Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Для измерения продолжительности жизни в C Elgan генерируется популяция, синхронизированная по возрасту, с помощью таймерного egg lang репродуктивно. Активные взрослые гермафродитные черви переносятся на пластины нематод, засеянные УФ-умершей кишкой палочкой, дают откладывать яйца в течение шести-восьми часов, а затем удаляются в течение следующих двух дней, из этих яиц вылупляются черви и достигают стадии личинки L-4. Четыре червя L переносятся на новые NGM-пластины, содержащие ампициллин, чтобы предотвратить заражение живыми бактериями, а FUDR — для предотвращения размножения, после чего разрешают развиваться во взрослых особей.

С этого момента взрослые черви наблюдаются каждые два-три дня, пока все черви не погибнут. В каждый момент времени с пластины удаляются мёртвые черви и фиксируется количество живых и мёртвых червей. Я Джордж Сетон из лаборатории Мэтта Каплайна на кафедре патологии Университета Вашингтона.

Сегодня мы покажем вам, как измерять продолжительность жизни и увидеть нашу элегантность при гепатите. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения генетики старения. Давайте начнём.

Базовый эксперимент по продолжительности жизни требует двух типов пластин: стандартных пластин NGM, которые не содержат добавок, и пластин AMP FUDR, к которым добавляются как ампициллин, так и фтордезоксиуридин. Оба типа пластин оснащены бактериями E. coli OP 50, которые затем уничтожаются при воздействии УФ-излучения. Начните с приготовления 10 миллилитров раствора NGM.

На 60-миллиметровую чашку Петри полностью расплавляет твёрдый НГМ, разогревая микроволновку на высоких 32-х импульсах. Перемешивайте среду между импульсами, чтобы предотвратить образование пузырьков под давлением, помещайте жидкий NGM в водяную ванну при температуре 55 градусов Цельсия или на стол, чтобы среда охладилась. После того как среда остынет до 55 градусов Цельсия, после чего вы сможете комфортно держать стеклянную ёмкость голыми руками — она готова к добавлению лекарств.

А чтобы налить тарелки с лекарствами, добавьте 33 микролитра 150 миллимолярных FUDR и 100 микролитров по 100 миллиграмм на миллилитр. Ампициллин на 100 миллилитров NGM и завихрь для смешивания ампициллина применяется для предотвращения заражения чужерными бактериями, а FUDR — для предотвращения вылупления яиц. Поэтому червям не придётся перемещать каждые несколько дней, чтобы отделить их от растущих личинок.

Теперь вылейте среду и дайте тарелкам высохнуть на столе в течение двух дней в день до того, как тарелки закончили сушку жидкой культуры LB с одной колонией из свежей полосы кишки палочки. Бактерии OP 50 на шнеке LB. Подготовьте культуру не менее 0,5 миллилитра на 60-миллиметровую тарелку.

Поместите культуру OP 50 в шейкер при температуре 37 градусов Цельсия и дайте бактериям расти на ночь. На следующий день гранулируйте бактерии OP 50 с 3 500 г центробежной силы в течение 10 минут. Декантируйте столько супернатанта, чтобы бактерии реуспензировали при концентрации 10 раз.

Теперь инокулируйте каждую тарелку 100 микролитрами концентрированной культуры. Избегайте прикосновения кончика пипетки к поверхности NGM, так как дефекты поверхности среды позволят червям зарывать закрученные пластины, пока бактерии не покроют центральную область NGM, не приближаясь к стенкам пластины, и оставят пластины сушиться на столе в течение 24 часов. Когда они высохнут, подвергаем поверхность пластин воздействию ультрафиолетовой дозы, достаточно сильной для остановки роста бактерий, используем strata gene UV straddle linker 2,400.

Начните с загрузки пластин в straddle linker без крышек. Теперь нажимайте на энергию. Введите 9 9 9 9 на клавиатуре и нажмите старт.

Пластины будут подвергаться воздействию ультрафиолета примерно пять минут. Пластины с УФ-уничтоженными бактериями можно хранить вверх ногами при четырёх градусах Цельсия до месяца. В этом разделе описывается, как сформировать популяцию червей с общей датой вылупления.

Начните с переноса примерно 20 молодых взрослых червей на свежую пластину NGM без лекарств. Оставьте тарелку при 25 градусах Цельсия примерно на неделю, чтобы черви могли размножаться и съедать всю бактериальную пищу в течение недели. Недавно вылупившиеся черви на стадии остановки приданого должны быть перенесены 20–30 личинок приданого на свежую пластину NGM без лекарств и инкубировать их при 25 градусах Цельсия в присутствии пищи.

