Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола
13 марта 2009 г.
Простой, недорогой и эффективный способ получения эмбрионов дрозофилы для живого изображения анализ. Наш протокол обеспечивает влажность и газовый обмен и не сжимает эмбриона дрозофилы. Этот метод подходит для GFP основе живого изображения эмбрионов дрозофилы использованием стереомикроскопа или прямого микроскопа соединения.
Здравствуйте. Меня зовут Брюс Рид. Я доцент кафедры биологии Университета Ватерлоо в Ватерлоо, провинция Онтарио, Канада. Сегодня мы создаем этот видеоархив, чтобы описать новую методику, которую мы разработали для подготовки эмбрионов *S. pombe* к анализу методом живой визуализации.
При проведении анализа живых изображений эмбрионов дрозофилы мы часто используем таймлапс-съемку, которая может длиться несколько часов. Поэтому важно использовать метод, при котором эмбрионы защищены как от дегидратации, так и от гипоксии. Кроме того, мы стремимся разработать методику, которая позволила бы избежать любого сжатия эмбриона.
Для монтажа мы разработали очень простой, дешевый и эффективный метод, который мы называем методом «висячей капли». Подготовка по методу «висячей капли» подходит для анализа живых эмбрионов с помощью стереомикроскопии или любого вертикального сложного микроскопа. В этом таймлапс-видео показаны восемь экспрессирующих GFP эмбрионов, подготовленных по протоколу «висячей капли» и визуализированных с помощью таймлапс-флуоресцентной микроскопии.
Данная последовательность изображений охватывает более четырех часов прошедшего времени. Начало движения свидетельствует о жизнеспособности этих эмбрионов. Теперь мы представим вам подробное пошаговое описание того, как выполнить протокол метода висячей капли.
Эмбрионы собирают со стандартных чашек с виноградным соком или яичной средой. С помощью автоматического сборщика яиц dsof FLA от Fly max scientific equipment обеспечивается синхронный сбор эмбрионов на заранее определенной стадии развития. Для подготовки к ручному распределению эмбрионов на предметное стекло приклеивают кусочек двустороннего скотча, после чего снимают с него защитный слой.
Протокол метода «висячей капли» требует использования специальной камеры, изготовленной из листа поликарбоната толщиной 5 mm. Лист вырезается по размеру предметного стекла, после чего с помощью ротора в нем создается углубление глубиной 3 mm. Увлажнение камеры для прижизненной визуализации обеспечивается с помощью кусочка салфетки, вырезанного по размеру лунки камеры и смоченного дистиллированной водой.
Масло Halo Carbon идеально подходит для прижизненной визуализации эмбрионов Drosophila, так как оно газопроницаемо и оптически прозрачно. Смешивание масел Halo Carbon серии 700 и серии 56 в соотношении один к одному обеспечивает вязкость, подходящую для работы с эмбрионами Drosophila. Эмбрионы можно собирать с агариковых чашек с виноградным соком с помощью ювелирного пинцета или очень тонкой кисти.
Эмбрионы слипаются друг с другом и прилипают к кончикам пинцета. Они легко собираются в группы, в скопления эмбрионов, прилипая к пинцету.
Кончики пипеток осторожно опускают на липкую поверхность ленты на предварительно подготовленном предметном стекле для декорирования. Наблюдая за эмбрионами через стереомикроскоп, осторожно подталкивайте или поглаживайте их боковой стороной пинцета. Необходимо вскрыть хорион, не повредив внутреннюю вителлиновую мембрану.
Это требует твердой руки, терпения и определенной практики. После разрыва внешней оболочки (corone) дехлорированный эмбрион имеет тенденцию прилипать к пинцету. Будьте осторожны, чтобы дехлорированный эмбрион не соприкасался с липкой поверхностью ленты.
Извлечь эмбрионы с ленты может быть довольно сложно, поэтому дехлорированные эмбрионы быстро переносят в каплю галокарбонового масла на покровном стекле. Рекомендуется держать ее поблизости. Перенос осуществляется путем прикосновения кончиком пинцета к поверхности капли галокарбонового масла.
Перед переносом следующего эмбриона следует убедиться, что эмбрион переместился с пинцета в каплю масла; это можно сделать невооруженным глазом, используя черный фон и волоконно-оптический источник света, установленный под наклоном. Рекомендуется удалять масло с кончиков пинцета из-за его плавучести в перфторподобном масле. Координированные эмбрионы плавают на поверхности масляной капли.
В протоколе с висячей каплей мы можем контролировать положение и ориентацию эмбрионов, прижимая их к дну масляной капли и быстро переворачивая покровное стекло. Мы переворачиваем покровное стекло над увлажненной лункой камеры для визуализации живых объектов. После переворота стекла эмбрионы окажутся прижатыми к его нижней стороне.
Положение эмбрионов в состоянии покоя можно проверить с помощью стереомикроскопа. При неудовлетворительном результате процедуру можно повторить. Как только эмбрионы примут нужное положение, покровное стекло закрепляют на камере для живой визуализации с помощью клейкой ленты.
Камера вентилируется путем прорезания отверстий в ленте. Теперь эмбрионы готовы к визуализации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой и эффективный метод подготовки эмбрионов Drosophila для анализа методом прижизненной визуализации. Протокол обеспечивает надлежащую влажность и газообмен, предотвращая при этом сжатие эмбрионов, что делает его подходящим для визуализации с использованием GFP.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Методы визуализации
Теоретическая часть
- Анализ живых изображений эмбрионов Drosophila обычно проводят с использованием таймлапс-съемки.
