Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Для измерения продолжительности жизни C. elegans создается популяцией с синхронизированным возрастом с использованием метода временного сбора яиц. Активных взрослых гермафродитных червей переносят на чашки с питательной средой для роста нематод (NGM), засеянные E. coli, убитыми УФ-излучением; червям позволяют откладывать яйца в течение шести-восьми часов, после чего их удаляют. В течение следующих двух дней из этих яиц вылупляются черви и развиваются до личиночной стадии L4. Червей стадии L4 переносят на новые чашки NGM, содержащие ампициллин для предотвращения контаминации живыми бактериями и FUDR для предотвращения размножения, и позволяют им развиться во взрослых особей.

С этого момента за взрослыми червями наблюдают каждые два-три дня до тех пор, пока все черви не погибнут. В каждой временной точке погибших червей удаляют с чашки, а количество живых и мертвых червей регистрируют. Я Джордж Сетон из лаборатории Мэтта Каплайна на кафедре патологии Университета Вашингтона.

Сегодня мы продемонстрируем вам, как измерять продолжительность жизни и оценивать наше состояние гепатита элеганс. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения генетики старения. Итак, приступим.

Для базового эксперимента по изучению продолжительности жизни требуются два типа чашек: стандартные чашки с NGM, не содержащие добавок, и чашки с AMP FUDR, в которые в NGM добавлены ампициллин и фтордезоксиуридин. Оба типа чашек засевают бактериями e coli OP 50, которые впоследствии уничтожают воздействием УФ-излучения. Начните с приготовления 10 мл раствора NGM.

Для каждой чашки Петри диаметром 60 миллиметров полностью расплавьте твердую среду NGM, используя микроволновую печь на максимальной мощности, воздействуя импульсами по 32 секунды. Перемешивайте среду между импульсами, чтобы предотвратить образование пузырьков газа под давлением; поместите жидкую среду NGM в водяную баню при 55 градусов Цельсия или оставьте на столе до охлаждения. Когда среда остынет до 55 градусов Цельсия (в этот момент стеклянный контейнер можно будет комфортно держать голыми руками), она будет готова к добавлению препаратов.

Для подготовки чашек с препаратами добавьте 33 µL 150 mM FUDR и 100 µL 100 mg/mL ампициллина на 100 mL NGM, затем перемешайте круговыми движениями. Ампициллин используется для предотвращения контаминации посторонними бактериями, а FUDR — для предотвращения вылупления яиц. Таким образом, червей не потребуется переносить каждые несколько дней для их отделения от растущих личинок.

Теперь разлейте среду и дайте чашкам высохнуть на столе в течение двух дней; в день перед окончанием высыхания чашек внесите в жидкую культуру LB одну колонию из свежего посева бактерий E. coli OP50 на LB-агар. Подготовьте не менее 0,5 мл культуры на одну чашку диаметром 60 мм.

Поместите культуру OP 50 в шейкер при температуре 37 °C и оставьте бактерии для роста в течение ночи. На следующий день осадите бактерии OP 50 центрифугированием при 3 500 g в течение 10 минут. Слейте достаточное количество супернатанта, чтобы ресуспендировать бактерии до 10-кратной концентрации.

Теперь инокулируйте каждую чашку 100 µL концентрированной культуры. Избегайте касания кончиком пипетки поверхности NGM, так как дефекты поверхности среды позволят червям зарыться; вращайте чашки до тех пор, пока бактерии не покроют центральную область NGM, не приближаясь к стенкам чашек, и оставьте чашки сохнуть на лабораторном столе на 24 часа. После высыхания подвергните поверхность чашек воздействию УФ-дозы, достаточной для остановки роста бактерий; мы используем StrataGene UV Crosslinker 2400.

Начните с загрузки планшетов в соединительный элемент (straddle linker) без крышек. Затем нажмите кнопку energy. Введите 9 9 9 9 на клавиатуре и нажмите start.

Пластины подвергают воздействию УФ-излучения в течение примерно пяти минут. Пластины с бактериями, уничтоженными УФ-излучением, можно хранить в перевернутом виде при температуре четырех градусов Celsius до одного месяца. В данном разделе описывается способ получения популяции червей с общей датой вылупления.

Начните с переноса примерно 20 молодых взрослых червей на свежую чашку с NGM без добавления препаратов. Оставьте чашку при температуре 25 °C примерно на неделю, чтобы черви могли размножиться и полностью употребить всю бактериальную подкормку в течение недели. Когда появятся нововылупившиеся черви на стадии задержки роста (dower stage), перенесите от 20 до 30 личинок dower на свежую чашку с NGM без препаратов и инкубируйте их при температуре 25 °C в присутствии подкормки.

Личинки стадии dower станут репродуктивно активными взрослыми особями в течение двух дней и будут оставаться репродуктивно активными еще несколько дней после этого. Теперь перенесите от 10 до 15 репродуктивно активных взрослых особей на свежую чашку с NGM без добавления препаратов. Эта чашка называется чашкой для контролируемой яйцекладки или TEL-чашкой.

