Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.
2 марта 2009 г.
GFP-синтез белков широко используется для визуализации органелл с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, скрининг на мутации, которые влияют на морфологию органелл как правило, требует отдельного мутагенеза и занимает много времени. Здесь мы демонстрируем метод одновременно включить органелл-GFP маркеров в почти 5000 несущественные генов у дрожжей.
Данная процедура начинается с подготовки массива CP one GFP: сначала выращивают линию клеток, а затем переносят массив на свежую чашку с помощью штампа. Одновременно с этим готовят свежую копию DMA. Далее массив ACP one GFP скрещивают с DMA и отбирают диплоиды, которые затем подвергают споруляции на среде для споруляции.
Спустя пять дней потомство Myotic проращивают на среде LRK, на которой растут только гаплоиды MAT A. После двух дополнительных раундов селекции мы выделяем гаплоидные клетки, несущие как ACP one GFP, так и ген с нокаутом по канамицину. Наконец, можно отобрать отдельные штаммы непосредственно с чашки и изучить морфологию митохондрий с помощью конфокальной микроскопии.
Здравствуйте, я Чеп Т. из лаборатории Лоу кафедры клеточной и биологии развития Института наук о жизни Университета Британской Колумбии. Здравствуйте, я Джесси Чао, также из лаборатории Лоу. Сегодня мы продемонстрируем вам высокопроизводительный метод введения GFP-маркеров в различные мутантные штаммы дрожжей с использованием роботизированной системы.
В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения морфологии таких органелл, как D, эндоплазматический ретикулум и митохондрии. Итак, приступим. Для этого протокола мы используем два различных штамма дрожжей.
Штамм CP one GFP представляет собой линию с C-концевым GFP-меченым белком ACP one, полученную методом гомологичной рекомбинации с помощью ПЦР с использованием плазмиды PKT 1 28. Фоновым штаммом является BY 7 0 4 3. Мы также используем штамм DMA или массив делеционных мутантов, который представляет собой коллекцию примерно 5 000 делеционных мутантов по неessential-генам.
Все эти второстепенные гены были нокаутированы в штамме G four 18. Фоновым штаммом массива является BY 47 41. Для начала выращивания газона клеток ACP one GFP вылейте 5 mL ночной культуры ACP one GFP на чашку с гистидиновой средой.
Дайте планшету достаточно просохнуть с помощью пламени или в биологическом вытяжном шкафу. После высыхания инкубируйте планшет при 30 °C в течение ночи. После инкубации с помощью робота распределите штамм A CP one GFP, формируя по 1 536 колоний на планшет.
Одновременно с этим подготовьте свежую копию DMA методом репликации на четыре чашки с YPDG. Затем инкубируйте чашки при 30 °C в течение ночи до нароста штаммов. Создайте штамм A CP one GFP с помощью DMA методом репликации с последующим overlaying колоний на чашки YPD, инкубируйте чашки при 30 °C в течение ночи.
После инкубации репликационного планшета колонии на средах SD hiss G four 18 переносят на новые чашки для отбора развернутых клеток, которые затем инкубируют при 30 °C в течение ночи. Чтобы инициировать споруляцию и прорастание, сначала проводят репликацию диплоидов на чашки YPDG four 18 для повышения эффективности споруляции на следующем этапе. После инкубации при 30 °C в течение одного дня диплоиды переносят методом репликации на среду для усиленной споруляции, содержащую пониженные уровни источников углерода и азота, для индуцирования образования мейотических спор.
Затем инкубируйте планшеты при 25 °C минимум в течение пяти дней. После инкубации инициируйте прорастание мата, мейотического потомства, путем репликационного переноса колоний на среду LRK. Эта среда индуцирует прорастание гаплоидных клеток из спор; инкубируйте планшеты при 30 °C в течение двух дней, чтобы отобрать клетки, несущие как аллель GFP, так и единственную мутантную аллель.
Клетки Matt A переносят методом репликационного посева на среду lade G four 18, которая позволяет отбирать гаплоидные клетки с делецией гена; эти планшеты инкубируют при 30 °C в течение ночи. Затем миотическое потомство Matt переносят методом репликационного посева на среду L-H-R-K-G four 18 для отбора одиночных мутантов, которые также содержат ACP one GFP; инкубируют в течение ночи при 30 °C.
Затем планшеты можно хранить при температуре 4 °C в течение трех месяцев. Чтобы визуализировать нужные мутанты, экспрессирующие CP one GFP, непосредственно с планшета, начните с отбора соответствующих колоний с планшетов. Культивируйте клетки при 30 °C на среде YPD или SD hiss до ранней логарифмической фазы.
Наконец, визуализируйте мутантов с помощью конфокальной микроскопии с набором фильтров GFP; на данном конфокальном изображении мутант и дикий тип с маркером ACP one GFP были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии для изучения морфологии митохондрий. Данный конкретный мутант демонстрирует нарушенный фенотип митохондрий и, следовательно, является подходящим кандидатом для дальнейшего исследования. Мы продемонстрировали вам, как эффективно внедрить мультиклональный маркер CP one GFP в массив делеционных мутантов с использованием роботизированной системы.
При выполнении данной процедуры важно приготовить свежие среды и дать планшетам достаточно времени для высыхания. При избыточной влажности будет скапливаться конденсат, что повысит риск контаминации. Также следует дважды проверить правильность приготовления всех селективных сред, так как они имеют критическое значение для данного протокола.