- Эмбрионы подвержены дегидратации и гипоксии во время длительных сеансов визуализации.
- Для получения точных изображений необходим метод, исключающий сжатие эмбрионов.
- Визуализация на основе GFP требует соблюдения определенных условий для достижения оптимальных результатов.
Цель исследования
- Разработать метод защиты эмбрионов Drosophila от обезвоживания.
- Обеспечить адекватный газообмен во время визуализации.
- Избежать сжатия эмбрионов при прижизненной визуализации.
Используемые методы
- Подготовка эмбрионов Drosophila для прижизненной визуализации.
- Обеспечение контроля влажности во время сеансов визуализации.
- Использование стереомикроскопа или вертикального сложного микроскопа для визуализации.
- Применение методов визуализации на основе GFP.
Основные результаты
- Данный метод эффективно поддерживает влажность и газообмен для эмбрионов.
- Эмбрионы не подвергаются сжатию, что обеспечивает более высокое качество визуализации.
- Визуализация на основе GFP дает четкие результаты в течение длительного времени.
- Метод прост в исполнении и экономически выгоден для исследователей.
Выводы
- Данный метод повышает качество прижизненной визуализации эмбрионов Drosophila.
- Он представляет собой надежный подход для исследователей в данной области.
- Протокол может быть легко адаптирован для использования в различных лабораторных условиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Визуализация модельных организмов в реальном времени имеет критическое значение для валидации мишеней и фенотипического скрининга на ранних этапах поиска. Протокол с использованием висячей капли устраняет основные проблемы, такие как дегидратация, гипоксия и механическое сжатие, которые снижают жизнеспособность эмбрионов и качество данных при длительной таймлапс-съемке. Обеспечивая физиологически релевантную визуализацию эмбрионов Drosophila без сжатия, данный метод позволяет масштабируемо и экономически эффективно снизить риски при изучении механизмов генетических и фармакологических воздействий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать генетическую регуляцию в динамических процессах, таких как морфогенез тканей и клеточная адгезия, без возникновения механических артефактов, вызванных компрессией.
- Операционная ценность: обеспечивает жизнеспособность эмбриона более четырех часов, что позволяет проводить лонгитюдное наблюдение за функцией генов и динамикой сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: снижает количество ложноположительных результатов, обусловленных фенотипами, вызванными стрессом, что повышает достоверность анализов по валидации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для живой визуализации на основе GFP, которая сводит к минимуму влияние переменных факторов окружающей среды.
- Практическая ценность: использует недорогие и доступные материалы (галоуглеродное масло, поликарбонатная камера, клейкая лента), подходящие для адаптации под высокопроизводительный анализ.
- Готовность метода: использует плавучесть эмбрионов в масле для поддержания позиционной стабильности, что уменьшает дрейф и повышает согласованность сигнала при таймлапс-съемке.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает возможность визуализации консервативных процессов развития, имеющих значение для моделей заболеваний человека, что облегчает экстраполяцию данных между видами.
- Механистическое снижение рисков: позволяет наблюдать за поведением клеток (например, гибелью или адгезией клеток) в физиологических условиях, повышая прогностическую достоверность для последующих доклинических моделей.
- Система, релевантная для изучения заболеваний: эмбрионы Drosophila, экспрессирующие связанные с заболеваниями GFP-репортеры, могут быть использованы для мониторинга модуляции сигнальных путей in vivo.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Протокол метода «висячей капли» применим на различных этапах процесса разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, особенно для анализов, требующих динамической визуализации генетически кодируемых репортеров без сжатия образца.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез, обеспечивая прямую визуализацию эффектов нокдауна или гиперэкспрессии генов при эмбриональном морфогенезе.
- Скрининг: обеспечивает количественные, разнесенные во времени данные флуоресценции, необходимые для сравнения эффектов соединений или генетических условий.
- Аналитика: позволяет получать стабильные высококачественные данные таймлапс-съемки, подходящие для морфометрического анализа и количественной оценки фенотипа.
- Трансляционные исследования: связывают генетические открытия у Drosophila с консервативными путями, что помогает при выборе мишеней для моделей позвоночных.
- Корпоративное использование: простота и низкая стоимость протокола позволяют широко внедрить его в различных группах в качестве стандартизированного метода подготовки к визуализации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет устранения артефактов компрессии и поддержания физиологических условий во время визуализации.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированному контролю влажности, газообмену и правильному обращению с эмбрионами.
- Стратегическая ценность: Снижает уровень биологического шума в кампаниях по скринингу, что повышает чувствительность анализа и снижает частоту ложноположительных результатов.
- Влияние на портфель: Позволяет принимать более надежные решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при валидации мишеней за счет получения более точных фенотипических данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с эмбрионами Drosophila и навыки дехорионизации.
- Необходим доступ к галокарбоновым маслам и базовым инструментам микрофабрикации для подготовки камеры.
- Требуется стандартизация возраста эмбрионов, генотипа и единообразие способов их закрепления для всех пользователей.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации плавучести в масле и геометрии камеры.
- Практическое ограничение: метод лучше всего подходит для эмбрионов, сохраняющих плавучесть в галокарбоновом масле; не применим к более плотным или адгезивным типам клеток.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