Личинки вдовы становятся репродуктивно активными взрослыми людьми в течение двух дней и сохраняют репродуктивную активность ещё несколько дней. Теперь переведите 10–15 репродуктивно активных взрослых на новую пластину NGM без лекарств. Эта пластина называется таймерной откладкой яиц или TEL-пластиной.

Оставьте TEL-пластину при 25 градусах Цельсия, чтобы черви могли отложить яйца. Животные, вылупляющиеся из этих яиц, будут экспериментальными, и их продолжительность жизни оценивается через шесть часов. Проверьте TEL на наличие яиц.

Если яиц ещё недостаточно, оставьте TEL-пластину при 25 градусах Цельсия в общей сложности до 24 часов. Периодически проверяю яйца. Когда отложено достаточное количество яиц, извлекают взрослых особей из TEL-пластины.

Типичный эксперимент с продолжительностью жизни потребует от 30 до 90 яиц на одну группу, но на одной TEL-пластине можно сгенерировать несколько сотен яиц. Примерно 150 яиц откладывают 10–15 репродуктивно активных взрослых особей за шесть-восемь часов. При сравнении экспериментальных групп статистическая значимость может быть достигнута при больших разницах в продолжительности жизни всего с 30 животными.

Для различия более скромных различий следует использовать больше животных. Теперь поставьте TEL-пластину без взрослых на 20 градусов Цельсия, пока яйца не вылупятся, а черви не достигнут стадии личинок L 4. Обычно это занимает два дня для элегантности дикого типа C, но для сортов с медленным фенотипом может занять больше времени.

В этом разделе описывается, как отслеживать жизнь популяции, синхронизированной по возрасту. Сначала перенесите личинку L-четырёх с TEL-пластины на сидящие AMP FUDR пластины. Для каждого тестируемого штама или состояния обычно устанавливают от двух до трёх пластин с 25–30 червями на каждую.

Инкубировать пластины AMP FUDR при 20 градусах Цельсия в течение 24 часов. Затем визуально оценивают червяки, среду и бактерии, переносящие червей на свежие пластины AMP FUDR. Если черви съели большую часть бактериальной пищи, это обычно происходит раз или два в неделю.

На ранних этапах эксперимента, если присутствует значительное количество личинок, это обычно означает, что черви были перенесены на пластины AMP FUDR в молодых взрослых возрастах, а не в виде L-четверок. Молодые взрослые могут откладывать яйца до того, как FUDR начнёт действовать, и иногда личинки избегают его воздействия и вырастают во взрослых особей. Эти личинки запутают эксперимент в такой ситуации, переносят взрослых червей на свежие пластины и сбрасывают старые пластины с личинками.

Червей также следует переносить на свежие пластины, если наблюдаются живые растущие бактерии. В целом, сочетание АМФ и УФ-поражения гарантирует, что живые бактерии не заражают эксперимент, но иногда это происходит. Также перенесите червей.

Если на среде наблюдается грибковый рост. Если грибок обнаружен достаточно рано, можно удалить с помощью пипетки или лопатки. Когда черви вырастают до нескольких миллиметров в диаметре, обычно легче перенести червя на новую пластину.

Проверяйте всем червям продолжительность жизни каждые два-три дня. С помощью телескопа для вскрытия. Определите, жив ли каждый червь или мёртв.

Осторожно постучите по тарелке. Червь жив, если он движется в ответ на постукивание. Если червь не реагирует на постукивание по пластине, увеличите область головы и аккуратно постучите по головке червя платиновым трансферным медиатором.

Оцените червя как мёртвого. Если червь не реагирует, двигая голову, уберите мёртвого червя с пластины. После проверки всех червей запишите дату и количество живых и мёртвых червей.

Черви, содержащиеся на твёрдой среде, иногда выбегают из поверхности пластины, зарываясь или ползая по стене. Черви, которые убегают, полностью исключаются из исследования. Когда всё будет готово, верните пластины в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия.

Подождите ещё два-три дня, а потом снова проверьте номера. Продолжайте этот режим, пока все черви не умрут. Количество червей, погибающих в день, обычно инвертируется для расчёта доли живых червей в каждый день; эти данные отображаются графически как кривая выживаемости с учётом дня откладки яиц.

День ноль. Типичная медианная продолжительность жизни для N два. Штамм Sea elgan wild, поддерживаемый на бактериях, убивающих УФ-излучение при 20 градусах Цельсия, составляет примерно 25 дней по сравнению с яйцом.

Мы только что показали вам, как измерять продолжительность жизни и видеть элегантность. Вы можете модифицировать эту базовую процедуру, чтобы проверить различные условия окружающей среды, включая ограничения в питании и РНК-интерференцию, что обсуждается в сопроводительном тексте. Вот и всё.

Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.