Разбор и запись с Junction C. Elegans нервно-мышечной

Предметное стекло с покрытием из согара, изготовленное путем нанесения капли согара на стекло и отверждения в течение ночи, помещают в круглую полость предварительно изготовленной регистрирующей камеры и заливают регистрирующим раствором. Червя, помещенного в центр, приклеивают к поверхности защитного бортика, начиная с головы или хвоста, нанося клей на дорсальную сторону червя с помощью клеевой пипетки. После завершения приклеивания с помощью стеклянной иглы делают надрез рядом с вульвой на границе между кутикулой и клеем, который затем продлевают в направлении головы, извлекая внутренние органы и яйца из полости тела.

Срезанный край разреза точечно приклеивается клеем к согару, открывая вентральный нерв и мышцы body wall. К вентральной медиальной мышце перед вульвой применяется метод локальной фиксации мембраны (patch clamp), а стимулирующий электрод помещается выше по нервному шнуру. Здравствуйте, я Джанет Ричмонд, доцент кафедры биологических наук Иллинойсского университета в Чикаго.

Сегодня я продемонстрирую технику диссекции, которая позволяет обнажить нервно-мышечные соединения морского слизня для электрофизиологической регистрации. Мы используем этот препарат для изучения синаптической передачи.

Итак, приступим. Перед началом работы с нематодами необходимо изготовить определенное оборудование как минимум за один день до проведения процедуры. Вам понадобятся камера для записи диссекции, покровные стекла с покрытием S guard, старые пипетки, аппликатор для клея и экстракционная пипетка.

Начните с изготовления камеры. Вырежьте лист плексигласа толщиной 1/16 дюйма по размеру предметного столика микроскопа. Записи следует проводить в центре плексигласа.

Просверлите круглое отверстие достаточного размера, чтобы в него можно было вклеить круглое покровное стекло диаметром 22 миллиметра. Приклейте покровное стекло размером 48 на 60 миллиметров к нижней стороне камеры под отверстием, поместив по грануле низкоплавкого парапласта (воска для заливки тканей) в каждый угол покровного стекла. Воск быстро расплавляют на нагревательной плитке; после охлаждения между плексигласом и покровным стеклом остается тонкий слой воска. Отрежьте излишки воска лезвием.

Покрывным стеклом, подходящим для камеры, является покровное стекло диаметром 22 мм с S-guard покрытием. Для обеспечения работоспособности SARD раствор должен быть свежеприготовленным в соответствии с инструкциями производителя. После приготовления на каждое покровное стекло наносят небольшую каплю SARD и распределяют ее с помощью лезвия для создания ровной поверхности.

Затем покрытые покровные стекла помещают в закрытые контейнеры и оставляют в печи при температуре 65 °C на ночь для полимеризации. Завтра они будут готовы к проведению диссекции в соответствии с протоколом. Потребуются силикатные стеклянные пипетки с внешним диаметром 1 мм, вытянутые до кончика с сопротивлением около 4 МОм, поэтому рекомендуется заранее подготовить их в отдельной емкости.

Ознакомьтесь с публикацией JoVE «Изготовление патч-электрода, пипеток и острых электродов с помощью программируемого пуллатора», автором которой является Miriam Goodman. Для обеспечения технических условий проведения электрофизиологических исследований нематоду необходимо зафиксировать клеем. Для этой цели требуется аппликатор для клея.

Аппликатор для клея представляет собой пластиковую трубку длиной 2 мм с внутренним диаметром 1 мм. Один конец трубки удерживают во рту; он может быть оснащен мундштуком, а в другой конец трубки вставляется пипетка диаметром 1 мм, заполненная клеем.

При препарировании также используется специализированная экстракционная пипетка. Она состоит из трубки и пипетки, аналогично аппликатору для клея, за исключением того, что кончик пипетки слегка надломлен, чтобы в него могли поместиться яйца и внутренние органы. Начните с того, что проведите восковую линию по периметру камеры.

Теперь нажмите и поместите покровное стекло, покрытое Sylgard, стороной с Sylgard вверх. Восковая линия фиксирует покровное стекло и предотвращает просачивание регистрирующего раствора под него, что исключает смещение стекла во время диссекции и записи. Затем камеру заполняют внеклеточным регистрирующим раствором. Состав раствора указан в сопроводительном тексте; камера готова.