Данную процедуру также можно использовать для других типов маркеров. Например, для визуализации эР мы регулярно используем маркеры air 11 и GSP. На этом все.
Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод встраивания GFP-маркеров органелл в почти 5 000 неessential-генов дрожжей, что упрощает процесс визуализации морфологии органелл. Используя этот подход, исследователи могут эффективно проводить скрининг мутаций, влияющих на структуру органелл.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Генетика
Теоретические основы
- Белки с GFP-слиянием являются незаменимыми инструментами для визуализации клеточных структур.
- Традиционные методы скрининга мутаций трудоемки.
- Дрожжи служат модельным организмом для генетических исследований.
- Конфокальная микроскопия позволяет получать детальные изображения органелл.
Цель исследования
- Разработать метод одновременного введения маркеров органелл.
- Облегчить скрининг мутаций, влияющих на морфологию органелл.
- Повысить эффективность генетических исследований на дрожжах.
Используемые методы
- Подготовка массива CP one GFP из культивируемых клеток.
- Скрещивание массива GFP с DMA для селекции диплоидов.
- Споруляция диплоидов на специфических средах.
- Наблюдение за морфологией митохондрий с помощью конфокальной микроскопии.
Основные результаты
- Успешное встраивание GFP-маркеров органелл в гены дрожжей.
- Эффективное выделение гаплоидных клеток с искомыми генетическими модификациями.
- Визуализация морфологии органелл с помощью конфокальной микроскопии.
- Оптимизированный процесс скрининга генетических мутаций.
Выводы
- Данный метод значительно сокращает время, необходимое для генетического скрининга.
- Он обеспечивает надежную основу для изучения функций органелл.
- Этот подход может быть применен в различных генетических исследованиях дрожжей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный высокопроизводительный метод анализа морфологии органелл дрожжей позволяет систематически исследовать функции генов в биогенезе органелл, что способствует валидации мишеней на ранних этапах поиска. Благодаря интеграции роботизированной обработки массивов с селекцией по двум маркерам, метод предоставляет масштабируемые и воспроизводимые фенотипические данные для механистического снижения рисков при анализе генетических хитов. Этот подход ускоряет картирование путей и приоритизацию мишеней, влияющих на функцию митохондрий или ЭП, в рамках доклинических программ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет провести полногеномную оценку влияния делеций генов на морфологию митохондрий для валидации мишеней, участвующих в наследовании органелл.
- Практическая ценность: использование роботизированного пиннинга позволяет эффективно обрабатывать 4 672 мутанта, сокращая объем ручного труда и увеличивая пропускную способность.
- Прогностическая ценность: идентификация генетических модификаторов структуры органелл для снижения рисков при выборе мишеней на ранних этапах процесса поиска.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели морфологии органелл с помощью конфокальной микроскопии для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Позволяет создавать гомозиготные делеционные штаммы с интегрированными GFP-маркерами, что обеспечивает стабильную экспрессию репортера во всем массиве.
- Готовность к анализу: Предоставляет массивы гаплоидных мутантов, готовых для скрининга соединений или картирования генетических взаимодействий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает фенотипы органелл дрожжей с консервативными путями, имеющими значение для моделей заболеваний человека.
- Механистическое снижение рисков: Проясняет функцию генов в биогенезе органелл для обоснования выбора мишеней для доклинической валидации.
- Выяснение сигнальных путей: Картирует генетические сети, управляющие динамикой митохондрий, для проведения скрининга соединений на основе механизмов действия.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод применим на этапе от ранних этапов поиска до идентификации соединений-лидеров, так как он предоставляет данные о морфологии органелл, что позволяет подтвердить уверенность в выборе мишени и значимость сигнального пути перед началом скрининга соединений.
- Открывательная биология: Обеспечивает проверку гипотез о функции генов в формировании органелл посредством систематического морфологического профилирования.
- Скрининг: Позволяет проводить воспроизводимую визуализацию органелл на массивах для высокопродуктивного скрининга генетических или химических воздействий.
- Аналитика: Предоставляет данные фенотипического анализа на основе визуализации, позволяющие сравнивать мутантные состояния с контрольными образцами дикого типа.
- Трансляционные исследования: Связывает дефекты органелл дрожжей с консервативными клеточными процессами, которые могут быть значимы для доклинических моделей заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для общеорганеллярного фенотипического скрининга с использованием множества маркеров с GFP-меткой.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней путем масштабируемой связи генотипа с фенотипом органелл.
- Операционная ценность: Гарантирует воспроизводимость за счет стандартизированной роботизированной обработки и рабочего процесса с двойным отбором.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить параллельную оценку тысяч генетических фонов.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе фенотипов морфологии органелл.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области генетики дрожжей, спаривания, споруляции и флуоресцентной микроскопии.
- Используются роботизированные системы переноса (пиннирования) и контролируемые условия инкубации для работы с массивами.
- Необходимы стандартизированные протоколы приготовления сред и селекции для предотвращения контаминации и обеспечения восстановления мутантов.
- При применении метода к различным маркерам органелл (например, ЭПР или митохондриям) требуются соответствующие корректировки.
- Метод ограничен штаммами с неэссенциальными генами; для эссенциальных генов требуются альтернативные подходы, такие как использование условных аллелей или CRISPRi.