Оставьте чашку с TEL при 25 °C, чтобы черви могли отложить яйца. Животные, вылупившиеся из этих яиц, станут экспериментальными животными, и через шесть часов будет проведена оценка продолжительности их жизни. Осмотрите чашку с TEL на наличие яиц.

Если количество яиц все еще недостаточное, оставьте планшет TEL при температуре 25 °C на срок до 24 часов в общей сложности, периодически проверяя наличие яиц. После того как будет отложено достаточное количество яиц, удалите взрослых особей с планшета TEL.

Для типичного эксперимента по определению продолжительности жизни потребуется от 30 до 90 яиц на одну экспериментальную группу, однако на одной чашке с TEL-средой можно получить несколько сотен яиц. Примерно 150 яиц откладывается 10–15 репродуктивно активными взрослыми особями за шесть-восемь часов. При сравнении экспериментальных групп статистическая значимость может быть достигнута даже при наличии всего 30 животных, если различия в продолжительности жизни существенны.

Для выявления менее выраженных различий следует использовать большее количество животных. Теперь поместите чашку с TEL без взрослых особей при температуре 20 °C до тех пор, пока яйца не вылупятся, а черви не достигнут стадии личинки L4. Для дикого типа C elegance это обычно занимает два дня, но может потребоваться больше времени для штаммов с фенотипом замедленного развития.

В данном разделе описывается способ наблюдения за жизненным циклом популяции с синхронизированным возрастом. Сначала перенесите личинки на четвертой стадии развития (L4) с чашек TEL на подготовленные чашки AMP FUDR. Для каждого исследуемого штамма или условия обычно готовят две-три чашки, содержащие от 25 до 30 червей в каждой.

Инкубируйте чашки с AMP FUDR при температуре 20 °C в течение 24 часов. Затем проведите визуальную оценку состояния червей, среды и бактерий, после чего перенесите червей на свежие чашки с AMP FUDR. Перенос обычно проводят один или два раза в неделю, когда черви поедают большую часть бактериальной пищи.

Если на раннем этапе эксперимента наблюдается значительное количество личинок, это обычно указывает на то, что черви были перенесены на чашки с AMP FUDR в стадии молодых взрослых особей, а не в стадии L4. Молодые взрослые особи могут откладывать яйца до того, как FUDR начнет действовать, и иногда личинки избегают воздействия FUDR и вырастают во взрослых особей. В данной ситуации такие личинки будут искажать результаты эксперимента; в этом случае перенесите взрослых червей на свежие чашки, а старые чашки с личинками утилизируйте.

При обнаружении живых растущих бактерий червей также следует перенести на свежие чашки. Как правило, комбинация воздействия AMP и УФ-излучения гарантирует отсутствие бактериального загрязнения в эксперименте, однако в отдельных случаях оно может произойти. Также перенесите червей.

При обнаружении роста грибка на среде. Если грибок выявлен на ранней стадии, его можно удалить с помощью наконечника дозатора или шпателя. Если же диаметр колонии превышает несколько миллиметров, обычно проще перенести червей на новую чашку.

Каждые два-три дня оценивайте продолжительность жизни всех червей. Используя диссекционный стереомикроскоп, определяйте, жив червь или мертв.

Осторожно постучите по чашке. Если червь двигается в ответ на постукивание, значит, он жив. Если червь не реагирует на постукивание по чашке, увеличьте изображение области головы и осторожно коснитесь головы червя платиновой петлей.

Отметьте червя как мертвого. Если он не реагирует, не двигая головой, удалите мертвого червя с чашки. После проверки всех червей запишите дату, а также количество живых и мертвых особей.

Черви, содержащиеся на твердых средах, иногда могут покидать поверхность чашки, зарываясь в среду или переползая по стенке. Черви, покинувшие среду, полностью исключаются из исследования. По завершении работы верните чашки в инкубатор при 20 °C.

Подождите еще два-три дня, после чего снова проверьте планшеты. Продолжайте соблюдать этот режим до тех пор, пока все черви не погибнут. Количество червей, погибающих ежедневно, обычно инвертируют для расчета доли выживших особей на каждый день; эти данные представляются в виде графика кривой выживаемости с учетом дня timed egg laying.

День ноль. Типичный медианный срок жизни для N two. Дикий тип штамма Sea elgan, поддерживаемый на среде UV kill bacteria при 20 °C, составляет приблизительно 25 дней, начиная с момента появления яйца.

Мы только что продемонстрировали вам, как измерять продолжительность жизни и оценивать сохранность внешнего вида. Вы можете модифицировать эту базовую процедуру для тестирования различных условий окружающей среды, включая ограничение в питании и РНК-интерференцию, которые обсуждаются в сопроводительном тексте. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в проведении вашего эксперимента.