С помощью нематодной иглы перенесите несколько нематод в раствор. При наличии опыта плавающих нематод можно зафиксировать клеем без дополнительных процедур по ограничению их движения. Для работы с клеем наполните контейнер, изготовленный из крышки для ПЦР-пробирок и закрепленный в воске или модельном пластилине, рабочим запасом акрилового клея Sano.

Завершите сборку аппликатора для клея, прикрепив записывающую пипетку к концу аппликатора. Затем под диссекционным микроскопом заполните аппликатор, втягивая клей ртом. Нанесение клея на нематоду представляет собой сложную задачу и требует практики, так как клей полимеризуется при контакте с внеклеточным регистрирующим раствором.

Чтобы избежать этого, поддерживайте постоянный наружный поток клея, иначе он затвердеет и закупорит пипетку. Если пипетка забилась, ее иногда можно прочистить, осторожно постучав наконечником по покровному стеклу. Потренируйтесь в работе с клеем.

Когда вы сможете написать свое имя клеем на силиконовой прокладке, вы, вероятно, будете готовы к приклеиванию кутикулы нематоды. Во-первых, выберите особь ближе к центру камеры, где достаточно места для работы. Во-вторых, нанесите небольшое количество клея либо на голову, либо на хвост нематоды и быстрым движением прижмите нематоду к поверхности силиконовой прокладки.

Затем нанесите струю клея вдоль дорсального края кутикулы нематоды. Это заставит нематоду принять C-образную форму, при которой вульва будет обращена внутрь. Любые разрывы в линии клея следует заполнить для обеспечения максимальной адгезии нематоды к Sylgard.

Это сложный процесс, и для тренировки может быть полезно использовать мутантов с пониженной подвижностью. Например, как на 31, прямо здесь, чуть правее, видна луковица. Теперь я перемещу препарат по кругу, затем введу стеклянную иглу и начну делать разрез. Чтобы сделать разрез кутикулы, переключитесь на ручную диссекционную пипетку.

Эта пипетка должна быть более острой, чем пипетки для записи при склеивании, и иметь короткий прочный стержень для использования при максимальном увеличении. Под dissecting scope расположите пипетку параллельно продольной оси нематоды и введите кончик рядом с вульвой в месте интерфейса кутикулы и клея. Этот разрез сбрасывает гидростатическое давление нематоды, в результате чего яйца и кишечник выходят через точку разреза.

Продолжайте надрезать кутикулу в направлении головы нематоды режущим движением, напоминающим вскрытие конверта, пока не достигнете фаринкса. Теперь перейдите на экстракционную пипетку, чтобы удалить внутренние органы нематоды с помощью вакуума. После очистки разреза вскрытая кутикула сохранит свою цилиндрическую форму.

Затем возьмите новую склеивающую пипетку. С ее помощью точечно приклейте кутикулу по краю разреза к поверхности Sylgard. На этом этапе важно использовать минимальное количество капель клея, чтобы избежать повреждения или перекрытия njs.

Теперь открыты брюшной нервный шнур и мышцы стенки тела, однако необходимо удалить базальную мембрану, покрывающую НМС. Для этого удалите экстрацеллюлярный регистрирующий раствор из камеры и нанесите экстрацеллюлярный регистрирующий раствор с коллагеназой в концентрации 0.4 mg/mL. Через 10–20 секунд удалите коллагеназу и несколько раз промойте препарат свежим регистрирующим раствором.

Теперь нематода готова к электрофизиологической регистрации. В позиции НМС, используя объектив с 10-кратным увеличением на предметном столике вертикального микроскопа, центрируйте нематоду в регистрирующей камере, затем переключитесь на объектив для иммерсии в воду с 40-кратным увеличением и дифференциально-интерференционным контрастом (DIC), чтобы убедиться в целостности мышц стенки тела и нервного ствола. Расположите нематоду горизонтально, чтобы электроды можно было ввести как с левой, так и с правой стороны.

Обычно мы устанавливаем патч-зажим на вентральную медиальную часть тела в области мышц, расположенных внутри вульвы, однако патч-зажим можно легко установить и на мышцы как дорсальной, так и вентральной стороны червя. Для этого выберите несколько нейронов, которые выглядят как полукруг, прилегающий к мышце. Теперь установите патч-зажим на мышцу, используя стандартные методы патч-клампинга для получения гигаомного контакта (gig seal). По нашему опыну, для записи в режиме voltage clamp при конфигурации whole-cell хорошо подходят регистрирующие электроды с сопротивлением около 4 МОм.

