали вам, как создать точное повреждение тканей и визуализировать живые эмбрионы рыбок данио с помощью двухфотонной содомии и покадровой конфокальной визуализации. При выполнении этой процедуры важно оптимизировать количество мощности, используемой для двухфотонного лазера ex sdomy, чтобы избежать причинения избыточных повреждений.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.