Увеличьте силу всасывания и воздействуйте на мембрану разрядом до разрыва гиго-печати. Мы говорили о достижении сопротивления в 4 МΩ. Если посмотреть туда, да, там указано 4,9 МΩ.

Он больше, это нормально. Он находится в пределах используемого нами диапазона. Хорошо. Да. Теперь мы попытаемся масштабировать это, чтобы понять, к чему это приведет.

Что? Мы хотим, чтобы это спустилось до самого низа. Да. Понятно. Ура.

При качественной записи емкость клеточной мембраны мышц стенки тела взрослых нематод дикого типа обычно составляет приблизительно 70 пФ; стабильная запись возможна в течение как минимум 10 минут при удерживающем потенциале -60 мВ с минимальными удерживающими токами, около 50 пА. После того как была установлена заплатка с мышечной клеткой, измеримые ответы могут быть вызваны стимуляцией с помощью второго электрода, светоактивируемого канала, Rodin или добавлением гиперосмотического раствора. Чтобы вызвать электрически индуцированный ответ, мы обычно помещаем стимулирующий электрод, содержащий внеклеточный раствор, на вентральный нервный шнур внутри относительно запатченной мышцы.

Данная конфигурация с неплотным прилеганием электрода (loose patch) требует импульсов тока длительностью от одного до двух миллисекунд при напряжении от 10 до 40 вольт. К сожалению, после нескольких вызванных ответов нервный ствол подвергается необратимому повреждению, и по неизвестным причинам при использовании этой конфигурации можно вызвать только холинергические ответы. В качестве альтернативы для стимуляции выброса нейромедиатора можно использовать нематод, экспрессирующих светоактивируемый канал, где трансген dosin встроен в различные популяции нейронов.

При подготовке к данному методу следует учитывать, что нематоды, используемые в этой работе, должны быть выращены на бактериях, обогащенных ретинолом. В данной методике используется мощный светодиод с длиной волны 470 нм, пропущенный через возбуждающий фильтр GFP (450–490 нм), для многократной активации канального опсина, что вызывает индуцированный выброс различных нейромедиаторов в зависимости от того, какие типы клеток экспрессируют данный канал. Последний рассматриваемый метод может быть использован для измерения размера readily releasable pool (легко высвобождаемого пула) синаптических везикул нескольких нейронов, иннервирующих регистрируемую мышцу.

Это достигается путем подачи короткого импульса давления гиперосмотического внеклеточного раствора на патч-зафиксированную мышцу в течение одной-трех секунд. Результатом будет серия асинхронных постсинаптических событий. Представлены записи потенциалов мышц стенки тела в режиме фиксации напряжения всей клетки для каждого из трех описанных выше протоколов стимуляции: электрически вызванных, световых и гиперосмотических ответов.

Во всех случаях мышца вентральной медиальной стенки тела фиксируется при потенциале -60 millivolts. Клетки мышц дикого типа обычно характеризуются высокой частотой эндогенных входящих миниатюрных синаптических токов. В наших стандартных регистрирующих растворах деполяризация переднего вентрального нервного шнура продолжительностью 2 millisecond вызывает синхронный выброс из нескольких синапсов, что приводит к сильному вызванному ответу амплитудой около 2–2.5 nano amps.

У червей дикого типа репрезентативные кривые справа от кривых дикого типа на рисунках A и B демонстрируют синаптический выброс у мутанта с тяжелым нарушением координации на рисунке C показан ответ, вызванный светом, в нервно-мышечном соединении червя дикого типа, экспрессирующего channel red dosin. В холинергических нейронах световой импульс длительностью 2 ms обычно вызывает ответ от 1.5 до 1.8 nA. Применение метода пьезодиспенсирования 850 mOsm гиперосмотического физраствора на мышцу в течение 1 s вызывает асинхронный шквал миниатюрных синаптических токов, представляющих readily releasable pool везикул.

Я только что продемонстрировал технику диссекции, которую мы используем для обнажения нервно-мышечных соединений sea elegance и проведения электрофизиологических записей. Важно помнить, что эта методика сложна и ее освоение, скорее всего, займет у вас несколько месяцев. Однако, однажды овладев этим навыком, вы будете выполнять его автоматически.

Эти методы останутся в вашем арсенале, и чем чаще вы будете их применять, тем быстрее и надежнее станет процесс подготовки. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.